1、丹酚酸 B 诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化【摘要】 目的：体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs） ，并研究中药单体丹酚酸 B诱导 MSCs向心肌样细胞分化. 方法：用贴壁培养法分离、培养、纯化 MSCs，免疫荧光法检测细胞抗原 CD44和 CD34. 分别用含 5 mol/L 的 5 氮胞苷（5aza ）和 30 mg/L丹酚酸 B的低糖 DMEM培养液培养 MSCs 24 h后，RTPCR 法检测培养1，7，14 和 21 d心肌特异性转录因子 NKX2.5，GATA4 和心肌特异性蛋白 actin mRNA的表达， 用免疫荧光法检测诱导后 actin 的表达情况. 结果
2、：获得纯化的 MSCs，免疫荧光检测细胞表面标记 CD44呈阳性，CD34 呈阴性. 诱导后细胞形态逐渐发生变化. RTPCR 显示 NKX2.5和 GATA4 mRNA在 MSCs有基础性的表达，而分别以 5aza 和丹酚酸 B处理 24 h后，NKX2.5 和 GATA4 mRNA表达增强，7 d时表达达高峰，以后维持在高水平，与空白对照组相比，有统计学差异(P0.01). 未诱导的 MSCs actin mRNA表达呈阴性，丹酚酸 B诱导后的第 14日，出现 actin mRNA的表达. 结论：用贴壁培养法可获得纯化的 MSCs，丹酚酸 B可诱导 MSCs向心肌样细胞分化. 【关键词】
3、骨髓间充质干细胞 细胞培养 丹酚酸 B 心肌细胞 0引言 当前，细胞移植作为一项极具开创性意义的治疗方法及技术用于改善心功能及心肌活力已受到广泛关注. 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)存在于骨髓基质中，由于 MSCs取材方便、操作简单、增殖能力强，且具有干细胞的多向分化潜能，可被诱导成为间充质来源的多种成体细胞1-3等特点，被称为是组织工程最具应用前景的一种干细胞，将 MSCs诱导分化为心肌细胞来修复死亡的心肌组织，具有一定的临床意义. MSCs向心肌细胞定向分化需要一定的诱发因素. 体外研究大多学者都使用 5 氮胞苷（5 Azacytidine，5
4、aza ）作为诱导剂对 MSCs进行诱导分化为心肌细胞. 然而作为一种白血病化疗药物，5aza 会残留在细胞 DNA中4 ，因此诱导后的移植细胞潜在的生物安全性令人担忧. 而中药具有临床应用安全和长期有效的特点，许多中药制剂、单味中药及中药单体都具有诱导细胞分化成分. 丹酚酸 B是丹参水溶性成分中最主要的活性成分，具有和一些诱导剂（如 巯基乙醇、DMSO）相似的抗氧化作用，因此开展丹酚酸 B诱导 MSCs分化有一定的开创性. 1材料和方法 1.1材料实验动物：SD 大鼠，雄性，体质量 90100 g，由广州中医药大学实验动物中心提供. 主要试剂：DMEM 培养基（GBICO/BRL）,胎牛血清
5、（奥地利 PAA）,丹酚酸 B（广州市药检所，标准品）,5aza(Sigma),兔抗大鼠 CD44多抗（博士德）,兔抗大鼠 CD34多抗（博士德） ，CY3 标记的羊抗兔 IgG（博士德）,Hoechst33342 (Sigma),AllPrep RNA/Protein Kit（Qiagen）,OneStep RTPCR Kit（Qiagen）. 1.2方法 1.2.1MSCs分离、培养无菌条件下取大鼠股骨，以含 150 mL/L胎牛血清的 DMEM 培养液冲洗髓腔，以 5109个/L 接种. 当细胞接近 80%铺满瓶底后，以 2.0108个/L 细胞的密度接种于传代培养瓶中进行扩增培养. 取
6、第 3代的 MSCs进行实验. 1.2.2MSCs鉴定 1.2.2.1形态学鉴定相差显微镜下观察细胞形态，拍照. 1.2.2.2免疫荧光鉴定 MSCs种于盖玻片上，步骤如下：多聚甲醛室温固定 30 min，PBS 洗 3次，每次 3 min. 加入含 5 mL/L Triton X100 和 50 mL/L BSA 的 PBS， 30 min后用 PBS洗 3次，每次 3 min. 加一抗兔抗大鼠 CD44（1100）, 兔抗大鼠 CD34（1100）多克隆抗体，各 100 L，放入湿盒内 4过夜. 用 PBS 冲洗 3次，每次 5 min. 加入荧光二抗 Cy3IgG （1100） ，室温下
7、避光孵育 30 min后，用 PBS冲洗3次，每次 5 min. 加 10 mg/L的 Hoechst 33342溶液，放入湿盒内 37避光孵育 10 min. PBS清洗 3次，每次 3 min. 在激光共聚焦显微镜下观察并拍照. 对照片滴加 PBS代替一抗，其余相同. 1.2.3丹酚酸 B诱导 MSCs向心肌样细胞分化将对数生长期的 P3 MSCs以 2.0108个/L 接种于 6孔板内，每孔 1 mL. 待细胞生长至亚融合状态（约第 3日） ，将细胞分为 3组，每组 8个孔. A组细胞用 MSCs完全培养基、B 组细胞用终浓度为 5 moL/L 的 5aza 培养基、C 组细胞用含丹酚酸
8、 B 30 mg/L的培养基共同培育 24 h后，吸弃培养基，用 PBS清洗 3次，加入 MSCs完全培养基继续培养. 分别在诱导 1，7，14 和 21 d后收集细胞，提取细胞总 RNA，检测浓度后进行 RTPCR 检测 NKX2.5, GATA4, actin mRNA的表达. 提取总 RNA作为模板，经电泳鉴定其完整性后，利用紫外分光光度计测定 A260与 A280的比值，并计算其浓度. 设 actin 为内参照. 取 40 mg/L的 RNA，反应体系为 25 L，循环参数： 95 30 s，55 30 s，72 45 s，共 33循环进行 RTPCR. 取 5 L RTPCR 产物，
