1、人 CTLA4Ig 基因重组腺病毒载体的构建及鉴定【摘要】 目的： 用 AdEasy 腺病毒载体系统构建 CTLA4Ig 重组腺病毒，以感染树突状细胞使其递呈抗原至 T 淋巴细胞功能受阻. 方法： 双酶切、凝胶回收方法从质粒 pCDM8CTLA4Ig 提取目的基因 CTLA4Ig，构建成腺病毒穿梭质粒 pAdTrackCTLA4Ig ；经酶切线性化后的pAdTrackCTLA4Ig 与 AdEasy1 进行同源重组，经酶切线性化转染入HEK293 细胞进行包装. 结果：卡那霉素抗性筛选和 Pac酶切确证重组腺病毒质粒 pAdCTLA4Ig, Pac酶切产生 30 kb 和 4.5 kb 2 个
2、片断为同源重组. 重组腺病毒质粒经 293 细胞包装后可观察到绿色荧光，收获病毒并制备出高滴度重组腺病毒（病毒滴度为 1.6109）. 结论： 成功构建了携带 CTLA4Ig 基因的重组腺病毒载体，为利用 CTLA4Ig 基因转染树突状细胞的基因治疗奠定了基础. 【关键词】 CTLA4Ig 基因；腺病毒科；遗传工程 【Abstract】 AIM: To construct recombinant adenovirus vector carrying the human cytotoxic lymphocyte antigen 4 immunoglobulin (CTLA4Ig) gene an
3、d amplify the adenovirus vector in HEK293 cells, and then to infect dendritic cells to block the submission of antigen from dendritic cells to T lymphocytes. METHODS: CTLA4Ig gene with the suitable enzyme site was doubledigested with restrictive endonucleases HindIII and XbaI from pCDM8CTLA4Ig vecto
4、r, then subcloned into the shuttle plasmid pAdTrackCMV after digested by the same enzyme. The recombinant plasmid pAdTrackCTLA4Ig linearized by PmeI, was chemically transfected into E. coli BJ5183 cells that had been chemically transfected with adenovirus backbone plasmid pAdEasy1. Finally, the line
5、arized recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells. RESULTS: Recombinants were selected by kanamycin resistence and confirmed by PacI. The restrictive endonuclease analysis confirmed that correct recombinant adenovirus plasmid was constructed(30 kb and 4.5 kb fragments were dotained after
6、PacI digestion). Twentyfour hours after transfection, the fluorescence was observed in 293 cells, and viral tite was checked by GFP(1.6109). CONCLUSION: The recombinant adenoviral vector containing CTLA4Ig gene has been successfully constructed, which offers a basis for the gene therapy of CTLA4Ig i
