1、第六章 中药的一般毒性作用,毒性作用,特殊毒性：致畸、致突变、致癌,基础毒性：急性毒性、长期毒性等,均是安全性评价的重要组成部分,第一节 急性毒性与急性毒性试验,意义：毒理学研究中最基础的工作了解中药对机体产生急性毒性的主要依据安全性评价的第一步工作在不同的化学品的法规程序中通常是必做试验,一、急性毒性(acute toxicity)的概念急性毒性是指实验动物一次或24小时内多次接触某一中药后，在短期内所产生的毒性作用及死亡。“一次”：对经口、注射途径给药是指瞬间给予动物给药，在经呼吸道或皮肤给药时，指一段规定时间内使实验动物持续接触中药的过程。“多次”：指当中药毒性很低时，一次给予最大给药容
2、量仍不能充分了解该中药急性毒性作用，需要24小时内多次给药。国内多数规范规定24小时内一般不超过3次。,二、急性毒性试验的目的1、通过测定以LD50为主的相关参数，评价中药对机体急性毒性的大小，并根据LD50值进行急性毒性分级。2、通过观察动物中毒表现，毒作用强度和死亡情况，初步评价中药对机体的毒效应特征、靶器官、剂量-反应(效应)关系和对人体产生损害的危险性。3、为后续重复剂量、亚慢性和慢性毒性研究以及其它毒理试验提供接触剂量设计和观察指标选择依据。4、为毒理学机制研究研究提供初步线索。,三、急性毒性试验的主要毒性参数(一)上限参数，以死亡为终点：1、绝对致死剂量或浓度(LD100或LC10
3、0)2、半数致死剂量或浓度(LD50或LC50)3、最小致死剂量或浓度(MLD、LD01或LC01)4、最大非致死剂量或浓度(MNLD、LD0或LC0)(二)下限参数，以非致死性急性毒作用为终点：1、急性毒性LOAEL(观察到有害作用最低剂量)2、急性毒性NOAEL,四、急性毒性试验要点中药种类不同，急性毒性试验的程序和要求有所不同。但总体原则和要点相似。常用给药途径：经口、经呼吸道、经皮、注射(一)经典的急性(致死)毒性试验1、实验动物的选择和处置种类：啮齿类：一般为大、小鼠，大鼠为首选 非啮齿类：犬(Beagle犬)体重：变异不超过平均体重的20% 大鼠180240g，小鼠1825g， 兔
4、22.5kg，犬1015kg，豚鼠200250g,数量及性别： 啮齿类：每个剂量组每种性别至少5只 非啮齿类：雌雄兼用，每组同一性别动物数应相等 雌性应为未孕和未产过仔 雌雄分笼饲养适应期： 必须有57天适应期，剔除异常动物禁食： 经口给药，要求试验前对动物禁食 大鼠过夜禁食，小鼠禁食4小时，大动物在每日上午喂食前给予受试物。给药后继续禁食34小时,2、实验设计剂量：急性毒性试验是否成功的基础了解受试物结构式、分子量、常温常压下状态、生产批号、纯度、杂质与含量、溶解度、PH等根据受试物有关测试规范要求中药成分根据与其化学结构和理化性质相似化合物毒性资料作参考以较大间隔(按几何级数)给药，找出1
5、0%90%(或0%100%)的致死剂量范围在这个剂量范围内以合适的间距设若干剂量组，至少3组(一般57组)，以产生一系列毒效应和死亡率不同急性毒性试验方法，对剂量设计和动物数要求不同可不设阴性对照组,观察：一般观察14天，也可根据毒性反应、症状发生的速度和恢复期长短而定，有必要时可延长。每天观察至少一次，并作详细、系统记录观察中毒体征：皮肤、被毛、眼睛和黏膜改变、呼吸、循环、自主和中枢神经系统、四肢活动和行为方式的变化记录发生每种体征的时间、表现程度、发展过程及死亡前特征和死亡时间于给药前、给药后每周(每天)和死亡时测定体重所有动物均应进行大体尸体解剖，记录观察到的全部病变，包括各器官有无充血
6、、出血、水肿或其它改变，必要时作病理组织学检查(存活24小时以上动物)。,LD50计算LD50是一个统计量，可报告其95%可信限计算方法：概率单位图解法 Bliss法(较精确，新药指南推荐) 改良寇氏法 霍恩法(查表，精确度差),五、经典急性致死性毒性试验的局限性LD50意义(OECD，1987)：1、标准化药物毒性强度，评价药物对机体毒性的大小，比较不同药物毒性的大小；2、计算药物的治疗指数，药效学剂量和毒性剂量的距离；3、为后续的重复毒理学试验剂量的选择提供参考；4、通过比较不同途径的LD50值，获得生物利用度信息；5、试验结果可用来推测人类的致死剂量以及中毒后体征，为临床毒副反应监测提供
