1、分离自蜂蜜中的嗜渗酵母的实时荧光 PCR法快速鉴定 陈世琼 1 蔡雪凤 1 逄波 2 韩玥 3 伊鋆 1 任岩 1 （ 1 北京市海淀区产品质量监督检验所 北京 100094； 2 中国疾病预防控制中心 北京 102206； 3 北京市出入将检验检疫局 北京 100026） 摘 要： 嗜渗酵母是导致蜂蜜腐败的主要微生物。鲁氏接合酵母是嗜渗酵母中最常见的种类。酵母的传统生化鉴定方法繁琐、耗时。为快速鉴定分离自蜂蜜的嗜渗酵母的种类，本研究建立了针对鲁氏接合酵母的实时荧光 PCR 快速鉴定方法。并用此方法对分离 自蜂蜜的 62 株嗜渗酵母进行了快速鉴定，发现其中 21 株为鲁氏接合酵母。实时荧光 P
2、CR 方法鉴定鲁氏接合酵母，全过程仅需约 5 小时，与常用的生化鉴定方法相比，简化了鉴定步骤，提高了鉴定准确性，缩短了鉴定时间。 关键词： 蜂蜜 嗜渗酵母 实时荧光 PCR 鉴定 Rapid identification of eosinophils yeast isolated from honey by real-time PCR method Shiqiong Chen 1* Xuefeng Cai 1* Bo Pang2 Yue Han3 Jun Yi 1 (1 Beijing Haidian District Products Quality Supervision and Insp
3、ection Institute, Beijing, 100094; 2 Chinese Center for Disease Control and prevention, Beijing, 102206; 3 Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing, 100026 ) Abstract: Osmophilic yeast is the main microorganism which lead honey to corruption. Zygosaccharomyces rouxii (Z. rouxii )
4、 was the most common type of osmophilic yeast. This study established a real-time PCR for rapid identification of Z. rouxii. Sixty two strains of osmophilic yeast isolated from honey were rapidly identified by this real time PCR method. The results showed that 21 of them were Z. rouxii. To identifiy
5、 Z. rouxii by real-time PCR method, the whole process only needs about 5 hours. Compared with the commonly used biochemical identification methods, the real time PCR method is more simple, accurate and time saving. Key words: honey; Osmophilic yeast; Real Time PCR; identification 【中图分类号】 TS255.1 【文献
6、识别码】 A 【文章编号】 蜂蜜较其他食品而言，具有高糖、高渗透压等性质，因此具有一定的抑制微生物生长的作用，所以蜂蜜中所具有的微生物种类与数量是相对较少的 1,2。但是，酵母、霉菌，以及一些能够形成芽孢的细菌，能够在高糖、低水分活度的环境中生存，它们也经常给蜂蜜产业带来问题 3,4。酵母能够影响蜂蜜产品的货架期和质量的稳定性 5。 蜂蜜中出现的酵母主要有两类：一类为嗜渗酵母（ osmophilic yeast），另一类为耐高糖酵母（ sugar- tolerant yeasts)，其中嗜渗酵母对蜂蜜品质影响较大 4,6,7。 嗜渗酵母中，已有的研究报道表明，有结合酵母（ Zygosacchu
7、romyces）、酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）、针孢酵母（ Nematospora）和 圆酵母（ Torula） 被从蜂蜜或其它高糖食品中分离出来 4,8-10。 鲁氏接合酵母是常见的 嗜渗酵母， 能引起 蜂蜜及其加工产品 变质。 因此， 2011，中华人民共和国卫生部发布并实施了食品安全国家标准 蜂蜜（ GB14963- 2011） ， 代替了 蜂蜜 卫生标准 （ GB14963- 2003） 以及 蜂蜜 （ GB18796- 2005）标准 11。 新标准除了对蜂蜜的定义 、蜜源要求等进行了增订 、 修改外，还增加了对嗜渗酵母的计数要求 12。 传统酵母菌
