1、垂盆草总黄酮的保肝降酶作用及其化学成分的鉴别研究【摘要】 目的进一步验证垂盆草总黄酮的保肝降酶作用，鉴别并确证垂盆草总黄酮的化学组成，为垂盆草药材质量控制指标的确认和质量标准的研究奠定基础。方法通过 CCl4 造模，考察垂盆草总黄酮对小鼠血清转氨酶的影响及对肝脏的保护作用。采用 HPLC 法，通过与各对照品对照，确证垂盆草总黄酮的化学组成。结果垂盆草总黄酮能显著降低小鼠血清 ALT 和 AST，并对肝脏有明显的保护作用;垂盆草总黄酮中至少含有槲皮素、山柰素、木犀草素等 8 种黄酮类化合物。结论垂盆草总黄酮是垂盆草中重要的保肝降酶活性部位之一，垂盆草总黄酮中至少含有槲皮素、山柰素、木犀草素等 8
2、 种黄酮类化合物。这为确认垂盆草药材的质量控制指标以及制定科学的质量标准奠定了基础。 【关键词】 垂盆草; 总黄酮; 保肝降酶 ; 高效液相色谱法垂盆草是景天科植物垂盆草 Sedum sarmentosum Bunge 的新鲜或干燥全草，味甘、淡，性凉，具有清热解毒、利尿消肿之效，主治急、慢性肝炎。化学研究表明，垂盆草主要含有糖类、黄酮类、三帖类及苷类成分。为配合垂盆草药材活性成分的筛选、指标成分的确认、质量标准的制订，在垂盆草不同提取部位保肝降酶试验的基础上，我们对分离、纯化到的垂盆草总黄酮进行了进一步的保肝降酶验证实验，并对其中的主要化学成分进行了鉴别确证。现将方法和结果报道如下。1 仪器
3、与材料Agilent1100 高效液相色谱仪，G1314A 紫外检测器，G1313A 自动进样系统，CAG Bootp 色谱工作站;日本岛津 LC-10ADVP 高效液相色谱仪，岛津 SPD-10AVP 紫外检测器，HW 色谱工作站;日本岛津 UV-2401 型可见紫外分光光度计;Olympus DX60 型显微镜，Olympus DP71 型图像获取系统;QP-B1 型切片漂烘温控仪，LEICA RM2145 型石蜡切片机;LEICA TR1020 型组织处理仪;RE-52A 型旋转蒸发仪; LXJ-IIB 型大容量多管离心机等。ALT 试剂盒(批号：20071112)、AST 试剂盒(批号
4、：20071112)均购自南京建成生物技术研究所;石蜡、苏木素、伊红及中性树脂等由南京中医药大学形态学教研室提供;甲醇、乙腈等试剂为色谱纯，四氯化碳、乙醇、正丁醇、醋酸乙酯、甲醛等试剂为分析纯，均购自上海久亿化学试剂有限公司;硅胶 G 由青岛海洋化工厂生产(供薄层层析用);生理盐水(批号：2007092502)购自南京小营制药有限公司。垂盆草总黄酮(纯度92.2%，比色法测定)自制。槲皮素对照品(批号：760701)，山柰素对照品(批号：0861-200002)，异鼠李素对照品(批号：0860-200103)，木犀草素对照品(批号：111520-200201)，金丝桃苷对照品(批号：1521-
5、200202)，木犀草苷对照品(批号：1192-061019)，芦丁对照品(批号：086-9303)，槲皮苷对照品(批号：235-2003012)，甘草苷对照品(批号：200522)均购自中国药品生物制品检定所;5，4-二羟基-3，5-二甲氧基黄酮-7-O-D-葡萄糖苷(苜蓿苷)、5，4-二羟基-8，3-二甲氧基黄酮-3，7-二-O-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3，7-二-O-D-葡萄糖苷均为自制品(经结构确证和归一化法纯度测定)。昆明种小鼠(体质量 1822 g，雌雄各半)由南京中医药大学实验动物中心提供。2 方法和结果2.1 垂盆草总黄酮的保肝降酶实验162.1.1 供试药物溶液的制备称取总黄