7、参考。,局限性：1、对于上述大多数目的，LD50值不能给予有效的信息，其可用性十分有限。a、LD50值不能等同于急性毒性，死亡仅仅是评价急性毒性的许多观察终点之一。b、单次大剂量中毒，动物多死于CNS及心血管功能障碍，并不能很好显示出各自的毒作用特征。c、由于死亡迅速，各种器质性变化尚未发展，不能显示靶器官的病变。d、对亚急性毒性剂量的选择，可用简单的使用很少动物重复试验代替，且能提供更多有用信息。2、 LD50没有稳定的数值,3、由于急性毒性剂量与临床人用剂量相差很大，不能期望用急性毒性试验结果来拟定人的临床用量。4、人和动物的敏感性相差很大。对于急救医生和中毒控制中心，LD50试验的结果对
8、于医学诊断和治疗意义不大。5、消耗动物多，受到广泛的伦理学和科学批评。6、对于开发新药，没有必要求出精确的LD50值，所要关注的是动物出现毒性和剂量间的量效关系。,表 急性毒性危害类别和急性毒性估计值（LD50或LC50值）,GSH第3部分健康危害：关于急性毒性危险类别和标签要素，2003,表 中国食品毒理急性毒性分级法(1994),七、急性毒性替代试验,第二节 局部刺激试验-眼刺激试验、皮肤刺激试验和皮肤致敏试验,Local irritation test：目的：了解中药对皮肤、眼睛的局部刺激性和腐蚀性 了解中药对哺乳动物是否可以引起皮肤变态反应及其程度内容：眼刺激、皮肤刺激试验规定：外用、
9、局部用药和消毒剂均需做,一、眼刺激试验,眼原发性刺激试验(eye primary irritayion test)观察终点为眼刺激和眼腐蚀。眼刺激性(eye irritayion)：眼睛前表面接触受试物后产生的眼睛可逆性炎症变化眼腐蚀性(eye corrosion)眼睛前表面接触受试物后产生的眼睛不可逆性组织损伤对皮肤产生刺激的强酸和强碱性物质可免做眼刺激试验对pH接近中性的大部分中药，其对皮肤和眼的刺激性反应结果不一定有关系，应单独进行眼刺激试验,Draize试验：方法：家兔4只，每兔一只眼滴入0.1ml受试物，另一只作为对照。滴入后可不冲洗，也可在滴入后不同时间(如4或30秒)冲洗。于滴眼
10、24、48、72小时和4、7天时(必要时延长到21天)，以肉眼或用手提式裂隙灯检查后眼的反应。观察：结膜(发红、球结膜水肿和分泌物) 角膜(混浊程度和范围) 虹膜(充血、肿胀和角膜周围充血)标准：按规定分级标准评分,评价：结果以主观判断为主，不同实验室间有差异。可将反应情况拍成彩照，以统一。 尽管结果有差异，但经证实兔试验在检测人的眼睛刺激性方面有效。 某些情况下家兔出现的刺激性反应大于人,二、皮肤刺激试验(skin primary irritation test),内容：单次和多次皮肤刺激试验，完整皮肤和破损皮肤试验观察终点：皮肤刺激性和腐蚀性皮肤激性(dermal irritation)：
11、皮肤接触受试物后产生的局部可逆性的炎症变化皮肤蚀性(dermal corrosion)皮肤接触受试物后产生的局部不可逆性组织损伤皮肤刺激的表现：水肿、红斑,并非所有的中药都适宜做皮肤刺激试验，可不做的3种情况为：根据结构和活性的关系及理化特性，推测可能有腐蚀性的物质(如pH2或pH11.5)；在急性经皮毒性试验显示有很强的系统毒性的物质；在急性经皮毒性试验中给药剂量达2000mgkg时仍未产生皮肤刺激体征的物质。,实验用动物：家兔、豚鼠(成年、健康、皮肤完好) 兔豚鼠大鼠人猪方法：至少4只，实验前24去除背脊柱两侧毛，范围约3cm3cm。24小时取受试物0.5ml(或0.5g)直接涂在皮肤上，