8、鉴定，包括蜂蜜中的鲁氏酵母的鉴定，一般采用传统生化鉴定方法。此方法耗费时间长，且操作步骤繁琐 13,14， 一般需要 1-2周才能完成 14。分子生物学技术的发展，为分离自蜂蜜的接合酵母的快速鉴定提供了新的替代方法 15。实时荧光 PCR技术具有快速、灵敏、特异性强等优点，是一种极具优势的分子生物学技术 16。 本研究的目的是建立针对鲁氏接合酵母的实时荧光 PCR快速鉴定方法，并对分离自蜂蜜的 嗜渗酵母进行快速鉴定，以便为蜂蜜产品中嗜渗酵母的溯源，以及蜂蜜产品的质量控制提供技术支持 。 1 材料与方法 1.1 菌株 本研究使用的菌株见表 1： 表 1 本研究使用的菌株 Table 1 Micr
9、obial strains used in the research 编号 菌 名 菌 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15-77 鲁氏接合酵母 Zygosaccharomyces rouxii Zygosaccharomyces rouxii Zygosaccharomyces rouxii 酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 粘红酵母 Rhodotorula glutinis 粉状毕赤酵母 Pichia carsonii 近平滑假丝酵母 Candida parasilosis 汉逊德巴利酵母 Zygosaccharomyces
10、bisporus 布鲁塞尔德克酵母 Dekkera bruxellensis 斯巴达毕赤酵母 Pichia spartinae 黑曲霉 Aspergillus niger 大肠杆菌 E. coli 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 脂环酸芽孢杆菌 Alicyclobacillus 未知酵母 CGMCC 2.1915 CICC 1417 CICC 31259 CGMCC 2.1882 CGMCC 2.0703 CGMCC 2.1908 CGMCC 2.1846 CGMCC 2.1595 JCM 11407 JCM 10741 ATCC 16404 ATCC 25922
11、5-3，分离自样品 DSMZ 3922 分离自蜂蜜产品 其中，编号为 1、 2和 3为鲁氏接合酵母标准菌株； 4-14为参比菌株，其中， 4-10为其他食品中常见的其他腐败酵母， 11为黑曲霉（ ATCC 16404）， 12-14为细菌。 15-77为分离自蜂蜜样品的未知酵母。 1.2 仪器及试剂 实时荧光 PCR仪（ ABI 7300）；生化培养箱。反应预混液（ 2 TaqMan Universal Master Mix， ABI）（ Cat. No.： 4427788）；酵母基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司，以下简称天根公司）（ Cat. No.： DP 307-02）。 1.3
12、试验方法 1.3.1 菌株的培养及 DNA 提取 将表 1中的菌株用马铃薯 -葡萄糖培养基培养基 1628 培养 24h，取培养液用天根公司酵母基因组提取试剂盒提取 DNA。详细操作过程见试剂盒说明书。提取的 DNA于 -20冰箱贮存备用。 1.3.2 鲁氏接合酵母实时荧光 PCR 鉴定方法的建立 根据本实验设计的探针引物序列，从上海英骏生物技术有限公司合成引物探针。分别以表 1 中 1-10 目的菌株及参比菌株的 DNA 为模板，配置 20 L 实时荧光 PCR 反应体系，组成如下：含 10 L 2 TaqMan Universal Master Mix，上下游引物（ 10 mol/L）各
13、1 L，探针（ 10 mol/L） 1 L，模板 50ng -100ng，用灭过菌的双蒸水补足 20 L。在 ABI 7300扩增，扩增条件为： 95 ， 10min； 95 ， 15s; 60 ， 1min； 40 个循环。根据 Ct 值判断探针、引物的特异性。 2 结果与分析 2.1 引物、探针的特异性试验结果 引物、探针的有效性、特异性试验结果详见图 1 及表 2： 从图 1 及表 2 可以看出，本研究使用的针对 Zygosaccharomyces rouxii 实时荧光 PCR探针和引物对 Z. rouxii 属目的菌株有高度的特异性。在本研究所使用的扩增条件下，目的菌株 CGMCC
