1、红细胞检验的基础理论,南昌大学一附院检验科 吕小林,红细胞检验的基础理论,红细胞膜血红蛋白红细胞代谢红细胞的衰老和死亡,红细胞膜,一、红细胞膜的组成与结构二、红细胞膜的功能三、影响红细胞膜稳定的因素,细胞膜的化学组成,细胞膜,膜脂,膜蛋白,磷脂,胆固醇,卵磷脂（磷脂酰胆碱）,脑磷脂（磷脂酰乙醇胺）,鞘脂（带一个氨基）,糖脂（ABO血型）,外周蛋白和整合蛋白,运输蛋白、受体蛋白和酶,糖类,红细胞膜脂质组成,人红细胞膜的主要蛋白,E.Gorter and F. Grendel Model, 1925,结构,红细胞膜结构示意图,有关细胞膜结构的几个,红细胞膜骨架结构：膜下0.2ul胶溶层，包括主体蛋
2、白和外周蛋白主体蛋白：镶嵌于脂质双层中，多属糖蛋白外周蛋白：与脂质双层疏松结合，易被水解血影（ghost）：RBC裂解释放Hb后留下一个保留原形的空壳结构,概念,细胞膜的化学结构,外周蛋白,膜骨架,主体蛋白,红细胞膜蛋白结构示意图,红细胞膜结构示意图,膜骨架功能,维持红细胞的正常形态及变形性,膜结构最基本的特征,细胞膜的不对称性细胞膜的流动性,细胞膜的不对称性,膜脂的不对称性膜蛋白的不对称性（功能上的方向性不对称）复合糖的不对称性,细胞膜的不对称性是生物膜完成复杂的在时间与空间上有序的各种生理功能的保证,膜脂质不对称性,外小页：PC（胆碱磷脂）、PM（鞘磷脂）内小页：PE（乙醇胺磷脂）、PS（
3、丝氨酸磷脂）与细胞老化、调亡、细胞识别和吞饮有关,膜蛋白不对称性,特性：具有明显方向性和区域性蛋白激酶C 磷脂酰丝氨酸（内小页）,复合糖不对称性,特性：糖蛋白、糖脂仅分布于细胞外侧意义：细胞表面受体、与细胞抗原性有关,细胞膜的不对称性示意图,膜流动性,主要指脂质和蛋白质的运动 脂质 液态 晶态 蛋白质 侧向运动、旋转运动生理意义：保证细胞生理功能必要条件,研究膜蛋白流动性的经典实验,二、细胞膜的生物学功能,为细胞生命活动提供相对稳定的环境选择性的物质运输，其中伴随能量的传递提供细胞识别位点，完成信息传递提供多种酶结合位点，使酶促反应高效进行介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接参与形成具有不同功
4、能的细胞表面特化结构,膜功能一、稳定内环境,一、屏障作用二、赋予高度变性能力,膜功能二、物质跨膜运输,简单扩散协助扩散主动运输（由ATP直接提供能量，如：钠钾泵和质子泵；间接由ATP提供能量，如：协同运输）基团转移内吞和外排,膜功能三、细胞识别及信息传递,细胞识别：与寡糖链密切相关1、血型抗原2、补体受体（CRI）,二、影响红细胞膜稳定因素,化学因素,影响膜稳定和因素,免疫因素,红细胞膜蛋白的遗传性缺陷,酶代谢异常,ATP生成不足,生物因素,第二节血红蛋白,血红蛋白,血红蛋白组成血红蛋白结构、功能血红蛋白种类影响血红蛋白结构、功能因素,血红蛋白组成,血红素：铁原子、原卟啉珠蛋白,血红蛋白,血红
5、蛋白结构与功能,结构：二条链和二条链 紧密型（T）、松弛型（R）功能：运输氧，具有协同效应,生理性血红蛋白种类,胚胎期：成人：,影响血红蛋白结构和功能的因素,珠蛋白基因缺失或缺陷 Heinz酶缺陷 MHb化学药物中毒 MHb、SHb、HbCO,第三节 红细胞代谢,红细胞糖代谢铁代谢核苷酸代谢,红细胞糖代谢,葡萄糖无氧酵解磷酸戊糖途径与谷胱甘肽途径其它,葡萄糖无氧酵解,无氧酵解 获取能量唯一途径2、3二磷酸甘油酸代谢支路 影响血红蛋白与氧亲和力酶缺乏 丙酮酸激酶,磷酸戊糖途径与谷胱甘肽途径,磷酸戊糖途径：还原性辅酶（NADPH）、磷酸核糖（参与嘌呤、ATP合成）谷胱甘肽途径：保护-SH基团、降解
