1、光谱法研究金属离子与肿瘤抑制蛋白 p53的 DNA 结合结构域的相互作用【摘要】 利用荧光滴定法研究了 9 种金属离子与序列特异性的 DNA结合结构域(p53DBD)的结合反应，其结合能力依次为Fe3+Zn2+Cu2+Ca2+Mg2+Ba2+Mn2+Ni2+Co2+。圆二色谱研究结果表明，Ba2+, Ca2+, Co2+, Mn2+及 Ni2+并未引起蛋白二级结构变化; Zn2+, Mg2+及 Fe3+诱导蛋白结构细微调整;而 Cu2+结合导致蛋白螺旋结构大量丢失。ANS 结合研究结果表明, Mg2+与 Zn2+相似，诱导 p53DBD 蛋白表面疏水性增强，而 Fe3+引起 p53DBD 蛋白
2、表面疏水性降低。因此，Mg2+和 Fe3+可能是影响或调节 p53 活性的潜在因子之一。 【关键词】 金属离子, 蛋白结构, 亲和性, 疏水性, 荧光光谱1 引 言自然界中大约 1/4 的蛋白需要金属离子的协助才能发挥正常功能1,2。肿瘤抑制蛋白 p53 是 Zn2+结合蛋白，它调控很多重要的生物学过程3。p53 响应于多种 DNA 损伤事件，被激活后作为一个转录因子进一步激活下游基因，从而可以导致细胞周期停留在 G1/S 期修复或者诱导凋亡4。所有这些已知的生物学功能都依赖于其 DNA 结合特性5。野生型 p53 通过一个序列特异性的 DNA 结合结构域(p53DBD)来结合 DNA6。p5
3、3 基因在 50%肿瘤中发生突变7，而这些突变主要发生在 p53DBD，突变的 p53 不能激活下游基因转录8。因此，p53DBD 结合和转录激活活性是 p53 最关键的生物学功能。晶体结构研究结果表明，p53 核心结构域结构为 三明治结构形成脚手架，支撑 2 个大环和 1 个环 片层 螺旋模序。2 个大环形成空腔结合 Zn2+，而环 片层 螺旋模序形成 p53DNA结合表面。p53DBD 上的 3 个半胱氨酸(Cys176, Cys238 和 Cys242)和 1 个组氨酸(His179)结合 1 个 Zn2+9。Zn2+的结合被认为是 p53 核心结构域正确折叠所必需的，这种结合如果被破坏
4、将会使 p53DBD 减弱甚至失去DNA 结合和转录下游基因的功能10。核磁共振研究表明：在没有 Zn2+的情况下，p53 蛋白的 DNA 结合表面发生了结构变化;荧光各向异性研究表明：Zn2+的去除使 p53DBD 失去了位点特异性的 DNA 结合活性，但保留着非特异性的 DNA 结合活性11。另外，Cu2+结合 p53 蛋白，却导致 p53构象和 DNA 结合活性的破坏12。然而，金属离子与 p53DBD 的结合平衡的研究尚未见报道。细胞内存在多种金属离子，为了研究这些金属离子是否结合并影响 p53DBD，本实验克隆并纯化了 p53DBD 蛋白，并在体外应用光谱法研究这些金属离子与 p53
5、DBD 蛋白的结合反应，以及金属离子对蛋白结构及表面疏水性的影响。2 实验部分2.1 仪器与试剂F4500 荧光分光光度计(日本日立公司); Jasco J715 分光偏振计(日本分光株式会社)。8 苯胺1 萘磺酸(ANS，Sigma 公司);二硫苏糖醇(DTT，Merck 公司);NaCl(天津市试剂六厂);蔗糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙基D 硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、TrisBase 及咪唑均购于北京鼎国试剂公司;ZnCl2, MgCl2, CaCl2, FeCl3, MnCl2, CoCl2, CuCl2, BaCl2