6、酮粉末 3.873 7 g(相当于200 g 生药)，加 0.5%羧甲基纤维素钠溶液至 100 ml，制成每毫升相当于2 g 生药的溶液。2.1.2 剂量设计根据垂盆草药材的临床人用剂量，折算成小鼠剂量，取其 5 倍量、10 倍量作为小鼠的给药剂量(经过预试验确定)，即高剂量 50 g(生药)/kg，低剂量 25 g(生药)/kg，再由总黄酮得率换算成供试药物溶液的给药量。2.1.3 动物分组共分为正常对照组、模型对照组和垂盆草总黄酮高、低剂量组共 4 组，每组 10 只小鼠，雌雄各半。给药组给予相应剂量的供试药物，正常对照组和模型对照组给予 0.5%羧甲基纤维素钠溶液(20 ml/kg)。2
7、.1.4 给药方法及肝损伤模型的制备各组动物定时按剂量灌胃，1次/d，给药 6 d，第 1 次给药前禁食不禁水 24 h。末次给药 1 h 后，除正常对照组小鼠腹腔注射花生油(10 ml/kg)外，其余各组小鼠均腹腔注射 0.1%CCl4 花生油溶液(10 ml/kg)，注射后正常给食给水。2.1.5 转氨酶测定腹腔注射 0.1%CCl4 花生油溶液 16 h 后，小鼠眼眶后静脉丛取血，置 37水浴中 30 min，取出，以 2 000 r/min 离心10 min，分离血清，采用赖氏法测定 ALT 和 AST 活性。结果见表 1。取血同时，取肝组织固定于 10%甲醛溶液中，供做组织切片用。表
8、 1 垂盆草总黄酮对血清中 ALT 及 AST 的影响2.1.6 肝脏病理切片检查取固定于 10%甲醛溶液中的小鼠肝脏，按常规制备病理切片，置显微镜下观察，用 Olympus DP71 图像获取系统摄片。病理切片检查结果如下：正常对照组：低倍镜下，肝脏结构正常，从肝被膜到整个肝实质组织(肝小叶、肝汇管区结构)未见任何病变。高倍镜下，肝小叶分界不明显，中央静脉未见扩张、淤血，肝细胞索结构、排列正常，肝细胞核圆，偶见双核。细胞质较疏松，未见肝细胞肿胀变性、坏死及炎性细胞浸润。肝血窦大小正常，其中偶见枯否氏细胞，不充血，汇管区的小叶间动脉、静脉、小叶间胆管结构正常，周围未见炎性细胞浸润，末端部分的汇
9、管区中，小叶间动脉不存在。模型对照组：低倍镜下，可见整个肝实质组织中有大量嗜酸性小体存在，汇管区结缔组织中有少量炎性细胞浸润。高倍镜下：在肝细胞索和肝窦内，可见大量的嗜酸性小体，肝细胞索排列完全异常。嗜酸性小体圆形、均质，嗜酸性染色。偶见固缩的肝细胞核偏于一侧，有时几个嗜酸性小体聚积在一起，肝血窦扩张，内皮肿胀，可见数个嗜酸性小体位于其中。残存的肝细胞大多肿胀，汇管区和肝中央静脉的结缔组织中可见炎性细胞浸润，偶见坏死灶。总黄酮高剂量组：低倍镜下，肝组织中未见有嗜酸性小体存在，肝细胞形态、大小以及肝细胞索排列均正常。汇管区、中央静脉未见有炎性细胞浸润。高倍镜下，肝细胞索及肝窦中未见有嗜酸性小体，
10、肝细胞不肿胀，肝窦大小正常，汇管区及中央静脉周围无炎性细胞浸润，未见有点状坏死灶。总黄酮低剂量组：低倍镜下，肝组织中偶见有一两个嗜酸性小体，肝细胞索排列较乱，肝窦窄小，肝细胞轻度肿胀，汇管区、中央静脉周围未见有炎性细胞浸润。高倍镜下，肝细胞索及肝窦中偶见有嗜酸性小体，未见点状坏死灶，肝细胞稍肿胀，肝细胞索排列较乱。2.1.7 结论上述结果表明，垂盆草总黄酮能显著降低小鼠血清 ALT和 AST，剂量与降酶幅度有一定的相关性。病理切片检查结果显示，垂盆草总黄酮有明显的保护肝脏的作用。提示垂盆草总黄酮是垂盆草中重要的保肝降酶活性部位之一。2.2 垂盆草总黄酮中化学成分的鉴别研究2.2.1 供试品溶液
11、的制备称得总黄酮粉末 0.096 8 g，精密加入甲醇 10 ml，超声使充分溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。2.2.2 对照品溶液的制备分别取适量槲皮素、山柰素、异鼠李素、木犀草素、槲皮苷、木犀草苷、金丝桃苷、甘草苷、芦丁、异鼠李素-3,7-二-O-D-葡萄糖苷、5,4-二羟基-3,5-二甲氧基黄酮-7-O-D-葡萄糖苷(苜蓿苷)、5,4-二羟基-8，3-二甲氧基黄酮-3,7-二-O-D-葡萄糖苷对照品，加甲醇制成一定浓度的对照品溶液。2.2.3 HPLC 法鉴别确证本法主要是通过比较在完全相同的色谱条件下，供试品溶液与对照品溶液中相应峰的绝对保留时间来进行初步推断，再通过对照品加入法进行进