6、H2O2酶缺乏：G6PD,铁代谢 铁的运转,铁的贮存,红细胞核苷酸代谢,维生素B12和叶酸的来源与吸收转运、利用与贮存在合成DNA中作用影响吸收和转运因素,红细胞核苷酸代谢,叶酸的吸收,叶酸,蝶酰单谷氨酸,四氢叶酸,双氢叶酸还原酶,多谷氨酸盐,参与DNA合成,组织细胞酶促作用下,血浆,叶酸进入组织细胞后，转变为多谷氨酸盐，才具有 参与DNA合成的活性。叶酸吸收障碍后27个月内导致叶酸缺乏，也引起与vitB12缺乏时相似的巨 幼红细胞性贫血。 叶酸的活化需要vitB12参与，因此，vitB12缺乏时，叶酸的利用率下降，可引起叶酸相对不足。,胃液,小肠上段,回肠,门脉血流,肝,转钴蛋白II造血组织
7、,B12与R蛋白结合,胰蛋白酶断裂结合。与内因子结合，免被蛋白水解酶破坏。,内因子一部分与B12结合，一部分与回肠上皮细胞膜特异受体结合，被吸收,* 内因子胃腺壁细胞分泌的一种糖蛋白 R蛋白是一种电泳速度很快的血浆蛋白。* B12吸收障碍，巨幼RBC性贫血-大细胞性贫血,Vit.B12吸收,红细胞的衰老和死亡,1、红细胞糖代谢改变2、红细胞膜及血红蛋白改变,3、红细胞的破坏,红细胞平均寿命120天，在血管内循环流动约27KM，在穿过小血管和孔隙时可变形而不至于破裂。衰老红细胞脆性增加，易破裂，通过微小孔隙也发生困难，容易停滞于脾和骨髓中被巨噬细胞所吞噬。,细胞的衰老：,未分化,分化,衰老,死亡
8、,衰老是一种正常的生命现象,生物体内的绝大多数细胞，都有经过未分化、分化、衰老、死亡这几个阶段。,红细胞的死亡,红细胞的消亡无效造血,红细胞检验的基本方法,一附院 吕小林,红细胞检验的基本方法,有关铁指标的检验血清和红细胞叶酸测定溶血的检验红细胞膜缺陷的检验红细胞酶缺陷的检验血红蛋白异常的检验免疫性溶血贫血的检验,血清铁测定,原理：Fe2+ Fe +3 +显色剂，生成有色络合物。应用评价1、降低：需求量增加、IDA、慢性失血和 感染等。2、增高：肝疾病、铁粒幼细胞贫血、AA、 慢性溶血、反复输血等3、血清经常变化，单项检测意义不大。,血清铁蛋白测定,原理：固相放射免疫法。兔抗人铁蛋白+血清铁蛋
9、白 Ag-Ab复合物+125I标记Ab 标记Ab-Ag-Ab，检测复合物中放射性 算出血清铁蛋白值应用：能准确反映体内储铁情况。SF减少是诊断IDA敏感方法之一。1、降低：IDA、慢性失血和 贫血等。 2、增高：肝疾病、铁代谢障碍性贫血、感染、 恶性肿瘤等,血清总铁结合力测定,原理：在血清中加入已知过量的铁标准液，使之饱和，并检测其中铁，即总铁结合力。再减去原血清转铁蛋白中所含的铁，为未饱和铁结合力应用：增高 IDA和真红细胞增多症等。 降低或正常 肝疾病、溶血性贫 血、感染、恶性肿瘤和肾病综合征等,小细胞低色素性贫血的实验鉴别,铁检验,铁检验,IDA红细胞扫描电镜图像：,缺铁性贫血血象：,I
10、DA红细胞形态,IDA红细胞,正常红细胞,IDA骨髓病理 正常骨髓外铁外铁（-）（）： （+）（+）：,细胞内铁,第二节 叶酸和维生素B12的检测,一、叶酸测定 放射免疫法二、维生素B12测定 放射免疫法三、应用评价 1、降低：巨幼细胞贫血 2、增高：白血病，某些恶性肿瘤等,巨幼细胞贫血血象,巨幼细胞贫血骨髓象,巨幼细胞贫血骨髓象,第三节溶血的检验,红细胞寿命测定血浆游离血红蛋白检测血清结合珠蛋白检测尿含铁血黄素检验,实验室检查,一、RBC寿命测定（最佳） 51Cr同位素标记正常值：2532天应用评价 1、溶血性贫血 红细胞寿命缩短，约14天 2、再生障碍性贫血 约15-29天,红细胞碎片,血
11、浆游离血红蛋白检测,原理 利用HB具有过氧化物酶活性，采用过氧化物酶法检测血浆游离血红蛋白。参考值 0-40mg/L临床评价 1、判断血管内溶血 PNH、蚕豆病、溶血反应等明显增高，自身免疫性贫血、珠蛋白障碍性贫血可轻到中度增高。 2、血管外溶血不增高,溶血的检验,血清结合珠蛋白检测,原理 血清结合珠蛋白测定是在待测血清中加入一定量的血红蛋白液，使之与测血清中的HP形成HP-HB复合物。通过电泳法分离复合物，并测定其量，从而算出结合珠蛋白的量。参考值 0.5-1.5gHB/L临床评价 1、减低 常见于各种溶血， 尤其血管内溶血 2、增高 感染、创伤、恶性肿瘤等,溶血的检验,尿含铁血黄素检验,原