6、及 NiCl2 均购于天津大学科威公司。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。高渗缓冲液 A(20 mmol/L TrisHCl ， 2.5 mmol/L EDTA，200 g/L 蔗糖，pH 8.0);低渗缓冲液 B(20 mmol/L TrisHCl ，2.5 mmol/L EDTA，pH 8.0);缓冲液 C(20 mmol/L TrisHCl ，50 mmol/L NaCl，2 mmol/L CaCl2，pH 8.0);缓冲液 D(0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L TrisHCl ，5 mmol/L 咪唑，pH 8.0);缓冲液 E(0.5 mol/L
7、 NaCl，20 mmol/L TrisHCl ，80 mmol/L 咪唑，pH 8.0);缓冲液 F(0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L TrisHCl ， 300 mmol/L 咪唑，pH 8.0);缓冲液 G(50 mmol/L TrisHCl ，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，pH 7.5)。2.2 p53DBD 的基因克隆、蛋白表达与纯化利用密度梯度离心法从人全血中分离单个核细胞，然后使用TRIzol 法从单个核细胞中提取总 RNA。以5TCCCAAGCAATGGATGAT3 和 5TTTATGGCGGGAGGTAGA3 为引物，通过 RTPC
8、R 方法从总 RNA 中克隆出肿瘤抑制蛋白 p53cDNA 片段。然后以 5ATCGTCTCCCATGGCTGTCCCTTCCCAGAAAA CCT3 和5ATATCTCGAGTCACAGTGCTCGCTTAGTGCTC3 为引物 PCR 编出氨基酸96308 的 p53DBD 基因片段。这个基因片段被克隆进表达载体pET32a(novagen)。重组质粒通过碱裂解法制备，测序证明插入序列的正确性。核心的 DNA 结合结构域在 Escherichia coli BL21 (DE3) trx B-中过量表达。细菌在 LB 培养基中 37 培养直到吸光度值 A600 达到0.61.0。用 0.25
9、 mmol/L 异丙基D 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达，25 条件下继续孵育 6 h。后续的步骤都在 4 下进行。离心收集菌体，然后重悬于高渗缓冲液 A 中 30 min。离心重新收集后，细菌溶解在低渗缓冲液 B 中裂解 45 min。不溶物以 13000 r/min 离心 30 min 去除。蛋白上清液用缓冲液 C 透析 12 h，然后流经缓冲液 D 平衡的亲和色谱柱(qiagen)。色谱层析后用缓冲液 E 清洗杂蛋白，用缓冲液 F洗脱重组蛋白。洗脱的蛋白组分利用 SDSPAGE 检测。重组的 p53DBD 蛋白进一步利用 Sephadex G75 凝胶过滤柱(pharmaci
10、a)于缓冲液 C 中纯化。从凝胶过滤柱中收集的蛋白用肠激酶在 25 下酶切 7 h。酶切蛋白再次利用 Sephadex G75 凝胶过滤柱于缓冲液 G(50 mmol/L TrisHCl, pH 7.5, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L DTT)中进一步纯化。纯化的p53DBD 蛋白用 2.5 mmol/L EDTA 处理以去除 Zn2+，然后流经 Sephadex G75 凝胶柱更换缓冲液为缓冲液 G。最后 SDSPAGE 电泳检测纯度，运用 Bradford 法以牛血清白蛋白为标准测定蛋白浓度。2.3 荧光滴定在室温条件下，以 295 nm 为激发波长，记录 31045
11、0 nm 的发射谱。激发和发射的光谱带宽设置为 5 nm，每个数据点测量 3 次。蛋白浓度为 1.8 mol/L，滴定反应于缓冲液 G 中进行。每个数据点都扣除背景，作荧光校正。2.4 圆二色谱研究圆二色谱测量在 Jasco J715 分光偏振计上进行，以 1 mm 石英比色皿为样品池，扫描波长范围为 200250 nm。每一个数据点取 6 次扫描的平均值。100 mol/L 金属离子与 4.0 mol/L 蛋白结合反应于缓冲液 G 中进行。每个数据点都通过减去背景谱校正。2.5 ANS 结合研究通过测量 ANS 的荧光增强来测量 ANS(8 苯胺1 萘磺酸)与p53DBD 的结合。100 m
