1、麻黄碱促进脑缺血大鼠运动功能康复的细胞及分子机制作者：赵晓科 肖农 周江堡 张晓萍 【关键词】 脑缺血；功能恢复；生长调节素类；突触素；麻黄；麻黄碱 【Abstract】 AIM: To investigate the effect of ephedrine on motor recovery after middle cerebral artery occlusion (MCAO), and explore the molecular and cellular mechanisms of ephedrine in accelerating rehabilitation in rats. ME
2、THODS: Sixty male SD rats were randomly divided into shamoperated group, natural recovery group and ephedrine treatment group. The unilateral MCAO models were induced by using bread occlusion method. Electron microscope was used to observe the tissue damages and newly born synapses around ischemic a
3、rea at week 1, 2, 3 and 4 after operation. The expression levels of growthassociated protein 43 (GAP43) and synaptophysin around ischemic area were examined by RTPCR techniques. RESULTS: The ephedrine treatment group was lighter in degree of injury and more in the number of newly born synapses as co
4、mpared with the natural recovery group. Both GAP43 and synaptophysin proteins were demonstrated statistically significantly increased in RTPCR product as determined by optical density measurements in ephedrine treatment group as compared with natural recovery group (P0.01). CONCLUSION: The mechanism
5、s of behavioral recovery with ephedrine treatment are associated with the enhanced synaptogenesis and the increased expression of molecules involved in neuronal remodeling around ischemic area. 【Keywords】 cerebral ischemia； functional recovery； somatomedins； synaptophysin, ephedra； ephedrine 【摘要】 目的
6、： 研究麻黄碱加速大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型运动功能康复的细胞和分子机制. 方法： 雄性 SD 大鼠 60 只，随机分为假手术组、自然康复组和治疗组. 应用线栓法建立单侧 MCAO 模型. 术后1，2，3，4 wk 电镜检测缺血周围区组织损伤及新生突触形成情况，RTPCR 检测缺血周围区生长相关蛋白(GAP43), 突触素(SYP)表达的变化. 结果： 治疗组神经损伤程度轻，新生突触较自然康复组多；RTPCR 显示治疗组 GAP43 和 SYP 的表达水平高于自然康复组(P0.01). 结论： 增加缺血周围区新生突触形成，在基因水平上促进 GAP43 及 SYP 的表达增高是麻黄碱促进
7、神经康复的机制之一. 【关键词】 脑缺血；功能恢复；生长调节素类；突触素；麻黄；麻黄碱 0 引言 祖国传统医学认为，麻黄具有活血通络的功效. 大量中医药报道显示，麻黄与其他中药配伍用于治疗脑缺血所致的中风后遗症，可明显改善其神经功能缺损症状1-2. 在我们的前期研究中，发现麻黄中的主要药用成分麻黄碱可加速脑缺血后动物的运动功能恢复速度3. 本研究试图通过对缺血周围区超微结构的观察及皮层生长相关蛋白(growthassociated protein 43，GAP43)及突触素(synaptophysin，SYP) mRNA 表达的检测，了解其细胞及分子机制. 1 材料和方法 1.1 材料清洁级雄
8、性 SD 大鼠 60 只，体质量 220250 g. 重庆医科大学试验动物中心提供. 随机分为两大组：电镜组（48 只）及 PCR 组（12 只） ，各大组再等分为：假手术组，自然康复组；麻黄碱治疗组. 电镜组均分为 4 个时点组，即：术后 1， 2， 3 和 4 wk. 各时点组均 4 只. 1.2 方法 1.2.1 中动脉闭塞(middle cerbral artery occlusion, MCAO)模型的制备大鼠麻醉后,仰卧位固定于手术台上,行颈前正中纵行切口,分离暴露右侧颈总动脉(CCA), 颈外动脉(ECA), 颈内动脉(ICA),剥离迷走神经,结扎 CCA 近端和 ECA 根部.
