1、毛冬青酸性、酚性及皂苷类成分分离鉴定作者：曾宪仪，李玉云，徐晓艳，李后如，吴迪，李艳，王丽静【摘要】 目的分离、鉴定毛冬青(Ilex pubescens )中的酸性、酚性、皂苷类化学成分。方法采用水提、醇沉 、醋酸乙酯萃取或乙醇提取，硅胶柱色谱方法进行分离，得到 11 个化学成分，运用 IR、UV、MS、1H-NMR和 13C-NMR 等光谱法鉴定化合物结构。结果分离鉴定了 11 个化合物： 3，4-二羟基苯甲醛 (1);decumbic acid(2);富马酸(3);3，4-二咖啡酰鸡纳酸(4);琥珀酸(5);ilexgenin A(6)，毛冬青皂苷 B1(7);毛冬青皂苷B2(8);毛冬青
2、皂苷甲(9);毛冬青酸(10)和 -谷甾醇(11)。结论化合物25 是首次从该植物中分得，其中化合物 2 为首次从高等植物中获得，化合物 10 是首次从天然产物中获得，根据 DEPT 碳谱，首次对其碳信号进行了归属。 【关键词】 毛冬青; 有机酸; 酚性化合物; 皂苷Abstract：ObjectiveTo isolate acidity,phenolic、tritepene saponins from the roots of Ilex pubescens and to identify their structures.MethodsThe compounds were isolated
3、by solvent extract and silica gel chromatography and their structures were determined by IR, UV, MS,1H NMR,13C NMR etc.ResultsEleven compounds were isolated from Ilex pubescens.They were identified as protocatechuic aldehyde(1)，decumbic acid(2)，fumanric acid(3)，3，4-dicaffeoyl-quinic acid(4)，succinic
4、 acid(5)，ilexgenin A(6)，ilexsaponin B1(7)，ilexsaponin B2(8)， ilexsaponin A1(9)， ilexolic acid(10)and-sitostrol(11).ConclusionCompounds(25)was obtained from the plant for the first time，in which (2)was first isolated from higher plant,and (10)was obtained from the natural product for the first time a
5、nd its 13CNMR signal was assigned by DEPT.Key words： Ilex pubescens; Organic acids; Phenolic; Tritepene saponins毛冬青为冬青科植物毛冬青 Ilex pubescens Hook.et Arn.的干燥根，分布于我国南方各省，它具有活血通脉、 消肿止痛、 清热解毒功效，在临床上主要用于治疗脉管炎和冠心病等，有较好疗效，我们在对其有效成分进行研究时，从根的水提、 醇沉 、醋酸乙酯提取部位，分离到 3 个酸性成分、2 个酚性成分，从根的乙醇提取部位分离到 6 个皂苷类成分。根据其理化性质并综
6、合运用光谱技术分别鉴定为：3，4-二羟基苯甲醛(1);decumbic acid(2);富马酸(3); 3，4-二咖啡酰鸡纳酸(4);琥珀酸(5);ilexgenin A(6)，毛冬青皂苷 B1(7);毛冬青皂苷 B2(8);毛冬青皂苷甲(9),毛冬青酸(10)和 -谷甾醇(11)。化合物(2)(5)是首次从该植物中分得，其中化合物(2)最早是从青霉菌 Penicillum decumbea 的代谢物中得到，此后又从肉桂枝枯病菌 Lasiodiplodia theobromae 的代谢物中获得1，本文是首次从高等植物中获得，化合物(10)是首次从天然产物中获得，结合 DEPT 碳谱，首次对其碳
7、信号进行了归属。1 仪器与材料熔点用 Yanaco 显微熔点仪测定;IR 用 Shimadau-400 或 Spectrum One 红外光谱仪测定;UV 用 PE lambda 12 紫外光谱仪测定; MS 用 VG ZAB-2F 质谱仪测定;HRMS 用 Autospec - UltimaETOF 质谱仪测定;1H-NMR和 13C-NMR 用 INOVA-500、buruck-400、vns-600 核磁共振仪测定。薄层色谱和柱色谱硅胶(160200 目)为青岛海洋化工厂产品。溶剂均为分析纯。实验药材采于江西大茅山，由江西省药物研究所朱良辉副研究员鉴定为毛冬青(Ilex pubescen