12、ol/L 金属离子与 1.8 mol/L 蛋白于缓冲液 G中温浴 30 min 后，加入 50 mol/L ANS，然后测量 ANS 荧光光谱。激发波长设置为 380 nm，发射谱扫描 400600 nm。所有的测量都通过减去缓冲液背景进行荧光校正。3 结果与讨论3.1 p53DBD 表达、纯化以及内源的荧光性质为了研究不同金属离子与 p53DBD 的结合反应，本实验克隆、表达并纯化了编码 96308 氨基酸的 p53DBD 蛋白。SDSPAGE 分析表明，24 kDa 的 p53DBD 蛋白在纯化的部分中占主要部分(图 1A)。蛋白的浓度为170 mg/L。图 1B 表示在室温条件下纯化的
13、p53DBD 蛋白于标准缓冲液 G中的荧光发射谱。激发波长为 295 nm，在此波长下只有色氨酸被激发。根据文献13报道，当发射谱最大波长在 330332 nm 之间，表示色氨酸残基埋藏在蛋白的非极性区域内;当发射谱最大波长在 340342 nm 之间，说明色氨酸残基固定在蛋白的表面并且与水接触受限;当发射谱最大波长在 350353 nm 之间，表示色氨酸残基完全暴露于水中。分析p53DBD 的荧光发射光谱表明重组蛋白在 295 nm 被激发时，最大发射波长为 340 nm。这与 p53DBD 晶体结构色氨酸位于蛋白表面的结果相一致9。当 p53DBD 蛋白用 4.2 mol/L 盐酸胍处理
14、1 h 后，最大发射波长红移到352 nm，同时荧光强度降低，说明色氨酸残基转移到一个更强极性的环境之中。3.2 金属离子与肿瘤抑制蛋白 p53DBD 的结合金属离子与 p53DBD 结合的定量测量可以通过测量 p53DBD 荧光光谱的变化来完成。文献14 已报道金属离子的结合能够导致荧光发射强度的降低。本实验观测到 p53DBD 的荧光强度随着 9 种金属离子滴定的进行而逐渐减弱(图 2A)。金属离子与蛋白的结合通常可以分为动态猝灭和静态猝灭这两种。动态猝灭涉及到在激发态短暂存在的瞬间荧光团与猝灭剂的接触。动态猝灭和静态猝灭都可以用 SternVolmer 方程来描述。F0/F=1+Kq0Q
15、=1+KSVQ(1)F 和 F0 分别表示在有和无猝灭剂存在的情况下，p53DBD 蛋白的荧光强度。Kq 是生物分子的猝灭速率常数;KSV 是SternVolmer 猝灭常数;0 是生物分子在没有猝灭剂的情况下的平均寿命;Q是猝灭剂的浓度。可以通过式(1)直线的斜率得到 KSV(图 2B)。根据文献15报道，生物分子的 0 值约为 10-8 s，因此可以计算出猝灭速率常数 Kq，其值列于表 1 中。生物分子与不同的猝灭剂所产生的最大碰撞猝灭常数为 2.01010 L/(mols)16。从表 1 可见，9 种金属离子导致 p53DBD 荧光猝灭的速率常数远大于碰撞猝灭常数。这些数据说明荧光猝灭是
16、静态猝灭。Fig.2 A. Fluorescence emission spectra of 1.8 mol/L p53DBD treated with increasing amounts of Ba2+; B. SternVolmer plots of fluorescence quenching of p53DBD with Ba2+; C. Logarithmic plots of fluorescence quenching of p53DBD treated with Ba2+静态猝灭涉及荧光团 猝灭剂复合物的形成。在一个静态猝灭过程中，假设 p53DBD 蛋白上有 n 个配体结合