12、用纱布及玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定，敷4小时(据人使用情况，可延长到24小时)，结束后温水或无刺激性溶剂洗去残留受试物。一只动物脊柱两侧可备3个去毛区，进行剂量-反应研究，或测试多种受试物。观察：去除受试物后1、24、48小时观察涂抹部位皮肤反应，从无红斑形成至有紫红色斑并有焦痂，从无水肿至水肿隆起超过1mm，按严重程度评分。观察时间的确定以足以观察到可逆或不可逆刺激作用为准，一般不超过14天。,影响因素：1)增加皮肤吸收的因素，如皮肤的完整性；2)固态受试物的物理特性，如边缘锋利的颗粒或较硬的纤维均可对皮肤产生机械刺激和原发性刺激反应；3)固态受试物于干燥及溶解状态下试验结果
13、不同，溶解态作用增强；4)如受试物可能用于人受损皮肤，则受试动物皮肤也应作用相似的处理；5)受试物在动物皮肤表面封闭给药的严密程度；6)实验动物的年龄与受试部位，随着年龄增长，皮肤敏感度降低。一般选用动物背部皮肤(厚、不敏感)；7)性别不同，皮肤厚度及血流情况有差异；8)试验人员对判别标准的掌握。,破损皮肤制备：人为将动物皮肤擦伤，不能伤及真皮产生出血(是否必要有争议)评价：有时兔敏感性高于人，可产生假阳性 刺激性较强中药敏感性刺激性弱者 替代：2009年欧盟将禁止用动物实验评价化妆品原料或成品 鸡胚绒毛膜尿囊膜试验(HET-CAM) 鸡胚绒毛膜尿囊膜苔盼蓝染色试验(CAM-TBS) 荧光素漏
14、出试验(FLT) 人工表皮模型,三、皮肤致敏试验(skin sensitisation test),又称致敏性接触性皮炎(allergic contact dermatitis)： 一种对中药免疫介导的皮肤反应。试验类型： 福氏完全佐剂(FCA)法(提高动物的敏感性)和不加佐剂法动物：豚鼠方法：诱导接触(induced exposure)以较低或中等浓度受试物对皮肤重复给药(每天或每周45天，涂皮或皮下注射)，14天。激发阶段，间隔1014天后，用激发剂量(低于诱导剂量)处理未染过毒皮肤。观察：24、48、72小时有无皮肤反应，以反应程度评分，比较、判断。阳性药：通常需用阳性对照组，用已知抗原
15、物质2,4-二硝基氯苯(DNCB)或 对苯二胺等。,原理：中药皮肤给药产生较轻的反应或无明显反应，经过一段时间(几周，甚至几年)再次给药，可引起迟发性超敏反应(接触性皮炎)，且在最初给药部位以外的皮肤均可发生。在穿透皮肤的过程中，中药作为半抗原，与体内某些特定的载体蛋白共价结合，形成完全抗原，结合于表皮郞格罕细胞的细胞膜上或与巨噬细胞相结合，激发抗体形成及免疫记忆过程。郞格罕细胞表达免疫识别功能且在其细胞膜上有IgG和C3受体。这些细胞能吸附小分子且将它们代谢成更有活性的半抗原性产物(超敏发生的皮肤部位郞格罕细胞增加)，此后再次接触到同样或相似的中药质，也能激发超敏反应。皮肤敏反应属于型细胞介
16、导的超敏反应，由迟发性超敏反应T淋巴细胞(TD)参与，反应高峰在二次抗原接触后2448小时。,评价：1992年OECD化学品测试中，推荐使用豚鼠最大试验(GPMT)和不用佐剂的Buechler试验(BT，局部封闭敷贴法)。所有方法均不能准确预测受试物对人类的致敏性，得到的是外推的参考资料。在评价中，应先进行合并使用佐剂的试验，如呈阳性，再追加不使用佐剂的试验。,四、其他局部刺激试验,根据人实际可能接触途径，如眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、静脉、动脉、肌肉、皮下、静脉旁和鞘内等非口服途径给药，观察用药局部产生的毒性都应进行局部刺激性试验。 鼻黏膜、上呼吸道黏膜、直肠和阴道黏