8、s Hook.et Arn. )。2 方法2.1 酚酸成分的提取分离取毛冬青根粉碎(25 kg)，加水煎煮 3 次，每次 2 h，合并煎液，浓缩，加入乙醇使含醇量达到 70%，静置，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，用 10%HCl 调 pH 至 3.0，静置，离心。上清液用醋酸乙酯萃取，合并醋酸乙酯液，回收溶剂，残留物用热水提取 5次，合并水提取液，冷藏一夜，滤过，滤液再用醋酸乙酯萃取 5 次，合并萃取液，回收溶剂，得固体物。取固体物上聚酰胺柱层析，依次用水、30%，50%乙醇洗脱，蒸干。水洗部分经硅胶柱层析得成分(2)，(3)，(5);30%洗脱部分经硅胶柱层析和苯重结晶得成分(1)，50%
9、洗脱部分经硅胶柱多次层析得成分(4)。2.2 皂苷的提取分离取毛冬青细枝、叶，0.6 kg，加水煎煮，浓缩，乙醇沉淀，滤过，滤液挥去溶剂，残留物加少量水稀释，用盐酸调pH 至 3，用醋酸乙酯萃取，醋酸乙酯萃取部分回收溶剂后经硅胶柱层析，依次用石油醚醋酸乙酯甲酸(640.01)、(280.01)和醋酸乙酯洗脱，后者得化合物(9)。取毛冬青根 7 kg，粉碎，同上处理，得醋酸乙酯萃取部分，回收溶剂后经硅胶柱层析，石油醚：醋酸乙酯(73)和(11)洗脱，前者得(10)粗品，乙醇重结晶得化合物成分(10)，后者得成分(6)粗品，乙醇重结晶得化合物(6)。取毛冬青根 4.2 kg，粉碎，加80%乙醇回流
10、提取，合并提取液，回收溶剂，残留物离心，取沉淀物进行硅胶柱层析，依次用石油醚 ：醋酸乙酯(82)、(11)和乙醇洗脱，(82)洗脱部分得化合物(11)、(11)洗脱部分得(6)粗品，乙醇重结晶得纯品，乙醇洗脱部分回收溶剂后，经反复柱层析，以醋酸乙酯：甲醇(955)(8020)洗脱，得化合物(7)、(8)。3 结构鉴定3.1 化合物 1 浅黄色片状或针状结晶，mp 155156(毛细管封闭法),三氯化铁和 2，4-二硝基苯肼反应阳性。IRKBrmax (cm-1)：3210(缔合羟基、宽峰)，1650(羰基)，1 590、1 535、1 440(苯环)及870、810、750(苯环芳氢)。UV
11、MeOHmax nm：205，231，280 ，312。MS：m/z 138(M+),137(M-1)，109(M-29),91,81,63,53。1H-NMR (500MHz,CD3OD)：6.85(1H,d,J=8Hz),7.24(2H,m ),9.63(1H,s)。13C-NMR (CD3OD,125MHz) ：115.30，116.22，126.43，130.84，147.21，153.74(苯环)，193.07(醛基)。根据以上理化性质及光谱数据并与 SADTLER 标准光谱比较，鉴定为 3，4-二羟基苯甲醛，即原儿茶醛。3.2 化合物 2 白色结晶，mp 136137;在薄层板上显
12、有机酸反应;IRKBrmax (cm-1)：3 5002 300 (宽峰，缔合-OH)， 1 700(C=O)，1 650(C=C)1 460， 1 410，1 372，1 330，1 190，1 140，1 125，1 038，1 010，940，875，750，700。UVMeOHmax nm：220。 MS m/z： 184(M+)，166(M-18),155(M-29)，142(M-42)，124，113，96，71，67，55。HRMS m/z：184.073 200 (计算值 184.073559)，得分子式 C9H12O4，不饱和度为 4。根据 1H-1H COSY、HMQC，对
13、相关信号进行了归属，1H-NMR(500MHz ,CD3OD) 5.095(1H,br，d，H-4)，1.522(1H，m，H-5)，2.033(1H，m，H-5)，1.361(2H，m，H-6),0.902 (3H，t，J=7.5Hz，H-7) 、2.080(3H，s，H-8);13C-NMR(125MHz，CD3OD)C175.17(C1)137.36(C2)，150.69(C3)，82.99(C4)，35.75(C5)，19.15 (C6)，14.10(C7)，10.66(C8)，164.79(C9)。以上理化性质及光谱数据与文献1中 decumbic acid 一致，故鉴定为 decu
14、mbic acid。3.3 化合物 3 白色结晶，200以上升华。在薄层板上显有机酸反应。IR KBrmax (cm-1)：3 080(宽峰，缔合 -OH),1 680 (-COOH)。UV MeOHmaxnm：211 。MS m/z： 116(M+)，98(M-18)，88(M-28)，81，72，53。1H-NMR(500MHz，CD3OD) 6.697。 13C NMR(125MHz，CD3OD) 135.185，168.036。 根据以上理化性质及光谱数据并与 SADTLER 标准光谱比较，鉴定为富马酸，即反式丁烯二酸。3.4 化合物 4 浅黄色颗粒，IRKBrmax(cm-1)：3
