1、应用 SELDI-TOF-MS 技术建立肝细胞癌病人血清蛋白质指纹图谱筛选模型作者：闫志勇 刘华 丁守怡 宋旭霞 钱冬萌 田字彬 王斌 【关键词】 肝肿瘤;肽谱;蛋白质工程 摘要目的 研究肝细胞癌（HCC）病人、乙型肝炎病毒（HBV）携带者、健康人血清蛋白质表达的差异，以建立 HCC 血清蛋白质指纹图谱筛选模型。方法 用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-MS）获得 HCC 病人、HBV 携带者及健康人血清中的蛋白质指纹图谱，用计算机软件比较分析，并建立 HCC 的血清蛋白质指纹图谱模型筛选模型。结果 HCC 组与非肿瘤组共有 11 种蛋白质有显著性差异;以其中 4 种蛋
2、白质生物标志物（相对分子质量 3 448、6 883、4 467 和 3 134）组建的筛选模型检测灵敏度为 94.6%，特异度为 92.3%。结论建立的血清 蛋白质指纹图谱模型能够区分 HBV 携带者与 HCC 病人，SELDI-TOF-MS 在HCC 的诊断及肿瘤特异性蛋白质生物标志分子的筛选等方面具有一定价值。关键词 肝肿瘤;肽谱;蛋白质工程 ABSTRACTObjectiveTo establish a serum proteomic pattern and study the differences of serum protein spectra of pa-tients with
3、 hepatocellular carcinoma （HCC） ， of HBV carriers and of healthy controls. MethodsProteomic spectra of HCC and age and sex-matched non-HCC controls， including HBsAg carriers and healthy peoples， were generated by surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （SELDI-TO
4、F-MS） on WCX-2 chips. Ciphergen software was used to identi-fy proteomic features， and Biomaker Wizard software to detect the differences in protein peaks between HCC and non-HCC con-trols， and then to set up a serum biomarker pattern to screen the HCC. ResultsEleven proteins were significantly diff
5、erent be-tween HCC and non-HCC controls， among which， four （ m/z 3 448、6 883、4 467 and 3 134） were selected to set up a optimal serum biomarker pattern. This proteomic pattern yielded a high sensitivity （94.6%） and specificity （92.3%）. ConclusionThe estab-lished serum proteomic pattern can distingui
6、sh the HCC cases from non-HCC ones， and the proteomics approach of SELDI-TOF-MS can greatly facilitate the discovery of new tumor biomarkers. KEY WORDSliver neoplasm; peptide mapping; protein engineering 原发性肝细胞癌（HCC）是我国常见的恶性肿瘤，居癌症死因第 2 位，造成其高病死率的主要原因是目前尚缺乏特异性高的早期诊断方法，由于 HCC 病人早期常无症状，发现时已属中、晚期，丧失了治疗的
7、最佳时机1 。HCC 的发生是一个多因素诱导、多基因突变的漫长的多阶段过程，其中乙型肝炎病毒（HBV）的感染在 HCC 发生过程中具有重要作用。研究发现，90%的 HCC 与 HBV 感染有关2 。任何疾病在出现病理变化之前，细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应改变，并通过血清中的蛋 白质模式反映出来。因此，通过比较不同疾病人群血清中差异蛋白质的表达，可能筛选出肿瘤相关的标志分子。最近几年出现的表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-MS）是蛋白质组学研究中重要的工具，已开始应用于肿瘤早期诊断的生物标志物的筛选38 。本研究利用该技术比较了 HCC 病人、HBsAg 携带者
8、及健康人血清蛋白质表达的差异，对建立 HCC 血清蛋白质指纹图谱筛选模型进行了初步探讨。 1 资料和方法 1.1 病例选择 HCC 病人 37 例，为 2003 年 9 月2005 年 10 月青岛大学医学院附属医院经临床病理确诊且未经治疗的新发病例，其中男 22例，女 15 例; 年龄 3570 岁，中位年龄 56 岁。另外，选择性别、年龄匹配的 HBsAg 携带者 27 例（HBV 组）和健康者 25 例（健康组）作为对照（非肿瘤组） 。 1.2 仪器和试剂 NaAc、尿素、水（HPLC 级） 、乙氰、三氟乙酸、SPA（Sinapinicacid） 、Triton、Tris-Cl 均购自美
9、国 Sigma 公司;蛋白质芯片时间质谱分析仪（PBSC） 、WCX-2 弱阳离子交换蛋白质芯片和 All-in-one 标准蛋白质 NP20 校正芯片为美国 Ciphergen Bio-systems 公司产品。 1.3 方法 1.3.1 血清采集和处理 采集全血 45 mL 于洁净试管中，立即放入4 冰箱静置 4 h，4 3 000 r/min 离心 20 min 分离血清，分装后置入-86 冰箱保存备用。实验前取出血清样品置冰上融化，4 下 12 000 r/min 离心 10 min 去除沉淀;然后取 10 L 血 清加入 20 L U9缓冲液混匀，冰浴 300 r/min 振荡 30