17、位点，猝灭反应可以表示为方程(2)。p53DBD和Q分别表示自由蛋白和配体的浓度，Qnp53DBD表示蛋白复合物的浓度。总蛋白浓度等于自由蛋白与蛋白复合物浓度之和，因此，方程(3)可以变为方程(4)。Ka=p53DBDtot-p53DBDQnp53DBD(4)体系中，荧光强度与蛋白浓度成正比，所以lgF0-FF=lgKa+nlgQ(6)在此方程中，n 表示结合位点数。Ka 和 n 可以通过线性关系lg(F0-F)/F 对 lgQ的截距和斜率得到17(图 2C)。从表 1 中可以看出，金属离子结合 p53DBD 蛋白亲和性依次为Fe3+Zn2+Cu2+Ca2+Mg2+Ba2+Mn2+Ni2+Co
18、2+。表 1 金属离子与 p53DBD 的结合常数(Ka)、解离常数(Kd)、结合位点数(n)以及猝灭速率常数(Kq)3.3 p53DBD 二级结构的变化内源荧光变化表示了色氨酸残基局部微环境的变化在一定程度上反映了 p53DBD 三级结构的变化。采用远紫外圆二色谱测量金属离子对p53DBD 蛋白二级结构的影响(图 3)。p53DBD 远紫外圆二色谱曲线在 208和 220 nm 处表现出 2 个负的特征峰，这是蛋白质 螺旋典型的特征峰。Ba2+, Ca2+, Co2+, Mn2+及 Ni2+并不引起 p53DBD 蛋白二级结构变化。 图 3 蛋白与金属离子作用的远紫外圆二色谱1. p53DB
19、D; 2. (1)+Mg2+; 3. (1)+Zn2+; 4. (1)+Fe3+; 5. (1)+Cu2+.而 Zn2+, Mg2+, Fe3+和 Cu2+结合 p53DBD 蛋白，引起圆二色谱两个负的特征峰值的降低，说明这些离子的结合导致了蛋白螺旋结构降低(图 3)。Zn2+, Mg2+和 Fe3+作用相对较弱，引起蛋白螺旋结构的细微改变。Zn2+结合 p53DBD 使得蛋白上的两个大环连接在一起，从而进行DNA 特异性结合11。而 Cu2+作用引起了蛋白螺旋结构大量丢失，这与文献12报道的 Cu2+结合 p53 导致 p53 构象和 DNA 结合活性的破坏相一致。3.4 p53DBD 疏水
20、性研究考察了结构荧光探针与 p53DBD 的结合。ANS 在水相缓冲液中荧光较弱，但是结合蛋白疏水区域后其荧光发射谱显著增强。因此，可以通过测量 ANS 的荧光变化研究 p53DBD 蛋白的疏水性变化18。图 4A 表示的是 ANS 与 p53DBD 结合后的荧光光谱图，其激发波长为 380 nm，最大发射波长为 478 nm。当 p53DBD 蛋白与不同金属离子结合以后，其 ANS 荧光有不同程度的增强。从图 4B 可见，Ba2+, Ca2+, Co2+, Mn2+及 Ni2+并没有引起 p53DBD 疏水性显著变化，Zn2+, Mg2+和 Cu2+结合诱导蛋白表面疏水性增强，而 Fe3+引
21、起了 p53DBD 蛋白表面疏水性降低。p53DBD 的晶体结构表明9，p53 核心结构域结构为一个 三明治结构形成脚手架，支撑 2 个大环和 1 个环 片层 螺旋模序。2 个大环形成空腔结合Zn2+，因此 Zn2+结合诱导蛋白表面疏水性增强。4 结 论综合以上实验结果，Ba2+, Ca2+, Co2+, Mn2+及 Ni2+虽然结合p53DBD 蛋白，但是并未引起蛋白结构和疏水性的改变;Zn2+结合 p53DBD蛋白诱导蛋白结构细微调整，并引起表面疏水性增强，使得蛋白上的 2个大环连接在一起，从而具备 DNA 特异性结合活性;Cu2+结合导致蛋白螺旋结构大量丢失，破坏 p53 构象和 DNA
22、 结合活性;Mg2+和 Fe3+都能诱导蛋白结构细微调整，Mg2+诱导蛋白表面疏水性增强，其作用方式可能与Zn2+类似，而 Fe3+导致 p53DBD 蛋白表面疏水性降低。因此，Mg2+和Fe3+可能是影响或调节 p53 活性的潜在因子之一。【参考文献】1 Tottey S, Waldron K J, Firbank S J, Reale B, Bessant C, Sato K, Cheek T R, Gray J, Banfield M J, Dennison C, Robinson N J. Nature， 2008, 455: 113811422 Glusker J P, Katz A
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