17、膜等试验，一般选用每组家兔34只或豚鼠、大鼠56只，设给药组、阴性(溶剂或赋型剂)对照组及未处理组，通过上述途径给药至少4小时，24小时后处死动物，取出欲检测的黏膜组织，观察有无充血、红肿现象，评价方法与皮肤刺激试验相同，还可观察分泌物。若有变化，需进行组织病理学检查，然后比较分析。,第三节 长期毒性试验,一、长期毒性试验的概念和目的急性毒性试验主要研究中药急性毒性的特征和上限参数，而人类接触中药往往是长期反复的接触，因此利用急性毒性试验难以预测慢性毒性。原因：长期重复给药时可产生与急性毒性试验完全不同的毒作用；随着年龄的增长动物机体的健康和组织易感性不一样。,发生长期毒性作用的基础是蓄积作用
18、吸收速度代谢转化和排泄accumulation物质蓄积(material accumulation)：重复多次接触中药后体内可测出物质的原形或代谢产物效应蓄积或损伤蓄积(damage accumulation or effect accumulation)：长期接触后机体内测不出中药的原形或代谢产物，却有慢性毒性作用。,试验目的：1、确定受试物重复给药的毒效应谱，毒作用特点。对在急性毒性试验中发现的毒作用提供新的信息，并发现在急性毒性试验中未发现的毒作用。2、研究长期接触受试物毒作用的靶器官。3、研究受试物重复接触毒性作用的剂量-反应(效应)关系，确定其观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)和
19、未观察到有害作用的剂量(NOAEL)，提出受试物的安全限量参考。4、研究长期接触受试物毒性作用的可逆性。5、确定不同动物物种对受试物长期接触毒性作用的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依据。,二、 试验方法,(一)、实验动物的选择1、品系：一般选择两种动物：啮齿类(大鼠)、非啮齿类(犬)，经皮毒性试验时，可用兔或豚鼠。2、性别：一般选用雌雄各半，如临床只用于一种性别，可选用单性别动物。3、年龄：慢性毒性试验的目的是使实验动物寿命的大部分时间给药受试物，因此在生命的早期开始给药很重要。FDA要求啮齿类在开始时应小于6周龄。一般68周龄大鼠(80100g)，慢性可用刚离乳大鼠(5070g)。4、动
20、物数：大鼠、小鼠每组不少于20只，犬、猴每组不少于6只，如有中期处死观察，动物数相应增加。5、微生物学寄生虫学等级和饲养环境：参照相关规定，如GLP：清洁级以上，屏障环境饲养。不同项目试验，分室进行等,(二)给药方式(或途径)：原则：应尽量与临床给药途径一致。 一般以经口、经呼吸道、经皮1)小动物常用灌胃法和喂饲法：大鼠和小鼠建议用灌胃法，特别是在要求给药量准确较高的情况下。犬或猴可采用胶囊法或灌胃法。,2)经呼吸道给药：每日为26小时 给药柜中受试物浓度达到平衡后， 急性吸入：每天4小时； 长期毒性依实验要求定，一般为6小时 3) 注射：有静脉注射、静脉点滴、肌肉注射和皮下注射。静脉注射或点
21、滴在长期试验中实施困难，可用腹腔注射替代，注意无菌操作。4)每日给药时间：保持一致。一般上午，给药后喂饲。,(三)给药期限：给药频率每日一次，连续给予。如试验期3个月，也可每周6次。长期毒性试验的期限：临床拟用期限的23倍 如与致癌试验结合进行则最好接近于动物的预期生命。,(四)剂量设计和试验分组：至少3个剂量组和1个阴性(溶媒)对照组组距210倍，最低不少于2倍，慢性毒性试验剂量组距应小于亚慢性毒性试验。高剂量组：引起较明显的毒性(低于10%死亡)中剂量组：观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)低剂量组：未观察到有害作用剂量(NOAEL)剂量设计是关键也是比较困难：考虑：1)以相同物种的毒性