15、360(OH)，1 700(-COOH)， 1 595， 1 520(Ar)，1 442，1 350，1 270，1 150，1 030，970。UVMeOH max nm：210，235，245，300，328。MS m/z： 539M+Na+， 517M+1，499。1H-NMR(500MHz ,CD3OD)：6.14、6.24(21H,d，J=16.0， C8-H),6.68，6.69(21H,d，J=8.0, C5- H)，6.85,6.86(21H,dd，J=8.0, J=2.0, C6-H), 6.94, 6.96(21H,d， J=2.0, C2-H),7.47,7.55(21H
16、, d，J=16.0，C7-H)，2.04(1H,dd，J=14.0，4.0，C6-H),2.162.20(2H,m，C2-H), 2.25(1H,dd，J=14.0，4.0，C6-H),4.31(1H,，dd,J=8.5，3.0，C5-H), 5.06(1H,dd,J=8.5，3.0，C4-H),5.55(1H,m， C3-H)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz),鸡纳酸部分 :C1 75.95， C2(39.24 或 38.37)，C3(68.97)，C4( 69.22)，C5(75.60)，C6( 39.24)，176.73 为 C1 上的 -COOH, 咖啡酸部分：C1 (
17、123.16),C2( 114.65)，C3(149.70)，C4(146.78)，C5(115.12)， C6(127.63)，C7(147.73 或 147.61)， C8(114.70 或 116.46)，C9(168.55 或 168.20)。以上数据与文献2 中 3，4-二咖啡酰鸡纳酸一致，故鉴定为 3，4-二咖啡酰鸡纳酸。3.5 化合物 5 白色结晶，mp 191193;在薄层板上显有机酸反应;IRKBrmax (cm-1)：3 6002 300(宽峰，缔合-OH)， 1 680(C=O) ，1 410，1 300，1 195。根据以上理化性质及红外光谱数据，并与 SADTLER
18、标准光谱比较，鉴定为丁二酸，即琥珀酸。3.6 化合物 6 无定形粉末，mp 300;可溶于甲醇、乙醇。IRKBrmax (cm-1)：3 450(-OH), 2 931，1 690(C=O)，1 647, (C=C)，1 455，1 384，1 252，1 157，1 044，769。UVMeOHmax nm：205。FABMS m/z：525(M+Na)+，483(M-H-H2O)，438(M-HCOOH-H2O)。1H-NMR (400 MHz, C5D5N)：1.13(3H,s，Me)，1.16(3H,s.Me)，1.46(3H,s.Me)，1.71 (3H,s.Me)，1.76(3H,
19、s.Me)，1.11(3H,d，J=6.4,Me),3.06(1H,s,H-18),3.35(1H, dd,J=11.6,4.3,H-3)，5.11(1H,br,s,19-OH,重水交换消失)，5.62(br,t,H-12)。13C-NMR (100MHz, C5D5N)见表 1。以上数据及理化性质与文献3中 ilexgenin A 一致，故鉴定为 ilexgenin A。3.7 化合物 7 无色细小针晶，mp243244;可溶于甲醇、乙醇。IR KBrmax (cm-1)：3 436(-OH), 2 928，1 697(C=O)，1 637, (C=C)，1 456，1 370，1 167，
20、1 071，1 041，762。 FABMS m/z：789(M+Na)+， 455，437。1H-NMR(400MHz,C5D5N)：0.88(3H,s，Me)，1.08(3H,s.Me)，1.09(3H,s.Me)，1.12(3H，d，J=7,Me)，1.25(3H,s,Me)，1.42(3H,s，Me),1.74(3H,s. Me),3.28(s,H-18),4.81(1H,d,J=7,Xyl-H-1)，5.05(s,19-OH，重水交换消失)，5.35(1H,d,J=7.5,Glu-H-1)，5.54(1H,t, H-12)。 13C-NMR (100MHz,C5D5N)见表 1。 以