9、 在 CCA 距分叉部约 2 处剪开一小口,将制备好的栓线插入 CCA 并伸入到 ICA 内,推进深度约为 1820 mm, 微遇阻力时停止. 栓线经过 CCA 分叉处、ICA 进入颅底至较细的大脑前动脉(ACA)，以阻断来源于同侧颈内动脉、大脑前动脉及大脑后动脉的血流供应，完成对右侧 MCA 的阻塞. 缺血 2 后取出栓线实现再灌注 . 假手术组不插入栓线，其余步骤和手术组相同. 1.2.2 施加处理因素术后麻黄碱治疗组每 3 日给予一次 3 mg/kg 麻黄碱腹腔注射，其余两组注射同体积的生理盐水. 1.2.3 电镜观察超微结构分别在各时点，水合氯醛麻醉动物，打开胸腔暴露心脏，经左心室插管
10、至主动脉起始处，剪开右心耳，进行灌注固定. 首先用生理盐水 200300 mL 快速冲洗，至流出清亮液体，再用 25 mL/L 的戊二醛进行原位灌注固定，迅速断头取脑，在缺血周围区取下数块大小为 1 mm1 mm1 mm 的标本，放入电镜固定液中后固定 24 h，取出放入 4 PBS （0.01 mmoL/L pH 7.257.35）溶液，反复冲洗 12 h 以上，10 mL/L 锇酸固定 2 h，丙酮脱水，国产环氧树脂 618（环#618）包埋，解剖显微镜下修整，制成超薄切片，30 g/L 柠檬酸+1 mL/L 乙酸铀双重电子染色，透射电镜下观察、照相. 1.2.4 逆转录聚合酶链反应（RT
11、PCR）检测 GAP43，SYP 基因表达(1)引物合成：GAP43 上游引物：5AGGGAGATGGCTCTGCTACT3，下游引物：5TCTTTACCCTCATCCTGTCG3，406 bp； SYP 上游引物：5GTGTTCGCTTTCATGTGGCTAG3，下游引物：5 ATCTGATTGGAGAAGGAGGTGG 3，494 bp，均由上海生物工程公司合成. RTPCR 基本步骤： 总 RNA 的提取：将术后 1 wk 大鼠在深度麻醉下快速断头，取缺血侧半球靠中线三分之一的脑组织 100 mg，加入 1 mL Tripure 匀浆提取 RNA，产物-70保存备用. cDNA 的制备：
12、严格按照逆转录试剂盒说明书进行操作. PCR 扩增: 总循环数 29,变性温度 94，退火温度 59.5. 电泳及条带分析：将各管扩增产物各取 10 L 与指示剂混匀，120 mV 电泳，溴乙锭中染色 15 min. 凝胶图象分析系统扫描扩增产物电泳条带的密度. 产物相对量=产物电泳条带密度/action 产物电泳条带密度. 统计学处理： 采用 SPSS 11.5 软件进行统计分析. 数值以 xs 表示，单因素多均数间差异作 F 检验，均值间两两比较作 SNKq 检验，方差不齐时采用 Tamhanes 检验. 2 结果 2.1 电镜超微结构观察假手术组：神经元和胶质细胞外形规则、核大、核膜结构
13、完整，异染色质少，胞质内可见多种细胞器，其形态正常，线粒体膜完整，内部形态正常，内皮细胞形态及内皮细胞间紧密连接正常. 自然康复组：大量胶质细胞和神经元受损，细胞内外严重水肿，核膜结构破坏，核内异染色质增多、聚集，线粒体肿胀，嵴断裂、溶解、消失，细胞器肿胀、消失，胞质空泡化，细胞突起消失，内皮细胞肿胀，细胞间紧密连接破坏，新生突触数量较少（图 1A，2A）. 麻黄碱治疗组：神经元受损程度较轻，神经细胞轻度肿胀，核膜结构尚存，核内异染色质较少，线粒体轻微肿胀，嵴可见，细胞器形态基本正常，内皮细胞间紧密连接未见破坏. 突触数量增加，可见新生突触形成（图 1B，2B）. A: 自然康复组 TEM 8
14、000; B: 麻黄碱治疗组 TEM 6000. 图 1 术后 1 wk 神经元水肿（略） A: 自然康复组 TEM 25 000; B: 麻黄碱治疗组 TEM 30 000. 图 2 术后 4 wk 出现新生突触（略） 2.2 调控基因 1 wk 时表达变化假手术组 GAP43 表达较少，自然康复组表达较假手术组明显为高（P0.01） ，麻黄碱治疗组的表达较自然康复组高（P0.01） ；SYP 的变化和 GAP43 相同，各组间两两比较差异均有统计学意义(表 1，图 3，4). 3 讨论 麻黄(Ephedra)是我国宝贵的中药药材，为麻黄科植物草麻黄、中麻黄或木贼麻黄的干燥草质茎. 早在神农