9、经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用凝胶成像系统扫描分析 NKX2.5, GATA4, actin 基因与内参 actin 的光吸收比值. 进行 3次独立实验. RTPCR 引物用 primer premier 5.0软件设计，序列为 Nkx2.5的上游引物 CAGAACCGCCGCTACAAG，下游引物 AGTCCCCGACGCCAAAGT，预期大小 325 bp；GATA4 的上游引物 CTGTCATCTCACTATGGGCA，下游引物CCAAGTCCGAGCAGGAATTT，预期大小 257 bp；actin 的上游引物GGAGAACCACAGGCATTG，下游引物 CATCGGGAA
10、GTTCGTAGC，预期大小 297 bp；actin 的上游引物 AGAGGGAAATCGTGCGTGAC，下游引物AGGAGCCAGGCAGTAATC，预期大小 353 bp. 统计学处理：实验数据用 SPSS 13.0统计软件进行处理，均数间比较使用单因素方差分析及 LSDt 检验，方差不齐用秩和检验. 2结果 2.1细胞形态观察原代培养 1 d后， 可见 MSCs呈长梭形贴壁生长并散在分布(图 1A)， 7 d后， 80%的细胞克隆融合， 可传代. 传代后， MSCs在 2 h内贴壁生长， 无潜伏期， 克隆状增殖， 细胞形态较一致， 多为长梭形， 呈“旋涡”样生长(图 1B)， 56
11、d 可再传代. 2.2免疫荧光鉴定 MSCs细胞呈 CD44阳性，见胞质呈红色（CY3） ，胞核呈蓝色（Hoechst33342） （图 1C） ；而 CD34呈阴性，胞质未见红色，仅见胞核呈蓝色（图 1D） ，阴性对照片也仅见蓝色的胞核. 2.3诱导后细胞形态的变化细胞诱导前呈长梭形（图 2A） ，30 mg/L的丹酚酸 B诱导 1 wk后，形态逐渐发生变化，细胞体积增大，呈球形或棒状（图 2B） ，诱导 14 d左右细胞相互融合，形成肌管样结构（图 2C） ，诱导 21 d肌管样结构明显增多，部分细胞聚集，形成一个球形的聚集物（图 2D）. 5aza 组的细胞的变化过程和丹酚酸 B组相似.
12、 2.4丹酚酸 B诱导 MSCs向心肌样细胞分化过程中相关基因表达的变化 RTPCR 扩增基因片段后，20 g/L琼脂糖凝胶检测到 NKX2.5和GATA4 mRNAA: 原代培养 1 dMSCs 200; B: 传代 MSCs 200; C: CD44阳性1000; D: CD34阴性1000.表 1NKX2.5 mRNA的 RTPCR 产物的相对光密度值 3讨论 现在还没有发现 MSCs的特异表面分子5-6. 目前认为 MSCs表达SH2, SH3, SH4, CD9, CD10, CD29, CD44, CD51, CD54, CD58, CD59, CD61, CD62, CD80,
13、CD90, CD102, CD106, CD120, CD121, CD123, CD126, CD127, CD140, CD147, CD166，但它不表达造血谱系特异的表面分子，如 CD14, CD34, CD38, CD45等. 实验通过多次传代纯化 MSCs，并通过免疫荧光法检测了第 3代 MSCs的 CD44和 CD34，结果显示 CD44呈阳性，而 CD34呈阴性，进而鉴定了 MSCs.表 2GATA4 mRNA的 RTPCR 产物的相对光密度值 发生生物学的研究表明 NKX2.5, GATA4 等心肌细胞特异性的基因在心肌发生中扮演重要角色，是胚胎干细胞向心肌细胞分化的重要启动
14、基因7-10. NKX2.5基因在心肌细胞分化前就开始表达，是心脏发生中最早表达的转录因子，心脏前体细胞分化的最早标志物. GATA4 基因也是心脏前体细胞的最早期标志之一，调节心肌细胞的发生、分化及心脏前体细胞形成线状心管. 本实验发现，NKX2.5, GATA4 基因在诱导前有不同程度的弱表达，可能是因为这些基因在体内各组织器官表达的广泛性. 这些基因在诱导后 1 d表达开始增强，7 d时达高峰，诱导后 7 d MSCs形态即发生变化，14 d时心肌细胞重要结构蛋白 actin 显著表达，开始具有心肌细胞的表型. 在丹酚酸 B诱导 MSCs分化为心肌细胞的过程中推测丹酚酸 B促进了这两个基
15、因的表达，从而促进心肌细胞结构蛋白的表达. 丹酚酸 B的诱导骨髓 MSCs分化心肌细胞机制目前尚未清楚. 推测，丹酚酸 B在诱导 MSCs转变为心肌样细胞中的作用估计与其影响心肌细胞相关调控基因(包括 GATA4, NKX2.5)和(或)改变骨髓基质微环境，分泌某些细胞诱导因子有关，但确切机制尚有待于进一步探讨. 而 MSCs的分化机制研究是当前 MSCs研究的重点和难点，如果在该方面取得突破性进展，将对 MSCs的临床应用产生深远的影响. 【参考文献】 1 Rangappa S, Entwistle JW, Wechsler AS, et al. Cardiomyocytemediated
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