21、上数据及理化性质与文献3中 ilexsaponin B1 一致，故鉴定为毛冬青皂苷 B1(ilexsaponin B1)。3.8 化合物 8 白色无定形粉末，可溶于甲醇、乙醇。IR KBrmax(cm-1)：3 436(-OH), 2 927，1 697(C=O)，1 637, (C=C)，1 456，1 387，1 075，1 041，985，813，763。 FABMS m/z：935(M+Na)+;1H-NMR(400MHz,C5D5N)：0.83(3H,s，Me)，1.06(3H,s.Me)，1.32(3H,s.Me)，1.41(3H,s，Me)，1.74(3H，s，Me)，1.11(
22、3H,d,J=7.2,Me)，1.77(3H,d,J=6.4，rha-Me),3.3(1H,s,H-18),4.89(1H,d, J=5.4, Xyl-H-1)，5.04(1H,s,19-OH，), 5.53 (1H,br，t, H-12)，5.80(1H,d,J=7.6,Glu-H-1),6.40(1H, br，s, rha-1-H)。13C-NMR (100MHz, C5D5N,)见表 1。 以上数据及理化性质与文献3中 ilexsaponin B2 一致，故鉴定为毛冬青皂苷 B2(ilexsaponin B2)。3.9 化合物 9 白色无定形粉末，mp290291;可溶于甲醇、乙醇。Li
23、ebermann- burcharde 试验和 -萘酚试验均呈阳性，IRKBrmax (cm-1)：3 400(-OH), 2 925，1 720(C=O)，1 630,(C=C)，1 443，1 380，1 060， 1 020，985，790，755。FABMS m/z：687(M+Na) +。酸水解检查出葡萄糖，苷元部分 TLC 与化合物 6 薄层色谱行为一致，根据以上数据及理化性质并与文献3比较，鉴定为毛冬青皂苷甲(ilexsaponin A1)。3.10 化合物 10 白色细针状结晶，mp281283;可溶于甲醇、乙醇、氯仿等。Liebermann- burcharde 试验呈阳性，
24、IRKBrmax(cm-1)：3443(-OH), 2 933，1 692(C=O)，1 649, (C=C),1452，1372 1278， 1 035，999。UV MeOHmax nm 234(7431)。EIMS m/z：454(M+)，436(M-H2O)，408(M-HCOOH)，390(95)(M -HCOOH，-H2O)，375，347，246，231，207，201，189，187，185(100)，145，119，55。1H-NMR(600MHz， CDCl3)：0.79(3H,s，Me)，0.90(3H,s.Me)，0.97(3H,s.Me)，0.99(6H,s，2Me)
25、，1.04(3H，d，J=6.6,Me-CH)，1.73(3H,s, Me-C=)，3.23(1H,dd,J=10.8,4.8,C3-H),5.41(1H,宽 s,C12-H)。以上数据与文献 4中毛冬青苷甲的苷元数据基本一致，又根据 DEPT 碳谱数据，以乌索酸及其甲酯为基本母核对其碳信号进行归属，13C-NMR(600MHz，CDCl3)数据见表 1。根据以上数据，鉴定(10)为毛冬青酸(ilexolic acid)，即(18-去氢-20-表-乌索酸)。经查文献，本品为首次从天然产物中获得，为了检测其在天然产物中的存在，取毛冬青根，加水煎煮，浓缩，乙醇沉淀，滤过，滤液挥去溶剂，残留物加少量
26、水稀释，用醋酸乙酯萃取，回收溶剂后，残留物以甲醇溶解，0.45 m 微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液，另取结晶 10 用甲醇制成每 1 ml 含约 0.1 mg 的溶液，作为对照品溶液，以乙腈甲醇水乙酸铵(7016140.5)为流动相，以高效液相色谱法检测，检测波长 234 nm，结果在供试品色谱中在与对照品相同的保留时间处检测到色谱峰。3.11 化合物 11 无色针晶，mp 139141 ;ESI/Ms 测得 M+Na 峰437 和 M-H 峰 413，与已知品 -谷甾醇共薄层色谱，Rf 值和色斑一致，IR 与 The acdrich library infrared spectra 中 -
27、谷甾醇一致，故鉴定为 -谷甾醇。表 1 化合物 68、10 的 13C-NMR 数据【参考文献】1 G.he，H.matsuura，T.yoshihara. Isolation of an -methylene- -butyrolactone derivative,a toxin from the plant pathogen Lasiodiplodia theobromae J.Phytochemistry 2004,65：2803.2 秦文娟，吴秀娥，福山爱保，等.苦丁茶化学成分研究() J.中草药，1988，19：486.3 冯 峰，朱明晓，谢 宁.毛冬青化学成分研究 J中国中药杂志，2008，43(10)：732.4 蒋仲芳，黄柔湘，秦国伟，等 .毛冬青化学成分的研究 四种三萜皂甙的分离和鉴定 J.中草药，1991，22(7)：291.
