1、肝癌组织高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）的表达及其与临床病理因素的关系摘 要：目的 探讨 HMGB1 蛋白在原发性肝细胞癌中的表达及对原发性肝细胞癌的诊断价值。方法 应用免疫组化及计算机图像分析方法测定 30例原发性肝细胞癌及癌旁组织标本（自身配对组织）HMGB1 蛋白表达，及其与原发性肝细胞癌临床病理因素的关系。结果 HMGB1 在肝癌组织呈过表达，其表达高于肝癌旁组织（P0.05） ；HMGB1 在包膜不完整、有淋巴结转移肝癌中的表达分别高于包膜完整及无淋巴结转移者（均 P0.05） ，随着 Edmondson 病理学分级增加，HMGB1 表达增高（P0.05） 。而 HMGB1表达与肿
2、瘤患者年龄、性别、肿瘤大小无明显相关（均 P0.05） 。结论 HMGB1 可能在原发性肝细胞癌的发生、发展，浸润及转移中发挥重要的作用。HMGB1 可能是原发性肝细胞癌的一种新的潜在的肿瘤特异性标志物。关键词：肝细胞癌；HMGB1 ；免疫组织化学 ；计算机图像分析高迁移率族蛋白 B1（high-mobility group box-B1,HMGB1）是高度保守的非组蛋白 DNA 结合蛋白，哺乳动物中 HMGB1 具有 99%的同源性质，HMGB1 作为一种核蛋白，在 DNA 结构、基因转录、重组、细胞存活等方面发挥重要的调控作用1,2。最新研究发现 HMGB1 与原发性肝细胞癌有关，由于其在
3、原发性肝细胞癌中的表达特异性升高而引起研究者3-5的注意。因此，我们采用免疫组织化学及计算机图像分析技术方法分析 HMGB1 蛋白在原发性肝细胞癌中的表达及与其临床病理因素的关系，为进一步探讨 HMGB1 与原发性肝细胞癌的发生、发展，浸润、转移的关系，寻找新的生物学标记物及治疗靶点奠定基础。材料与方法一、一般资料材料：标本来自 2008 年 1 月-2011 年 3 月昆明市第一人民医院肝胆外科的原发性肝癌患者，以距癌灶边缘 5cm 为分界分别留取肝癌癌灶组织，非癌组织各 30 例。其中男 24 例，女 6 例，年龄 36-75 岁，平均年龄59.610.5 岁。瘤体 5 cm 16 例，瘤
4、体5 cm 14 例，所有标本均经病理组织学证实为原发性肝细胞肝癌。二、方法1.免疫组织化学法兔抗人 HMGB1 多克隆抗体及 S-P 免疫组化试剂盒分别购自美国 PTG公司，北京中杉金桥生物技术有限公司。肝癌及癌旁组织免疫组化以经典的 S-P 法进行（HMGB1 工作浓度 1：100，每片滴加 HMGB1 一抗，4冰箱过夜）DAB 显色，以 PBS 液代替一抗作为阴性对照，以已证实 HMGB1 染色阳性的肝癌标本作阳性对照。2.计算机图像分析 应用 HPIAS1000 高清晰度病理图文分析系统对免疫组化结果进行定量分析。 （详细操作步骤参照 HPIAS1000 型图像分析仪使用手册。 ）3.
5、 结果判断：（1）免疫组化 细胞核和/或细胞浆出现棕黄色或棕褐色染色颗粒为阳性细胞。每张切片在高倍镜下（X200）随机观察 5 个视野，计数 200个细胞/视野，阳性细胞数15%为表达阴性（-） ，阳性细胞数 15%-50%为表达弱阳性（+） ，阳性细胞数 51%-75%为表达中等强度阳性（+） ，阳性细胞数75%为表达强阳性（+） ，其中阳性细胞数大于 50%为过表达。（2）计算机图像分析 每组标本均在 400放大倍数下按照无偏采样原则取 5 个视野，每个视野均按照无偏采样原则取 5 个细胞进行测定。根据阳性单位（PU）结果来判断免疫组化染色强度的差异。PU 值用均值+标准差（）表示。4 统
6、计学分析应用 SPSS13.0 统计软件分析处理。多样本和两样本半定量积分的阳性表达比较均采用 Kruskal-Wallis 秩和检验，蛋白表达强度差异 PU 值（）进行单因素方差分析后行 LSD-t 检验。 （检验水准 =0.05，P0.05 具有统计学意义。 ）三 结果1.免疫组化染色 癌旁组织中 HMGB1 蛋白表达较低，表现为少数胞核和（或）胞浆微弱着色。HMGB1 蛋白在肝癌组织中呈过表达，阳性颗粒主要位于细胞核中，细胞浆也有微弱着色（图 14） 。肝细胞癌组织中 HMGB1阳性表达率为 80%，与癌旁组织 30%相比，差异有统计学意义（P0.05） 。肝细胞癌组织、-、级中 HMG
7、B1 蛋白阳性表达率逐渐增加，分别为 62.5%、83%、90%， （均 P0.05） 。随着肝细胞癌淋巴结的转移，HMGB1 蛋白的阳性表达率增加，分别为 76.2%、89%，包膜不完整肿瘤的HMGB1 阳性率（81.8%）高于包膜完整者（78.9%） ，其差异均有统计学意义（P0.05） 。而 HMGB1 蛋白与肝细胞癌患者年龄、性别及肿瘤大小无关（均 P0.05） 。计算机图像分析结果与免疫组化结果一致（详见表12） 。中呈阳性表达 100 中呈阳性表达 4002 计算机图像分析结果 表 1 HMGB1 与肝细胞癌及癌旁组织的关系表 2 HMGB1 与原发性肝细胞性肝癌临床病理因素的关系