7、nfecting the dentritic cells. 【Keywords】 CTLA4Ig; adenoviridae; genetic engineering 0 引言 近年来食物过敏的患病率逐年上升，治疗食物过敏唯一有效的措施是严格避免特定食物抗原的摄入. 然而，引起婴儿过敏的食物往往是婴儿食物的主要来源，严格的食物回避可造成婴幼儿营养不良. 因此，预防和治疗是研究食物过敏的两个重要方向. 食物过敏的发生机制主要是食物抗原到达肠黏膜经树突状细胞递呈至 T 细胞导致局部 T 细胞活化. T 细胞的活化是第一信号（TCR/MHCAg)及辅助刺激信号共同作用的结果,肠道黏膜内 T 细胞的异
8、常活化导致特异性 IgE 产生增多1. 目前食物过敏治疗方法研究包括经典的治疗方法、重组蛋白突变免疫疗法、抗 IgE 抗体疗法以及基因疗法等，目的均为减少特异性 IgE 的产生，但并未阻断过敏反应产生. 如果能中断食物抗原在肠道树突状细胞的递呈，即若树突状细胞表达跨膜蛋白细胞毒性淋巴细胞抗原 4 免疫球蛋白（cytotoxic lymphocyte antigen 4 immunoglobulin, CTLA4Ig） ，与树突状细胞表面分子 B7 结合，即可阻断T 细胞表面分子 CD28 与 B7 结合，降低 T 细胞的活化，则可能阻断过敏反应产生. 本研究拟构建可转染树突状细胞的表达 CTL
9、A4Ig 的腺病毒体系2-3. 1 材料和方法 1.1 材料 质粒 pCDM8CTLA4Ig(Hind, Xba)（第三军医大学烧伤外科研究所罗高兴博士惠赠） ，穿梭质粒 pAdTrackCMV 及骨架质粒pAdEasy1 （芝加哥大学 TC. He 博士惠赠） ，大肠杆菌BJ5183、DH5（重庆医科大学病毒性肝炎研究所） ，PCR 试剂盒,DNA Ligation Kit 试剂盒、限制性内切酶 Hind, Xba, Trizol 试剂、小量质粒提取试剂盒,DNA 片断纯化试剂盒（TaKaRa 公司） ，限制性内切酶Pac, Pme（NEB 公司） ，LipofectamineTM 2000
10、（Invitrogen 公司） ，PCR 引物由上海鼎安生物技术有限公司合成，CTLA4Ig 引物序列为上游：5ATGGGTGTACTGCTCACACAG3；下游为：5TCATTTACCCGGAGACAGG3. 1.2 方法4 1.2.1 双酶切法质粒 pCDM8CTLA4Ig 被在大肠杆菌中扩增后，以Hind和 Xba双酶切获与理论片断相符的 CTLA4Ig 片断，用凝胶回收试剂盒回收；腺病毒穿梭质粒载体 pAdTrackCMV 被 Hind和 Xba双酶切后呈开环状，在 16下与回收的 CTLA4Ig 片断经 DNA Ligation Kit 连接. 连接后产物被转化至大肠杆菌 DH5，提
11、取的质粒pAdTrackCTLA4Ig 以 Hind和 Xba双酶切后鉴定. 1.2.2 转化将骨架质粒 pAdEasy1 转化至 BJ5183, 并制备 BJ AdEasy1 的感受态，经 Pme单酶切的 pAdTrackCTLA4Ig 加入BJAdEasy1 感受态进行转化，提取的质粒经 PacI 单酶切鉴定. 1.2.3 转染、包装 1.2.3.1HEK293 细胞的培养 HEK293（人胚肾）细胞于含 100 mL/L 胎牛血清的 1640 培养基，37, 50 mL/L CO2 孵箱中培养. 转染时细胞应融合至 7080. 1.2.3.2 重组腺病毒转染、包装重组质粒 pAdCTLA
12、4Ig 4 g 经Pac酶切线性化，经 LipofectamineTM 2000 介导转染 25 cm2 培养瓶中的 HEK293 细胞，于 37, 50 mL/L CO2 孵箱中孵育，转染后 110 d 连续观察绿色荧光蛋白的表达. 1.2.3.3 重组腺病毒的提取、再次感染收集出现病变的 293 细胞及培养液，800 r/min,离心 5 min 弃上清，以 1 mL PBS 重悬细胞，液氮/37反复冻融 3 次，离心后吸取上清，用 0.22 m 滤器过滤除菌，即可得到病毒原液. 取病毒原液 200 L 再次感染 293 细胞提高病毒滴度. 收集方法同前. 1.2.4 重组腺病毒滴度测定将