15、本草经中就有麻黄治脑梗塞后遗症的记载， 宜明方中亦有不少以麻黄治脑梗塞的临床验证， 千金中指出麻黄能 “破坚积聚” ，有名的小续命汤即以麻黄为主药. 目前仍有不少中医名家善用麻黄组方治疗脑梗塞后遗症，且取得较好疗效1-2 ，在我们的前期研究中，我们确知麻黄的主要药用成分麻黄碱具有促进神经康复的作用. 本研究在细胞水平及分子水平探讨了麻黄碱的作用机制. 表 1GAP43 及 SYP mRNA 表达的相对量（略） bP0.01 vs 假手术; dP0.01 vs 自然康复. 1：麻黄碱治疗组 GAP43/SYP; 2：自然康复组术 GAP43/SYP； 3：假手术组 GAP43/SYP； 4， 5
16、， 6：action 600 bp；7： marker. 图 3 术后 1 wk 各试验组 Gap43 mRNA 的表达（略） 1：麻黄碱治疗组 GAP43/SYP; 2：自然康复组术 GAP43/SYP； 3：假手术组 GAP43/SYP； 4， 5， 6：action 600 bp；7： marker. 图 4 术后 1 wk 各试验组 SYP mRNA 的表达（略） 运动功能的恢复，必然伴随脑内解剖结构的调整4. 再灌注 7 d电镜观察，自然康复组细胞水肿严重，细胞器损伤重；而治疗组神经元、神经胶质受损程度轻，仅表现为细胞轻度水肿，细胞器基本正常；这提示麻黄碱治疗可能有减轻缺血损害，促进
17、神经修复的作用. 28 d 时自然康复组突触数量仍较低，治疗组突触数量则显著增多，有超过假手术组的趋势；且治疗后新生突触数量明显增多. 从而在细胞水平上，我们检测到麻黄碱的正性神经可塑作用. GAP43 是二十世纪 80 年代初发现的与神经发育、轴突再生、突触重建密切相关的一种快速转运磷酸蛋白，其表达产物主要位于轴突生长锥质膜面5. 成熟脑中，GAP43 仅在一些突触形成和功能改建活跃的部位有高水平表达，如边缘系统、皮质联合区、海马、嗅球等. 损伤时，GAP43 的表达显著增强，其表达强度与轴突芽生、突触重建的状态相一致，从而 GAP43 的表达成为脑缺血损伤后常用的神经生长及再生的量化指标6
18、.我们用药 3 次后对 3 组 GAP43 mRNA 的表达进行检测. 结果显示缺血损伤后，自然康复组及治疗组 GAP43 mRNA 表达均增高，且麻黄碱治疗组 GAP43 mRNA 的表达高于自然康复组，显示麻黄碱在基因层面上亦对GAP43 的表达起上调作用. SYP 是一种位于突触囊泡膜上的钙结合蛋白，是蛋白酪氨酸激酶的底物，在钙依赖性神经递质释放过程中起重要作用. SYP 在神经元胞体合成后主要被转运至轴突终末，特异性分布于突触前囊泡膜上. 由于突触终末囊泡重吸收循环机制的存在，在正常状态下突触素的量在突触处保持相对恒定，因而可被作为突触分布和密度的定量指标7. 通过测定其积分光密度值，
19、可以在光镜水平对其进行间接定量. 突触数量的增加，提示新生突触的形成8. 在 7 d 时 SYP mRNA 的表达，治疗组和自然康复组比较有统计学意义，说明麻黄碱在基因水平上可以上调 SYP 的表达. 轴突的芽生和伸长，以及随后出现的新生突触，为脑缺血后功能缺损的恢复提供了结构基础9,10. 该研究证实麻黄碱对脑的结构再塑的促进作用与此有关. 【参考文献】 1 许士骠. 巧用麻黄治顽疾J. 上海中医药杂志, 2001, 35(7):8-9. 2 李锦成. 麻黄运用之我见 J. 四川中医, 2003, 21(3): 22-23. 3 赵晓科，肖农，周江堡,等.麻黄碱对脑缺血大鼠运动功能恢复的影响
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