14、2.1915、 CICC 1417 和 CICC 31259 的的扩增曲线的 Ct 值分别为 19.28、 22.01和 22.71，其他酵母、曲霉、细菌标准菌株或参比菌株扩增曲线的 Ct 值均显示为未扩出。空白对照 BLANK 未扩出，说明实验结果有效，不存在污染。 图 1 引物、探针的有效性实验 Fig.1 The probe and primers of Z. rouxii of real time PCR 注：图 1 中，曲线 1、 2 以及 3 分别表示以 Z. rouxii 标准菌株 CGMCC 2.1915、 CICC 1417 和 CICC 31259的基因组 DNA 为模板时
15、的扩增曲线； 4-15 表示以表 2 中其他参比菌株的基因组 DNA 或者 DNA FREE WATER（见表 2 中的 BLANK）作为模板的扩增曲线（曲线编号与表 2 中编号一一对应）。 表 2 引物、探针的特异性试验结果 编号 标准或参比菌株名称及菌号 扩增结果（ Ct 值） 1 Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 2.1915 2 Zygosaccharomyces rouxii CICC 1417 3 Zygosaccharomyces rouxii CICC 31259 4 Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.1882 5 R
16、hodotorula glutinis CGMCC 2.0703 6 Pichia carsonii CGMCC 2.1908 7 Candida parasilosis CGMCC 2.1846 8 Zygosaccharomyces bisporus CGMCC 2.1595 9 Dekkera bruxellensis JCM 11407 10 Pichia spartinae JCM 10741 11 Aspergillus niger ATCC 16404 12 E. coli ATCC 25922 13 Staphylococcus aureus 5-3，分离自样品 14 Alic
17、yclobacillus DSMZ 3922 15 BLANK* 19.28 22.01 22.71 N* N N N N N N N N N N N 注： *表中“ N”表示“ UNDETECT”； *表示以 DNA FREE WATER为模板，即空白对照。 2.2 分离自蜂蜜样品的未知酵母实时荧光 PCR 方法快速鉴定结果 使用针对 Z. rouxii实时荧光 PCR方法鉴定用的探针和引物，以分离自蜂蜜样品的 62株未知酵母的 DNA为模板，使用 ABI公司生产的反应预混液（ 2 TaqMan Universal Master Mix ，ABI） （ Cat. No.： 4427788）配
18、置 20 l反应体系，使用 1.3.2中的扩增条件，对分离自食品样品的 62株未知酵母进行快速鉴定。鉴定结果发现， 所有被鉴定的 60株嗜渗酵母中，有 21株 Ct值与阳性对照鲁氏接合酵母标准菌株相近，判断其为 鲁氏接合酵母；其他 41株为与鲁氏接合酵母不同的酵母。进一步鉴定将继续进行。鉴定结果见图 2。 图 2 分离自蜂蜜中的嗜渗酵母实时荧光 PCR快速鉴定 Fig.1 Detection of Osmophilic yeast isolated from honey by real time PCR method 注：图 2中，曲线 1为以 Z. rouxii标准菌株 CGMCC 2.19
19、15的 DNA为模板的扩增曲线； 2-22为本实验室分离自食品中的嗜渗酵母中的 Z. rouxii属的阳性菌株的扩增曲线； 23-63：为本 实验室分离自食品中的嗜渗酵母中的非 Z. rouxii属的菌株的扩增曲线； 64为空白对照的扩增曲线。 3. 讨论 本研究建立了蜂蜜中鲁氏接合酵母的实时荧光 PCR快速鉴定方法，全过程仅需要 5小时时间。此方法与传统生化鉴定方法（一般需要 1-2周）相比，大大节约了鉴定周期，提高了工作效率。为蜂蜜中鲁氏接合酵母的快速、准确鉴定及溯源，以及蜂蜜及其制品的质量控制检测，提供了技术手段。并且用所建立的方法从本所微生物室分离自食品的 62株嗜渗酵母中，鉴定出 2
20、1株 Z. rouxii属的酵母。本方法及所分出的嗜渗酵母的相 关研究，将继续进行。 参考文献 1 Allen KL, Molan PC, Reid GM. A survey of the antibacterial activity of some New Zealand honeysJ. J Pharm Pharmacol 1991, 43(12): 817-822 2 Anthimidou E, Mossialos D. Antibacterial activity of Greek and Cypriot honeys against Staphylococcus aureus and
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