12、理 当血红蛋白通过肾滤过时,部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞,并随尿排出.上皮细胞中高铁离子与亚铁氰化钾作用,在酸性环境下产生蓝色沉淀.参考值 阴性临床评价 慢性血管内溶血,溶血的检验,Hp与Rous异同点,相同点：都反应血管内溶血不同点：,红细胞膜缺陷的检验,原理 检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力.红细胞在低渗盐溶液中,当水渗透其内部达一定程度时,红细胞发生膨胀破裂.参考值 开始溶血:4.4-4.8G/L 完全溶血:2.8-3.2G/L临床评价:脆性增加 球形红细胞/椭圆形红细胞增多症;脆性降低 珠蛋白合成障碍等.,0.32,0.30,0.22,NaCl,0.28,0.26,
13、0.24,0.36,0.34,完全溶血 开始溶血 未溶血,成熟红细胞,泪滴状红细胞,镰状红细胞,缺铁性红细胞,二、自身溶血试验及纠正试验 正常孵育48小时 0.2-4.0%,加糖 0.1- 0.6%,加ATP 0.1-0.8%。遗传性球形红细胞增多症者，ATP、糖均能纠正；G6PD缺乏者，糖纠正；丙酮酸激酶缺乏者，ATP纠正。三、红细胞膜三磷酸腺苷活性测定四、酸化甘油溶血试验五、高渗冷溶血试验六、红细胞膜蛋白电泳分析,红细胞酶缺陷的检验,原理 在血液中加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁血红蛋白变成高铁血红蛋白,正常红细胞的G-6-PD催化戊糖旁路使NADP变成NADPH,使高铁血红蛋白还原成亚血红素
14、,通过比色没其浓度.参考值 75%临床评价 G-6-PD酶缺乏患者。中间缺乏者为31-74%。严重缺乏者75% G6PD缺陷定性（），半定量95% HBF2% HBA2为1.0-3.0%临床评价 HBA2增多见于珠蛋白生成障碍性贫血;HBF见于不稳定血红蛋白增多.,（2）血红蛋白电泳分析,主要检查有无异常Hb区带在HbA前出现快速异常：HbH，J，K组在HbA后出现慢速异常：HbG，D，E组,异常HB带,+,（2） 变性珠蛋白小体生成试验,受检RBC乙酰苯肼 作活体染色（甲基紫） 3712h 有变性珠蛋白小体，则膜上形成紫黑色颗粒结果：含5个以上者即（） ，正常人30%意义：不稳定Hb也可出现
15、，故仅作筛选,变性珠蛋白小体,血红蛋白异常检验,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测三、抗碱血红蛋白检测四、异丙醇沉淀试验五、热变性试验,第七节 PNH检验,一、酸化血清溶血试验原理：患者体内存在对补体敏感红细胞，即红细胞在酸性（PH6.4-6.5）的正常血清中孵育，补体被激活，而产生溶血。参考范围：阴性应用评价：主要见于PNH患者,（一）酸溶血试验（Hams test） 特异性高，是国内外公认的PNH确诊试验,PNH检验,二、蔗糖溶血试验 特异性敏感性均不如Hams，仅做筛选。三、蛇毒因子溶血试验（复合蛇毒） 敏感性，灵敏度高于Hams，特异性不如Hams 。,一、抗人球蛋白试验,原理 直接试验应用抗
16、人球蛋白试剂与红细胞表面的IgG分子结合,如红细胞表面存在自身抗体,出现凝集反应.参考值 阴性临床评价 自身免疫性贫血,免疫性溶血贫血的检验,第八 免疫性溶血性贫血检验,四、筛选试验,(一)抗人球蛋白试验（Coombs test） 1. 直接抗人球蛋白试验（DAGT） 测RBC表面结合的抗体（更重要，价值高） 受检者RBC悬液+等量抗人球蛋白试剂 37水浴 15min,低速离心后观察凝集否,抗人球试验,抗人球试验,2. 间接（IAGT）：,测游离特异的抗体 检测血清中有无不完全抗体1、先使RBC致敏2、再与抗人球蛋白血清结合,将病人血清和正常RBC混合，再加入抗IgG试剂,2012.02,谢谢,
