1、鼻咽癌组织中信号转导与转录活化因子 3与潜伏膜蛋白 1 的表达及其关系【摘要】 目的 研究鼻咽癌组织中信号转导与转录活化因子 3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的表达和活化状态及其与爱泼斯坦-巴尔病毒(EpsteinBarr virus, EBV)编码的潜伏膜蛋白 1(latent membrane protein 1, LMP1)表达的关系。方法 采用免疫组织化学 SP法检测 45例鼻咽癌、27 例慢性鼻咽炎组织中LMP1、STAT3 和磷酸化 STAT3(pSTAT3) 蛋白的表达并分析其相关性。结果 鼻
2、咽癌组织中 LMP1、STAT3 和 pSTAT3 蛋白的阳性率均高于慢性鼻咽炎组织(P0.01)。相关分析结果显示， LMP1和 pSTAT3 表达呈正相关关系(rs=0.302，P0.05)，但 LMP1与 STAT3表达无明显相关(P0.05)。结论 鼻咽癌组织中存在 STAT3蛋白高表达和异常激活;LMP1可能参与 STAT3的活化。 【关键词】 鼻咽肿瘤;信号转导与转录活化因子 3;潜伏膜蛋白 1ABSTRACT: Objective To study the expression and activation of signal transducer and activator o
3、f transcription 3 (STAT3) in human nasopharyngeal carcinoma(NPC) tissues and its relation with the expression of latent membrane protein 1 (LMP1) encoded by EpsteinBarr virus.Methods The expressions of LMP1, STAT3 and phosphated STAT3 (pSTAT3) in 45 cases of NPC and 27 cases of chronic nasopharyngit
4、is were studied by immunohistochemical method. Correlation between protein expressions was analyzed.Results The positive rates of LMP1, STAT3 and pSTAT3 in NPC were significantly higher than those in chronic nasopharyngitis (P0.01). There was a positive correlation between the expressions of LMP1 an
5、d pSTAT3 (rs=0.302, P0.05), but no obvious correlation between LMP1 and STAT3 expressions (P0.05).Conclusion There are overexpression and abnormal activation of STAT3 protein in NPC tissues. LMP1 may play a role in the activation of STAT3.KEY WORDS: nasopharyngeal carcinoma (NPC); signal transducer
6、and activator of transcription 3 (STAT3); latent membrane protein 1(LMP1)鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方及东南亚地区常见的恶性肿瘤之一，目前认为其发病与爱泼斯坦 巴尔病毒(EpsteinBarr virus, EBV)感染、遗传及环境等因素有关。EBV 编码的潜伏膜蛋白 1(latent membrane protein 1, LMP1)由于能转化小鼠成纤维细胞并在裸鼠体内成瘤而被视为 EBV的瘤基因1。信号转导和转录活化因子(signal transducers and a
7、ctivators of transcription, STATs)家族是一种存在于胞质并在激活后能够转入核内与 DNA结合的蛋白家族。STATs 家族成员中，STAT3 与肿瘤的关系最为密切2。目前，对于 STAT3在鼻咽癌中表达及其与 LMP1相关性的研究报道甚少，本文研究鼻咽癌组织中 STAT3的表达及其与 LMP1的关系。1 材料与方法1.1 临床资料 收集广东医学院附属医院 20052006 年石蜡标本，共 72例。其中鼻咽癌标本 45例(男 26例，女 19例，均为鼻咽非角化性癌)，患者年龄 1876 岁，中位年龄 49岁。慢性鼻咽炎标本 27例(男 16例，女 11例)，患者年龄
8、 1679 岁，中位年龄 47岁。所有病例资料完整，诊断前均未行放疗或化疗。1.2 主要试剂 鼠抗人 LMP1单克隆抗体(克隆 CS.14)购自丹麦DAKO公司，兔抗人 STAT3多克隆抗体购自美国 Neomarkers公司，兔抗人磷酸化 STAT3(PhosphoTyr705) 多克隆抗体为美国 Signalway公司产品。SP免疫组化试剂盒及 DAB显色试剂盒均购自北京中杉公司。1.3 实验方法 采用免疫组化 SP法。用已知的阳性标本作阳性对照，PBS 代替一抗作阴性对照。全部标本经 100mL/L中性甲醛固定，石蜡包埋，4m 连续切片。切片经常规脱蜡、水化后，高压修复抗原，30mL/L过