10、 min，加入 360 L WCX-2 缓冲液冰上迅速混匀备用。 1.3.2 芯片的预处理和样品的检测 将芯片装入生物芯片处理器中，每孔加入 200 L WCX-2 缓冲液，300 r/min 振荡 5 min，弃缓冲液重复操作 1 次后，每孔中加入 100 L 上述处理好的血清样品 300 r/ min 振荡 1 h，弃样品，加 200 L WCX-2 缓冲液室温 300 r/min 振荡洗涤芯片5 min，共 2 次;加入 200 L HEPES（1 mmol/L，pH 4.0）后立刻甩出。取出芯片，干燥后立刻在每点加 SPA 0.5 L，干燥后重复 1 次。 1.3.3 数据采集和 HC
11、C 蛋白质指纹图谱筛选模型的建立 设置激光强度为 210，检测敏感度为 9，优化相对分子质量范围为 210 000，最高相对分子质量为 50 000，每点在不同位置共采集数据 130 次，用 PBSC型质谱分析仪和 Ciphergen proteinchip 3.1 软件读取数据。数据采集前用 All-in-one NP20 蛋白质标准芯片校正仪器。将获得的蛋白质图谱去除背景噪声，并用内参照法标准化。用 Biomarker Wizard 软件计算HCC 组和非肿瘤组各蛋白峰值的差异，将此组数据进行转换，用 BPS 5.1软件建立最佳筛选模型。 2 结果 2.1 HCC 组与非肿瘤组血清蛋白质谱
12、的差异比较 用 Ciphergen software 系统在相对分子质量为 250 000 范围内对 3 组样品进行质谱分析，用 Bio-marker Wizard 软件对相对分子质量及能量校正后共获得96 个有效蛋白质峰，其中相对分子质量为 7 771 的 蛋白峰在 3 组中表达均有差异（图 1） ，据其相对分子质量在蛋白库中（http/us.expasy.org/tools/tagident.html）检索，发现其与血小板因子-4 前体相对分子质量相符。HCC 组与非肿瘤组进行比较，共发现相对分子质量 3 377、3 448、3 890、4 467、6 884、7 771、7 934、8
13、142、8 566、10 267、13 756 等 11 个蛋白峰有差异。 图 1 部分 HCC 病例、HBV 携带者和健康组的差异表达蛋白（略） 相对分子质量为 7 771 的蛋白峰在健康组高表达，HCC 组低表达，而 HBV 组未见表达 2.2 HCC 血清蛋白质指纹图谱筛选模型 利用 BPS 5.1 软件对上述 96个峰的图谱进行分析，建立了可通过相对分子质量为 3 448、6 883、 4 467 和 3 134 的 4 种 蛋白质生物标志物来区分 HCC 和非 HCC 的筛选模型（图 2） 。如图所示，节点（Node）1 为根节点，如果样本中相对分子质量为 3 448 的蛋白质相对含
14、量0.742 则被划分到左侧的 Node 2 中，反之则被划分到 Node 4 中。依次类推，最终获得 5 个终节点（termi-nal node） ，其中终节点 1、2、4 为 HCC 病人，而终节点 2、5 为非肿瘤组。该分类树模型在建立时，37 例 HCC 中 35 例区分正确，52 例非 HCC 标本中有 4 例被错划为癌症。HCC 筛选的灵敏度为 94.6% ， 特异度为 92.3%。图 2 HCC 的血清蛋白质指纹图谱筛选 BPS 分类树模型（略） M 为用以分类的标志分子的相对分子质量， n 为样本例数 3 讨论 HCC 的发生是一个多因素诱导、多基因突变的漫长的多阶段过程，其中
15、 HBV 的感染在 HCC 发生过程中具有重要的意义。在肝细胞癌变过程中，某些癌变相关的基因表达异常，合成并分泌一些微量蛋白进入外周血，这些微量蛋白通常难以检测到或处于极低水平。临床上现有的 HCC 标志物众多，尚无单一标志物能够诊断所有 HCC。敏感而特异的标志物如AFP-L3，HCC 特异性 GGT 和 TGF- 等，它们之间或无相关性，或起互补作用，这就需要探索一种新的技术以发现早期肿瘤标志物。SELDI-TOF-MS 是近年来发展起来的有效的差异蛋白质组学研究技术，主要结合了质谱、层析等技术，能对血清、尿液等原始样品进行大规模检测，具有高分辨力、高重复性及操作简便等优点，而且所需样品量
16、少，在蛋白质组学研究中得到越来越广泛的应用。尤其是在筛选肿瘤标志物中，用该技术将病人与正常人或其他某种疾病病人的图谱进行比较 分析，能够发现新的、特异性肿瘤等疾病的相关蛋白，并快速获得其蛋白质组学信息3 。目前报道用该技术已经发现了膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、乳癌、肺癌等多种肿瘤的新的肿瘤特异性标志分子46 。 本研究用 SELDI-TOF-MS 蛋白芯片技术对新发 HCC 病人组和非肿瘤组进行蛋白质谱比较，共发现有 11 种蛋白分子的相对质量差异有显著性;建立的 HCC 血清蛋白质指纹图谱模筛选模型利用 4 种蛋白质生物标志分子即可进行 HCC 的筛选，灵敏度为 94.6%，特异度为 92.3
17、%。由于本研究中血清采集和处理要求较高，故可以用于分析的样本例数相对较少，有待在今后的研究中进一步扩大样本量。同时对 HCC 发展不同阶段、不同类型病人的血清进行分析，以期发现 HCC 分期分类的标志分子，这将有助于了解 HCC 的发生及预后判断。本研究表明，SELDI-TOF-MS 结合生物信息学技术可检测出HCC 病人血清中肿瘤特异性蛋白质图谱，可以作为潜在的临床筛选方法，有高度敏感性和特异性，具有广阔的临床应用前景。 参考文献 1 COLEMAN W B. Mechanisms of human hepatocarcinogenesisJ. Curr Mol Med， 2003，3:57
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