12、一步确证。2.2.3.1 恒度洗脱7色谱条件：日本岛津 LC-10ADVP 高效液相色谱仪，岛津 SPD-10AVP 紫外检测器，HW 色谱工作站。AichromBond-AQ-C18 柱(4.6 mm150 mm，5 m);柱温：30;检测波长：360 nm;手动进样，进样量：10 l。流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液(5050)。分别精密吸取供试品溶液及槲皮素、木犀草素、山柰素、异鼠李素对照品溶液各 10l，注入液相色谱仪，色谱图见图 15，各峰的保留时间见表 2。从色谱图和表 2 可以看出，各对照品峰与供试品溶液中各对应峰的保留时间相差均在 0.65 min 以内，而且供试品溶液中各对应峰
13、旁边无其他杂质峰干扰，因此，我们可以初步推断供试品中可能含有槲皮素、木犀草素、山柰素、异鼠李素。流动相：甲醇-水-乙腈-冰醋酸(108080.2)。分别精密吸取供试品溶液及异鼠李素-3,7-二-O-D-葡萄糖苷对照品溶液各 10 l，注入液相色谱仪，色谱图见图 67。对照品溶液主峰的保留时间为 12.019 min，供试品溶液中与之对应的峰保留时间为11.675 min，二者相差 0.344 min，说明供试品中有可能含有异鼠李素-3,7-二-O-D-葡萄糖苷。图 1 槲皮素对照品 图 2 山柰素对照品(流动相) (流动相)图 3 木犀草素对照品 图 4 异鼠李素对照品(流动相) (流动相)图
14、 5 供试品溶液(流动相;1、2、3、4 分别为对应的色谱峰)表2 对照品与供试品中各对应峰的保留时间 min2.2.3.2 梯度洗脱8，9色谱条件：Agilent 1100 高效液相色谱仪，G1314A 紫外检测器，G1313A 自动进样系统，CAG Bootp 色谱工作站。SunFire TM C18 柱(4.6 mm250 mm，5 m);柱温：30;检测波长：360nm;自动进样，进样量：10 l。流动相：见表 3。分别精密吸取供试品溶液及槲皮素、山柰素、异鼠李素、木犀草素、槲皮苷、芦丁、异鼠李素-3,7-二-O-D-葡萄糖苷、苜蓿苷、5,4-二羟基-8，3-二甲氧基黄酮-3,7-二-
15、O-D-葡萄糖苷对照品溶液各 10 l，注入液相色谱仪，部分色谱图见图 814，其对应峰的保留时间见表 4。图 6 异鼠李素-3，7-二-0-D-葡萄糖苷对照品(流动相)图 7 供试品溶液(流动相)表 3 流动相梯度变化程序从色谱图和表 4 可以看出，各对照品峰与供试品溶液中各对应峰的保留时间相差均在 0.21 min 以内，但各峰差异较大，且供试品溶液中各对应峰旁边有较多的杂质峰干扰，为了进一步确证供试品中是否存在上述成分，我们将采用对照品加入法进行进一步验证。图 8 5,4-二羟基 8,3 图 9 槲皮苷(流动相)-二甲氧基黄酮-3,7-二-O-D-葡萄糖苷(流动相)在相同的色谱条件下，分
16、别精密吸取供试品溶液及木犀草苷、金丝桃苷和甘草苷对照品溶液各 10l，注入液相色谱仪，色谱图见图1517(由于木犀草苷、金丝桃苷和甘草苷对照品稍后购得，未能与前面几种对照品同时进行实验)。从色谱图中可以看出，木犀草苷和金丝桃苷对照品峰保留时间分别为 34.810 min 和 33.669 min，供试品溶液与其对应的峰的保留时间分别为 34.820 min 和 33.823 min，两者非常接近，且供试品中两峰周围没有明显的干扰。甘草苷对照品峰的保留时间是31.806 min，在供试品溶液中没有与之相对应的峰。为了更进一步确认总黄酮中含有木犀草苷和金丝桃苷，同样将采用对照品加入法进行验证。2.
