1、中药止哮平喘方抗哮喘豚鼠模型气道炎症的实验研究作者：胡作为，周电光，周燕萍，王鹏 【关键词】 止哮平喘方 摘要：【目的】探讨中药止哮平喘方(主要由法半夏、瓜蒌皮、薤白、白芍、柴胡、黄芩、麻黄、枳壳、射干、甘草等中药组成)对哮喘豚鼠模型气道炎症的影响。 【方法】复制卵蛋白致敏哮喘模型，观察支气管及肺的病理学改变；测量全血及肺泡灌洗液(BALF)中血细胞计数；免疫组织化学法测定外周血单核细胞(PBMC)中 CD、CDT 细胞的含量。 【结果】病理研究显示哮喘模型组豚鼠气道周围大量炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞(EOS)和淋巴细胞为主。哮喘模型组全血及 BALF 中炎性细胞数显著高于正常组(001)；
2、中药大剂量组和西药对照组炎性细胞数均显著降低(005 或001)。哮喘模型组 CDT 细胞高于正常组(005)；中药大剂量组和西药对照组 CDT 细胞均有下降(与哮喘模型组比较，005)。 【结论】中药止哮平喘方能降低气道及外周血炎性细胞的数量，具有抗气道炎症的作用；降低 CD细胞数量，相对增加 CD8T 细胞，使 CD4/CD8 恢复正常状态，从而起到调节其紊乱的免疫功能状态的作用，这可能是止哮平喘方抗气道炎症的作用机理之一。 关键词：止哮平喘方/药理学；哮喘/病理学；哮喘/免疫学；嗜酸性细胞； CD4 阳性 T 淋巴细胞； CD8 阳性 T 淋巴细胞；瓜蒌薤白半夏汤/药理学；小柴胡汤/药理
3、学；芍药甘草汤/药理学 支气管哮喘是以嗜酸细胞、淋巴细胞等浸润为主的气道慢性变态反应性炎症，其中淋巴细胞尤其是 T 淋巴细胞活化起关键作用。现代医学对哮喘的治疗仍然首选糖皮质激素全身或局部用药，但长期应用副作用明显。中药止哮平喘方是王鹏教授多年诊治支气管哮喘的经验方，有宽胸理气、通阳散结、化痰解痉等作用，临床疗效确切。为探讨支气管哮喘气道炎症的病理学特征和止哮平喘方抗气道炎症的作用机制，本实验采用全血及肺泡灌洗液(BALF)中细胞学分析及免疫组织化学方法，评价中药止哮平喘方对哮喘气道炎症的影响及对 TH1/TH2 型细胞的作用。 1 材料与方法 11 主要试剂及仪器 卵蛋白由 Sigma 公司
4、出品(进口分装)；016mol/L 戊巴比妥钠；肝素用生理盐水配制成 1250U/mL 的溶液；小鼠抗大鼠 SABC 试剂盒(即用型)、鼠抗 CD4 及 CD8 多克隆抗体、DAB 显色试剂盒均为武汉博士德生物工程公司产品；402 超声雾化器，上海四菱医疗机械厂生产。 12 实验动物及分组 清洁级健康豚鼠，体重(20020)g，由同济医科大学医学动物中心提供。检疫 1 周后，豚鼠随机分为正常对照组、哮喘模型组、西药对照组、中药小剂量组、中药大剂量组，共 5 组，每组 10 只(雌雄分笼饲养)。 13 造模方法 以卵蛋白致敏和攻击加以复制。实验第 1 天，配制 100g/L 卵蛋白生理盐水，豚鼠
5、腹腔注射 1mL 以致敏；第 15 天将致敏豚鼠置于 14L 透明玻璃钟罩内，给予 10g/L 卵蛋白生理盐水超声雾化吸入(雾化量由小到大)1520s，后自然吸入 1520s，出现呼吸频率加快、点头呼吸、咳嗽、抽搐等症状时为引喘成功。以后每隔 1 天以 10g/L 卵蛋白生理盐水诱喘。按最大雾量，自然吸入 1530s，使哮喘反复发作(每次诱喘之前，每只豚鼠均腹腔注射苯海拉明 5mg/kg)。共 4 次。正常对照组以等量生理盐水进行腹腔注射和雾化，方法同上。 14 药物制备及给药方法 止哮平喘方(由法半夏 10g、瓜蒌皮 10g、薤白 10g、白芍 30g、柴胡10g、黄芩 10g、麻黄 10g
6、、枳壳 10g、甘草 10g 和射干 10g 组成)由湖北中医学院中药室制备(水煮醇沉法)，含生药 2g/mL；地塞米松片，075mg/片，在第 1 次诱喘 24h 后，即从第 16 天开始按 1mgkg胃饲给药；中药小剂量组止哮平喘方 6gkg；中药大剂量组止哮平喘方 24gkg；哮喘模型组及正常对照组均饲以等容量生理盐水。共治疗 8d。 15 标本采集及检测 151 标本采集 称体重，016mol/L 戊巴比妥钠 1mL/kg 腹腔内注射，麻醉。常规消毒，心脏采血，肝素抗凝，血细胞计数测定细胞总数，涂片、染色，作细胞学分析。摘取豚鼠肺脏，用无尖针头注射器置于气管分叉处，缓慢注入生理盐水(3