13、 293 细胞按 1.5105 细胞/孔接种 6 孔板中，待 24 h 后感染病毒；取病毒原液作不同比例稀释（110311010） ，每种浓度做三个复孔；按每孔 400 L 加病毒稀释液至 293 细胞培养板中，放置 37，吸附 46 h；换新鲜培养基，继续培养 24 h，于荧光显微镜下计数 GFP 阳性细胞数. 按下列公式分别计算两种重组腺病毒的滴度：病毒滴度(pfu/mL)=GFP 细胞阳性数病毒上清稀释倍数(pfu/mL)/0.4 mL 1.2.5PCR 反应鉴定及测序连接的质粒 pAdTrackCTLA4Ig, 293 细胞包装成功的腺病毒 AdCTLA4Ig 进行 PCR 反应，1
14、g/L 琼脂糖凝胶电泳，并送重庆医科大学感染病研究所测序. 2 结果 2.1 目的基因 CTLA4Ig 的酶切、鉴定与回收质粒 pCDM8CTLA4Ig 经Hind和 Xba双酶切后获得目的基因 CTLA4Ig，经 10 g/L 的琼脂糖凝胶电泳鉴定，第 1, 2, 3 泳道均可见到目的基因片断 CTLA4Ig 约 1200 bp（图 1）. 对双酶切后的目的基因片断 CTLA4Ig 进行凝胶回收. 2.2 穿梭质粒 pAdTrackCTLA4Ig 的构建与鉴定及基因测序 Hind和 Xba双酶切 pAdTrackCMV ，纯化后与回收的目的基因 CTLA4Ig 连接；挑取菌落，提取质粒，再以
15、 Hind和 Xba双酶切，经 8 g/L 琼脂糖凝胶电泳，第 1,8 泳道出现 1200 bp 左右大小条带的克隆（图 2） ，经 PCR鉴定出现目的条带（图 3）. CTLA4Ig 基因测序结果有 2 个碱基发生突变，尚无氨基酸的改变. 2.3 重组腺病毒质粒 pAdCTLA4Ig 的构建及鉴定pAdTrackCTLA4Ig 和 pAdEasy1 同源重组后挑选电泳条带较pAdEasy1 大质粒 Pac酶切后于 5 g/L 琼脂糖凝胶电泳出现 4.5 kb 和30 kb 左右两条条带，与理论上 Pac酶切后出现 4.5 kb 或 3.0 kb 和 30 kb 左右两条条带相符（图 4）.
16、2.4 重组腺病毒转染 HEK293 细胞测定将重组腺病毒 pAdCTLA4Ig 质粒用 Pac酶切线性化后转染 HEK293 细胞，转染 24 h 后，即可于倒置荧光显微镜下观察到散在少量明亮的绿色荧光表达（图 5A） ，随时间的延长荧光量逐渐增加. 至 67 d 绿色荧光斑点最多（图 5B）. 待培养至 10 d 左右细胞呈空泡样病变并逐渐呈悬浮生长时收获病毒上清，并再次感染HEK293 细胞，将重组腺病毒在 HEK293 细胞大量扩增后，收集病毒上清. 病毒上清中为感染性重组腺病毒，提取病毒 DNA，经 PCR 反应扩增可出现特异的目的基因片断（图 3）. 2.5 重组腺病毒滴度测定重组
17、腺病毒经测定病毒滴度为 1.6109, 说明病毒滴度较高，可满足在体基因治疗的需要，且纯度较高. 3 讨论 3.1T 细胞活化抑制食物过敏主要是由 T 细胞介导的免疫反应. 抗原特异性 T 细胞的活化需要共刺激信号的参与. 目前已发现多种辅助刺激信号系统，如 B7/CD28CTLA4 系统、CD40/CD40L 系统、CD95（Fas）FasL 系统等. 但在所有辅助刺激信号途径中，B7/CD28CTLA4 系统被认为是最重要的辅助刺激信号系统5-6. B7 与 CD28 的结合是引起 T 细胞活化的必需条件，而 CTLA4 是细胞毒性 T 淋巴细胞中特异性抗原基因编码的糖蛋白，其胞外段的主要
18、功能是与 B7 结合，其功能是抑制 T 细胞的活化. 1992 年 Linesly 等首先将人CTLA4 胞外段第 1125 氨基酸与人 IgG Fc 段的 CH2, CH3 及 区的相应基因融合，并将其命名为 CTLA4Ig. 因 CTLA4 为免疫球蛋白超家族成员，当其胞外段与 IgG Fc 段融合后，能较好的维持分子的完整性及空间构象，从而保证与 B7 分子结合等功能3-4. CTLA4 与 B7 的结合力比 CD28强 20100 倍2. 本文研制阻断 B7CD28 途径的 CTLA4 胞外段制剂，以阻断 T 细胞活化中的 B7CD28 途径，进而阻断 T 细胞的完全活化，为免疫治疗食