17、2.3.3 对照品加入法根据上述试验中供试品溶液和各对照品溶液的浓度及进一定量后各相应色谱峰峰面积大小，分别取适量供试品溶液，加入一定量槲皮素、山柰素、木犀草素、槲皮苷、苜蓿苷、5,4-二羟基 8,3-二甲氧基黄酮-3,7-二-O-D-葡萄糖苷对照品溶液，稀释至一定体积(混合液)，使供试品溶液的浓度稀释一倍，而供试品中有可能含有的上述 6 种单体成分的浓度与原供试品溶液中的浓度基本一致。精密吸取混合液10l，注入液相色谱仪，在以上梯度洗脱条件下进行色谱分析，混合液色谱图见图 18，原供试品溶液与混合液对照图见图 19，各对应峰的参数比较见表 5。图 10 苜蓿苷(流动相) 图 11 木犀草素(
18、流动相)图 12 槲皮素(流动相) 图 13 山柰素(流动相)图14 供试品溶液(流动相)表 4 对照品与供试品中各对应峰的保留时间在此色谱条件下，供试品中没有与芦丁、异鼠李素以及异鼠李素-3,7-二-O-D-葡萄糖苷相对应的色谱峰由色谱图及表 5 可知，原供试品溶液及混合液在完全相同的色谱条件下，进相同体积的溶液，上述 6 个色谱峰峰高和峰面积基本一致或略有变化(大多变大)，保留时间非常接近，用归一化法计算所得的相对峰面积全部变大，而其他峰的峰高或峰面积则显著变小，另外混合液中对应的这 6 个色谱峰非常平滑，显然，说明供试品溶液中含有以上6 种单体成分。用同样的方法制得供试品溶液与木犀草苷、
19、金丝桃苷的混合液(混合液)。精密吸取混合液和混合液各 10l，注入液相色谱仪，在以上梯度洗脱条件下进行色谱分析，混合液色谱图见图 20，原供试品溶液与混合液对照图见图 21，各对应峰的参数比较见表 5。由色谱图及表 5 可知，原供试品溶液及混合液在完全相同的色谱条件下，进相同体积的溶液，上述 2 个色谱峰峰高和峰面积基本一致或有增加，保留时间非常接近，用归一化法计算所得的相对峰面积全部变大，而其他峰的峰高或峰面积则显著变小，另外混合液中对应的这2 个色谱峰非常平滑，显然，说明供试品溶液中含有这 2 种单体成分。图15 金丝桃苷(流动相) 图 16 木犀草苷(流动相)图 17 供试品(流动相)图
20、 18 混合液(流动相)图 19 原供试品溶液与混合液对比图(流动相)表 5 各对应峰参数比较图 20 混合液(流动相) 图 21 原供试品溶液与混合液对比图(流动相)2.2.4 结论根据以上实验结果，现可基本确认垂盆草总黄酮中含有槲皮素、山柰素、木犀草素、苜蓿苷、槲皮苷、金丝桃苷、木犀草苷、5,4-二羟基-8,3-二甲氧基黄酮-3,7-二-O-D-葡萄糖苷 8 种黄酮类化合物，异鼠李素和异鼠李素-3,7-二-O-D-葡萄糖苷可能由于含量较少，在梯度洗脱时被杂质峰所覆盖，尚有待进一步研究确认。以上 10种黄酮类化合物的结构式如下：槲皮素(Quercetin ) 山柰素(Kaempferol)木
21、犀草素 苜蓿苷(Luteolin) (Tricin-7-O-D-lucopyranoside)槲皮苷 (Quercitrin) 金丝桃苷 (Hypericin)木犀草苷 5,4-二羟基-8,3- (Luteolin-7-O- 二甲氧基黄酮-3,7-二 -D- lucopyranoside) -O-D-葡萄糖苷(5,4-dihydroxy-8,3-dimethoxyflavone 3,7-di-O-glyside)异鼠李素 异鼠李素(Isorhamnetin) -3,7-二-O-D-葡萄糖苷(Isorhamnetin-3,7-diglucos)3 讨论通过药理实验可以证明，垂盆草总黄酮是垂盆草中
22、重要的保肝降酶活性部位之一，它能显著降低小鼠血清 ALT 和 AST，并有明显的保护肝脏的作用。化学研究表明，垂盆草总黄酮中至少含有槲皮素、山柰素、木犀草素、苜蓿苷、槲皮苷、金丝桃苷、木犀草苷、5,4-二羟基-8,3-二甲氧基黄酮-3,7-二-O-D-葡萄糖苷 8 种黄酮类化合物。这为确认垂盆草药材的质量控制指标以及制定科学的质量标准奠定了基础。本项研究的综合意义有：基本确定了能体现垂盆草内在质量、专属性较强的质量控制指标性成分。为垂盆草药材抗病毒性肝炎的深度开发研究提供了线索，创造了条件。为最终建立起科学而又切实可行的垂盆草药材质量标准奠定了良好的基础。【参考文献】1 贺松其，吕志平，文 彬，等.茵陈紫金汤对小鼠四氯化碳急性肝损伤的保护作用J.中国中西医结合消化杂志，2005，13(1)：26.2 李淑莲，刘成德，付 克.肝愈胶囊对小鼠四氯化碳急性肝损伤的保护作用J.中医药学报，2005，33(6)：22.3 童 英，吴少平，阎向东，等.麦胚黄酮对四氯化碳急性肝损伤的保护作用J.毒理学杂志，2006，20(3)：177.4 张均田.现代药理实验方法学M.北京：北京医科大学、协和医科大学联合出版社，1997.5 阎向东，童 英，郑 珊，等.急性四氯化碳致大、小鼠肝损害程