8、组别 例数 阳性单位（PU） （） P 值性别男 25 13.67 0.35 0.517女 5 11.11 1.08 年龄/岁50 6 9.83 0.96 0.180 50 24 14.30 0.10肿瘤大小/cm5 16 12.17 0.43 0.432 5 14 14.47 1.23肿瘤包膜完整 19 11.13 0.59 0.041不完整 11 16.89 8.80 Edmondson 分级级（高分化） 8 6.57 0.45 0.041-级（中分化） 12 12.51 0.18 0.001 级（低分化） 10 18.95 1.12 0.034 淋巴结转移无 21 10.99 0.01
9、0.014有 9 18.48 1.23 四 讨论 高迁移率蛋白 B1（high-mobility group box-B1,HMGB1）基因于 1973年首先由 Sanders 等6,7 在小牛胸腺中发现，人 HMGB1 定位于 13q12带，编码含 215 个氨基酸的单链多肽，HMGB1 由 3 个功能区组成：两个含正电荷区域（A 盒和 B 盒）和一个呈负电荷的羧基端。HMGB1 作为一种重要的晚期炎性介质,与脓毒症、神经轴突生长、免疫性疾病、恶性肿瘤、缺血再灌注损伤等疾病相关。而 HMGB1 在肿瘤中的作用为现今研究的热点，作为一种潜在的多功能“晚期”炎性介质，HMGB1 被坏死肿瘤细胞释
10、放道微环境中，而细胞外的 HMGB1 可导致慢性炎症/修复性反应，可导致肿瘤细胞的存活、进展及转移8。迄今为止，研究发现9,10多种肿瘤组织和患者血清中均有 HMGB1 的高表达（如结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、头颈部鳞癌、膀胱癌、宫颈癌） ，且其配体 RAGE 在不同的肿瘤细胞中也有表达。给予 HMGB1 或 RAGE 抑制剂，可以明显抑制肿瘤细胞增殖13。HMGB1 并与肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤大小及预后明显相关3,9。而 HMGB1 在肿瘤发生发展中的作用机制目前有以下两种说法12,13：HMGB1 的过表达可致肿瘤表型基因的表达异常，而引起肿瘤；HMGB1
11、的过表达可使获得肿瘤表型的细胞免于凋亡，继续生长，导致肿瘤。原发部位肿瘤细胞分泌 HMGB1 到达区域淋巴结，通过减少巨噬细胞数量削弱淋巴组织的抗转移潜能。HMGB1 通过与其配体 RAGE 结合, 激活了细胞内 JNK 、NF-B p65、和 p42/ p44 、Rac1/Cdc42 等，进而激活 MAPK s, PI3K/Akt, Rho GTP 酶 ,Jak/STAT, and Src family kinases（沉降红细胞家族激酶）等14-16信号传导通路,引起明胶酶 A ( MM P-2) 和明胶酶 B( MMP-9) 的激活,引起纤维蛋白溶酶等系统激活, 使细胞外基质降解, 抑制
12、肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞浸润、转移。迄今为止，关于 HMGB1 与肝癌相关研究的报道少见。Sakuraoka Y4,17等检测结果显示肝癌细胞株 HepG2 中有 RAGE mRNA 及其蛋白的表达，说明 HMGB1 能刺激人肝癌细胞株 HepG2 的生长、增殖。Cheng 等3,18研究发现, 肝细胞癌患者 HMGB1 的血清水平比慢性肝炎及肝硬化患者明显升高, 血清 HMGB1 的表达与肝癌的 TNM 分期、病理学分级及淋巴结转移密切相关，由此可见血清 HMGB1 与肝细胞癌的发生、发展有关。而 HMGB1 在原发性肝细胞癌组织中的发生、发展有着怎样的作用，及HMGBI 与肝细胞癌临床
13、病理特征的具体关系正是我们研究的目的。本研究使用免疫组化及计算机图像分析结果显示，HMGB1 蛋白在肝癌组织中呈过表达，其检测结果与冯华国16的研究一致，提示 HMGB1在原发性肝细胞癌的发病过程中起着关键性的作用。随着肝细胞癌Edmondson 病理学分级增加，HMGB1 蛋白阳性表达增加，有淋巴结转移肝癌患者比无转移者 HMGB1 表达增加，肿瘤包膜不完整比包膜完整者 HMGB1表达增加。笔者认为 HMGB1 在不同病理阶段其在机体含量不同，对肿瘤细胞的促增殖作用不同。而 HMGB1 蛋白表达与肝细胞癌患者年龄、性别及肿瘤大小无相关。本研究首次揭示了 HMGB1 蛋白表达与人肝细胞癌组织
14、Edmondson 病理学分级、包膜完整、淋巴结转移密切相关。提示 HMGB1 在原发性肝细胞癌的发生、发展、浸润和转移中可能发挥了重要作用。HMGB1 可能是原发性肝细胞癌的一种新的潜在的肿瘤特异性标志物。为肝细胞癌分子靶向治疗提供了依据。参考文献：1Stros M. HMGB proteins interactions with DNA and chromatin. Biochim Biophys Acta.2010,1799:101-113.2Increased expression of HMGB1 is associated with poor prognosis in human
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