7、7)2mL，保留 30s 后抽出，重复 4 次。每例收集肺泡灌洗液67mL(回收率85%)，-4储存，1h 内作细胞分离。BALF 于 1500r/min离心 10min，沉淀细胞用 1mL Hanks 液重悬。取 01mL 测定细胞总数；取02mL 涂片，WrightGiemsa 染色，至少计数 200 个细胞作细胞分类计数。 152 外周单核细胞(PBMC)的制备和激活 称体重，016mol/L 戊巴比妥钠 1mL/kg 麻醉豚鼠。常规消毒，心脏采血，抗凝。用淋巴细胞分层液分离淋巴细胞，用完全 RPMI1640 定容细胞并记数。台盼蓝染液检查 PBMC 活性，活性超过 95%。另部分 T
8、淋巴细胞置于预先包被了抗 CD3 单抗的培养板中，37、体积分数为 5%CO常规培养 24h。 153 免疫组化 按常规步骤操作 ，设阴性替代片和空白对照显色，阳性细胞表达为棕黄色。免疫组化片每组随机选择 5 张，在 200 倍光镜下观察。每张随机选取 5 个视野，计数 200 个细胞中阳性细胞所占比例，取其平均值。 154 形态学观察 每组选取右肺中叶以体积分数为 10%的市售甲醛固定，常规石蜡包埋行 HE 染色，观察各组豚鼠支气管、肺组织的形态学改变。 16 一般情况观察 观察实验过程中各组豚鼠的精神、活动、饮食、排便、皮毛及死亡情况。 17 统计分析 所有数据采用(xs)表示，统计分析采
9、用 t 检验。 2 结果 21 一般情况 豚鼠致敏后普遍精神较差，活动减少，12d 后逐渐恢复正常。第 3周哮喘模型组 3 只豚鼠出现皮毛蓬松；西药对照组有 1 只脶鼠，中药小剂量组有 2 只豚鼠出现明显皮毛蓬松现象。最后 1 次诱喘时，哮喘模型组 1 只豚鼠哮喘发作严重，经给氧抢救后无效死亡；正常对照组豚鼠情况良好，无死亡；各给药组豚鼠情况均较哮喘模型组明显改善。 22 各组豚鼠全血细胞计数与分类 表 1 结果表明，哮喘模型组全血中总细胞(blood cells，BC)浓度显著高于正常对照组(001)；中药大剂量组和西药对照组总细胞浓度显著降低(005)；哮喘模型组嗜酸性粒细胞(eosino
10、phil,EOS)、淋巴细胞(lymphocytes)均高于正常对照组(001)；中药大剂量组及西药对照组 EOS、淋巴细胞均显著降低(005)。表 1 各组豚鼠全血的白细胞计数与分类（略） 23 各组豚鼠 BALF 中细胞计数与分类 表 2 结果表明，哮喘模型组 BALF 中总细胞浓度显著高于正常对照组(001)；中药大剂量组和西药对照组总细胞浓度显著降低(001)；哮喘模型组 EOS、淋巴细胞均高于正常对照组(001)；中药大剂量组及西药对照组 EOS、淋巴细胞均显著降低(001)。表 2 各组豚鼠 BALF中白细胞计数与分类（略） 24 各组豚鼠 PBMC 中 CD、CDT 细胞数量变化
11、 表 3 结果表明，哮喘模型组 CDT 细胞数量较正常对照组显著升高(005)，CD8T 细胞数量无明显变化(005)；中药大剂量组和西药组均能降低 CDT 细胞数量(P005)，而对 CDT 细胞数量影响不明显(P005)。提示中药大剂量组可降低 CDT 细胞数量。表 3 各组豚鼠 PBMC 中 CD、CD8T 细胞数量变化（略） 25 各组豚鼠形态学观察 光镜下正常对照组：支气管、肺组织结构正常，各级支气管上皮完整，炎性细胞浸润少见(图 1-a)；哮喘模型组：气道炎症明显，在细、小支气管管壁和伴行动脉周围有大量的炎性细胞浸润，包括淋巴细胞、嗜酸细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等，其中以嗜酸细胞为
12、主，严重者可见脱落的上皮细胞。支气管管腔狭窄，杯状细胞增生明显，平滑肌增厚；部分肺泡壁变薄或断裂，融合成肺气肿(图 1-b)；西药对照组：病理变化基本接近于正常组，支气管及肺组织结构基本正常。与模型组相比，支气管及肺泡区炎性细胞浸润明显减少(图 1-c)；中药小剂量组：病变与哮喘模型组比较，炎性细胞浸润略有减少(图 1-d)；中药大剂量组：支气管及肺组织结构基本正常。与模型组相比，气道炎性细胞浸润显著减少，与西药对照组比较无显著差异(图 1-e)。 3 讨论 在哮喘气道慢性炎症中，大量的炎性细胞(如嗜酸细胞、淋巴细胞等)和多种炎性介质参与其病理过程。其中嗜酸细胞(EOS)和淋巴细胞与之尤为密切