22、资料作基础。 可以急性毒性的阈剂量或者以LD50的1520为最高剂量(同一品系动物，同一给药途径)。,2)以动物试验药效学基础确定最低剂组水平开始设计。低剂量组原则上应高于同一种动物药效学试验的有效剂量，并不使动物出现毒性。在低剂量组水平之上，再设计中、高剂量组剂量水平。3) 采用人拟用的最高剂量为剂量设计依据。大鼠可用人临床拟用剂量的10、30、100倍，非啮齿类可用5、15、50倍。当预期受试物没有明显毒性时，长期毒性试验设计至少等于人拟用剂量的最大倍数，化学药品为30倍，中药为50倍。,(五)观察指标：1、活体评价(in-life evalution)(1)一般性指标 外观： 体表通道、
23、毛色等 社会行为：躁动、冷漠、探究 刺激性：好斗等 对周围环境、代谢物、水的兴趣 体重：低于对照组10%毒效应 有剂量-反应关系综合毒性效应 直接统计、增长重量或增长百分率统计 饲料消耗(摄食量)：实际摄入量 食物利用率(每100g饲料体重增长克数) 注意：有中毒反应，取出单笼饲养，发现死亡或濒死应及时尸检,(2)实验室检查：1)血液学指标：RBC(计数、形态、比容、平均体积、平均血红蛋白、平均血红蛋白浓度)或网织红细胞计数、血红蛋白、白细胞计数、白细胞分类、血小板计数(骨髓涂片) 凝血功能：凝血酶原时间PT、活化部分凝血活酶时间APTT(或替代方法)2)血液生化学指标：天门冬氨酸氨基转移酶A
24、ST、丙氨酸氨基转移酶ALT、碱性磷酸酶ALP、尿素氮BUN、总蛋白TP、白蛋白ALB、血糖GLU、总胆红素T-BIL、肌酐Crea、总胆固醇T-CHO、(钙、钾、钠)3)尿液分析：尿常规、外观、体积、比重或渗透压、PH、总蛋白质、葡萄糖、(无机离子)4)心血管评估：非啮齿类动物。标准导联(右前左后)ECG，分析P-R、Q-T间期、心律、心率等，血压5)眼科学检查：啮齿和非啮齿类。眼睛及其毗连结构。,(3)处死后评价(post-mortem evalution)：1) 尸体解剖：系统解剖，测定脏器重量，进行肉眼和病理学检查。称重并计算脏器系数：脑、心、肝、肾、肾上腺、胸腺、脾、睾丸、附睾、子宫
25、、肺、甲状腺脏器系数或脏器相对重量(relation organ weight)：某脏器湿重与体重之比值，通常是100g体重中所占重量。相对重量增加：可能有充血、水肿、肿瘤、增生或体重增长受阻相对重量降低：坏死、萎缩等。2)病理学检查：包括试验过程中死亡的动物均应进行仔细的肉眼观察，可见的损伤或可疑损伤部位均应采样固定，作进一步病理学检查。对照组和高剂量组应作病理学检查，其他组取材保存，仅在高剂量组有异常时进行检查。,检查内容：啮齿类：脑(大脑、小脑、脑干)、脊髓(颈、胸、腰段)、垂体、视神经、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、食管、唾液腺、胃、大肠、小肠、肝脏、胰腺、肾脏、肾上腺、脾脏、心脏、气管、肺
26、脏、主动脉、睾丸、附睾、前列腺、子宫、卵巢、乳腺、膀胱、坐骨神经、骨髓、淋巴结(给药局部、肠系膜)、给药局部非啮齿类：+胆囊、眼(有异常时)吸入性毒性：整个呼吸道，包括鼻腔、咽、喉、气管、总支气管、肺经皮给药：涂敷受试物部位皮肤和相邻皮肤(4)可逆性观察：最后一次给药24小时，每组活杀部分动物(23)，余下动物停止给药，继续观察24周。,(5)指标观察时间：一般状况每天观察一次，每周记录饲料消耗和体重一次。试验周期在3个月以内，一般在最后一次给药后24小时和恢复期结束时各进行一次各项指标的全面检测。必要时，在试验中间检测指标一次。试验周期在3个月以上，应在试验中期活杀少量动物(高剂量组和对照组)检测。,三、重复剂量毒理学试验的附加终点,目的：最大限度利用动物资源，减少危险性评价所用的时间和经费，并获得附加资料。注意：谨慎选择附加终点，保证有可靠的测量方法并获得相应机构的认可。避免干扰研究主要目的。附加终点：遗传毒性、神经毒性、免疫毒性等,四、数据的处理和结果分析,(一)研究资料总汇(二)统计学比较(三)处理相关反应的确定剂量相关趋势反应重现性相关发现组间差异的大小与类型性别差异差别出现的时间性(四)判别是否代表有害作用(五)参考范围,