9、氧化氢孵育 5min以阻断内源性过氧化物酶;正常山羊血清封闭20min。滴加稀释好的一抗(LMP1 为 1100 稀释，STAT3 和 pSTAT3 均为 150 稀释)，4过夜孵育。滴加 1100 生物素标记的二抗，室温孵育 15min。滴加辣根过氧化物酶标记的卵白素，室温孵育 15min。DAB 显色，苏木素复染细胞核，脱水、透明、中性树脂封片。1.4 结果判断 每一批免疫组化染色均设已知阳性对照和用 PBS代替一抗的空白对照。LMP1 阳性表达定位于胞膜和胞质，STAT3 阳性表达定位于胞质，pSTAT3 阳性表达定位于胞核和胞质。由两名病理诊断医生分别对实验结果进行双盲法评估。每一切片
10、随机选择 5个视野(100)，在显微镜(400)下计数每个视野 100个肿瘤细胞，非癌组织则计数着色区100个细胞中阳性细胞的比例，取 5个视野的平均百分数为判定结果。评分标准参照文献34 作适当修改：阳性细胞数5%为 0分;6%25%为1分;26%50%为 2分;51%75%为 3分;75%为 4分。染色强度：0 分为无染色;1 分为淡黄色;2 分为棕黄色;3 分为深棕色。免疫组化染色结果根据阳性细胞数和染色强度分别评分，两者乘积 01 分为阴性(-);23 分为阳性(+);4分以上为强阳性() 。1.5 统计学分析 实验资料采用统计学软件 SPSS for Windows 11.0做四格表
11、的卡方检验，Spearman 等级相关分析。P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 STAT3、pSTAT3 和 LMP1蛋白在鼻咽癌及慢性鼻咽炎组织中的表达情况 STAT3和 pSTAT3 蛋白在癌细胞中多呈阳性或强阳性表达;癌旁组织的淋巴细胞及慢性鼻咽炎黏膜上皮细胞中也有少量表达，但表达强度远不及癌细胞。STAT3 蛋白表达定位于细胞胞质，pSTAT3 蛋白主要以胞核表达为主，胞质也有不同程度的表达。LMP1主要表达于癌细胞胞膜和胞质，染色强度从淡黄色到棕黄色不等。鼻咽癌组织中 STAT3、pSTAT3 及 LMP1的阳性率均明显高于慢性鼻咽炎组织，差异有统计学意义(P0.01，
12、表 1及图 1)。其中 19例鼻咽癌组织表现为 STAT3和 pSTAT3 共阳性表达。表 1 鼻咽癌和慢性鼻咽炎组织中 STAT3、pSTAT3 及 LMP1的表达情况2.2 鼻咽癌组织中 LMP1和 STAT3、pSTAT3 表达的相互关系 Spearman相关性分析结果表明，鼻咽癌组织中，LMP1 和 pSTAT3 表达呈正相关(rs=0.302，P0.05);LMP1 与 STAT3表达无明显相关(P0.05，表 2)。表 2 鼻咽癌组织中 LMP1和 STAT3及 pSTAT3 表达的相互关系3 讨 论STAT3 为一种胞质蛋白，被多种细胞因子、生长因子及细胞内酪氨酸蛋白激酶等激活后
13、其第 705位酪氨酸磷酸化而 pSTAT3 蛋白随后形成蛋白二聚体并转位入核，结合在特定基因的启动子上，诱导相应基因的表达5。在正常生理状态下，STAT3 的激活是快速而短暂的，对于正常细胞的生理功能起着重要作用。STAT3 过度激活后诱导 cmyc 、cyclinD1 等多种与细胞增殖、分化、凋亡密切相关的关键基因的异常高表达，从而促进细胞增殖和恶性转化，表现出致癌作用6。由于持续激活的 STAT3会使培养细胞发生恶性转化并能在裸鼠中形成肿瘤7，STAT3 已被认为是一种癌基因。研究发现，STAT3 在人类多种恶性肿瘤如血液系统肿瘤、头颈部鳞状细胞癌中持续激活89 。HSIAO 等10发现
14、STAT3在鼻咽癌中有高表达，但其活化情况尚不清楚。本研究同时观察了鼻咽癌组织中 STAT3和 pSTAT3 蛋白的表达，发现鼻咽癌组织中 STAT3和 pSTAT3 表达水平均明显高于慢性鼻咽炎组织，提示鼻咽癌组织中 STAT3不仅高表达，并且呈持续激活状态，STAT3蛋白在鼻咽癌发展过程中可能扮演重要的角色。LMP1 是 EBV编码的具有转化细胞功能的癌基因。CHEN 等11研究发现在鼻咽癌细胞中，LMP1 可通过上调白细胞介素 6(IL6) 的表达而激活 STAT3，而 STAT3可与 EB病毒 LMP1启动子结合，促进基因的转录，从而形成一个正反馈调节机制，促使 STAT3在鼻咽癌中持
15、续活化及 LMP1持续表达。在鼻咽癌组织的研究中，LMP1 与 STAT3表达是否有相关性的结果尚不一致1213 。因此，我们利用 STAT3非磷酸化及磷酸化抗体分别检测鼻咽癌组织中 STAT3的表达水平及其活化状态。结果发现，鼻咽癌组织中 LMP1表达与 pSTAT3 表达呈正相关，而与 STAT3表达无明显相关，这提示了鼻咽癌组织中 LMP1可能通过某些机制直接活化 STAT3，而对 STAT3的表达水平无明显影响。由于 LMP1调节了多种基因的表达，除了 IL6 外，LMP1 还可通过哪些途径影响 STAT3的活化有待进一步的研究。【参考文献】1HU LF, CHEN F, ZHENG
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