13、 。目前认为 EOS 是气道变应性炎症反应的主要效应细胞。因此，有人称哮喘为“慢性嗜酸细胞性哮喘” ， 。 淋巴细胞活化是哮喘病人免疫功能紊乱的主要特征。研究发现：哮喘患者支气管活组织检查及外周血和 BALF 中 CD淋巴细胞增多；激活的 T 淋巴细胞通过特殊的淋巴因子参与哮喘的慢性炎症反应。如促使嗜酸细胞趋化、增殖、分化及功能激活，从而加强气道组织中嗜酸细胞的致炎作用 。 在哮喘气道慢性炎症中，T 细胞尤其是 CD辅助性 T 细胞过度活化是关键，起核心作用。在哮喘发病中免疫功能的失调主要表现在：CD细胞的活性增强和 CD8 细胞的功能降低。所以 CD细胞(TH)在哮喘发病中起重要调控作用，而
14、 CD8 细胞也参与哮喘的发病。在这一炎症过程中，TH型细胞反应占优势是其重要特征。因此有人提出所谓的哮喘“TH细胞假说” 。在哮喘发病时，CD/CD8 细胞经常处于失衡状态。因此，通过检测 CD、CD8 细胞的含量变化可以观察哮喘免疫功能情况。 本实验表明，哮喘模型组血液循环及气道局部 BALF 中均存在大量炎性细胞浸润，炎性细胞主要以嗜酸性细胞和淋巴细胞为主。病理学亦证实哮喘模型组的气道炎症明显，在细、小支气管管壁和伴行动脉周围有大量的炎性细胞浸润，包括淋巴细胞、嗜酸细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等，其中以嗜酸细胞为主。同时，CD/CD8T 细胞经常处于失衡状态，即 CD细胞的活性增强和 CD
15、8 细胞的功能降低。治疗后，中药小剂量组炎性细胞改变不明显；中药大剂量组和西药对照组炎性细胞显著降低。说明止哮平喘方能降低外周血炎性细胞如 EOS、淋巴细胞等的数量；进一步研究证明，中药大剂量组 CD细胞较哮喘模型组下降，说明其能降低 CD细胞含量，使 CD/CD8T 细胞经常处于平衡状态。我们认为哮喘发作时的主要病理环节是痰阻气闭、痰气互结、胸阳不振、气道挛急，故拟宽胸理气、通阳散结、化痰解痉等多法联用、整体调节，创制止哮平喘方。全方为瓜蒌薤白半夏汤、小柴胡汤、芍药甘草汤等 3 首方剂化裁而得，由瓜蒌、法半夏、柴胡、黄芩、射干等 10 味中药组成。现代药理学研究表明：瓜蒌皮所含的氨基酸有良好
16、的祛痰作用；薤白有良好的平喘作用，可能与其改善肺通气功能、尤其是小气道功能，提高前列腺素类(PGI)的含量、抑制血栓素 A(TXA)的生成以及抗自由基效应有关 。研究证实以射干、麻黄为主组成的方剂的作用机理与调节环核苷酸水平有关，主要使 cAMP 含量及 cAMP/cGMP 比值上升，cGMP 含量下降，从而使支气管平滑肌松驰，并抑制介质释放而具平喘作用 。麻黄碱为 受体激动剂，具有显著的平喘作用，对支气管平滑肌痉挛有较持久的解痉作用，尤其对支气管平滑肌处于痉挛状态时作用更显著。 本实验结果表明，中药止哮平喘方能够降低外周血炎性细胞如 EOS、淋巴细胞等的数量，从而减少炎性细胞向气道内聚集的可
17、能性；更重要的是能抑制炎性细胞在气道局部内的浸润，即降低 BALF 中炎性细胞的数量，减轻其毒性产物的损伤及气道高反应(AHR)的形成 ，具有抗气道炎症的作用。进一步研究显示止哮平喘方能通过降低 CD细胞数量，相对增加 CD8 细胞，使 CD/CD8 细胞恢复正常状态，从而调节其紊乱的免疫功能状态。这可能是止哮平喘方抗气道炎症的作用机理之一。参考文献： 蔡文琴，王伯纭实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术 成都：四川科学技术出版社，1994、120 刘春涛，王曾礼，冯玉麟，等哮喘动物模型气道中白细胞介素 5 和 10 的动态变化及其意义 中华结核和呼吸杂志，2000，4：239 Busse W W
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