19、物过敏的另一途径. 3.2 载体的选择常用转染基因的载体有质粒和病毒两种. 质粒载体往往转染后在细胞内存活时间过短，表达不稳定，现已不为首选. 转染基因的病毒载体有逆转录病毒和重组腺病毒. 因重组腺病毒载体在体内外均有较高的转染效率，可同时感染静止期和分裂期细胞，腺病毒通过与细胞表面受体结合将其基因组有效导入宿主细胞，腺病毒基因组不整合到宿主细胞基因组中，而使宿主的遗传特性不发生改变. 因此利用腺病毒载体进行目的基因转运，被用于多种疾病的基因治疗具有显著的优势7-8. 1995 年 Kay MA 等采用细胞内同源重组的方法将人 CTLA4Ig 构建到腺病毒载体上9. 因通常细胞内同源重组的重组
20、及扩增效率均较低，鉴定重组腺病毒载体需同时用 PCR 及 ELISA 两种方法，费时、操作较为繁琐. 1998 年 He 等建立的重组腺病毒载体 AdEasy 系统，将穿梭质粒pAdTrackCMV 与骨架质粒 AdEasy1 在大肠杆菌 BJ5183 内进行同源重组，然后用 293 细胞包装产生完整的重组腺病毒. 这种细菌内同源重组较以往的细胞内同源重组法重组及扩增效率高，且更为方便、快速. AdEasy 系统还可表达绿色荧光蛋白，可作为转染成功的一个直接标志，方便了对转染细胞的筛选4. 本实验采用这种新型的重组腺病毒载体AdEasy 系统，将目的基因 CTLA4Ig 构建到重组腺病毒载体上
21、. CTLA4Ig基因测序结果显示仅 2 个碱基发生突变，未产生氨基酸的改变，即无义突变，不影响蛋白的表达及其功能. 3.3 重组腺病毒鉴定重组腺病毒载体 AdEasy 系统构建的三个关键步骤均需鉴定，通常在前两步采用酶切法与 PCR 法鉴定，通常采用绿色荧光蛋白标记和 PCR 扩增出目的基因相结合的方法从蛋白水平和基因水平鉴定 293 细胞包装. 本实验成功地将 CTLA4Ig 基因构建到腺病毒载体上，拟通过腺病毒载体将 CTLA4Ig 基因转染到树突状细胞，使树突状细胞表达 CTLA4Ig 蛋白从而阻断 B7 与 CD28 的结合，为后期阻断 T 细胞活化治疗食物过敏的研究奠定了基础. 基
22、金项目：国家自然科学基金（30400408） 【参考文献】 1Piconi S, Trabattoni D, Saresella M, et al. Effects of specific immunotherapy on the B7 family of costimulatory molecules in allergic inflammationJ. J Immunol, 2007,178(3):1931-1937. 2Ellis JH, Burden MN, Vinogradov DV, et al. Interactions of CD80 and CD86 with CD28 an
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25、r immunotherapy using virally transduced dendritic cells. Animal studies and human clinical trialsJ. Expert Rev Vaccines, 2006 Oct;5(5):717-732. 8陈陵，蔡永国，梁光萍，等. 负载 hTERT 复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定J. 第四军医大学学报，2006,27(1):53. 9Kay MA, Holterman AX, Meuse L, et, al. Longterm hepatic adenovirusmediated gene expression in mice following CTLA4Ig administrationJ. Nat Genet, 1995,11(2):191-197.
