1、服耐受及鼻粘膜耐受治疗神经系统自身免疫病 Wells 早在 1911 年发现，豚鼠喂食外源性蛋白数周后可抗御注射该蛋白所引起的严重免疫反应，即所谓免疫耐受(immunological tolerance)。但人们注意到获得性免疫耐受可作为许多自身免疫病的治疗途径，并成为临床医学和免疫学研究的热点，则是最近 10 余年的事情。1 口服及鼻粘膜免疫耐受是治疗自身免疫病的可能出路 自身免疫病目前多采用免疫抑制剂治疗，易使患者免疫系统受到普遍性抑制而诱发感染、发生肿瘤或骨髓抑制，也不能有效地防止疾病复发。这促使临床学家和免疫学家致力于寻找更合理的治疗途径，包括应用单克隆抗体或合成多肽等高新技术，特异性
2、地阻断启动免疫攻击的免疫细胞或封闭免疫分子，其必要前提是确定致病的免疫细胞或免疫分子，这在目前还难以做到1 。口服和鼻粘膜免疫耐受不需确定作用部位，且有特异性免疫抑制的优点，这一途径一旦成功，会使人感到有些困难的事情做起来竟如此简单。 免疫耐受是机体的免疫系统在接触某种抗原后所产生的对该抗原的特异性无应答状态，是免疫应答的一种特殊形式。针对多发性硬化(MS)的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和重症肌无力(MG)的动物模型实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)的口服和鼻粘膜耐受实验研究方兴未艾，取得了令世人瞩目的可喜进展27 。目前研究趋势表明，到本世纪末或稍长一点的时间内，免疫耐受有
3、可能找到最适宜、合理、方便和有效的途径而应用于临床。这一治疗途径有希望解决许多自身免疫病的治疗难题，免疫耐受原如选择自身抗原(autoantigen)可防治自身免疫病；选用同种异体抗原(alloantigen)可阻止移植排斥反应或延长同种异体移植物的存活时间；使用半抗原(hapten)可防治变态反应性疾病。因此，免疫耐受研究的临床意义及其应用前景是显而易见的。 2 免疫耐受的实验研究现状及其机制研究 免疫耐受的确切机理迄今不明。美国哈佛大学医学院 Brigham Women 医院神经科 Weiner 领导的研究组，自 1986 年开始 MS 的免疫耐受研究。他认为服用抗原的作用如同使用疫苗，但
4、这种“疫苗”是获取免疫抑制，而不是通常的免疫应答。他们发现用致脑炎源性髓鞘素碱性蛋白(MBP)免疫大鼠诱发 EAE 之前，若喂食大鼠一定量的 MBP 即可抑制 EAE病变和临床症状的发生2,8 。Ohio 大学由 Whitacre 领导的研究组也获得了同样的结果9 。其后类似的研究也证明，口服抗原对抑制多种实验性自身免疫病的发生是有效的。如：大鼠口服软骨的主要成分胶原可抑制注射胶原后引起的实验性关节炎10 ；喂食大鼠视网膜提取的蛋白-S 可防止该抗原诱发的实验性自身免疫性葡萄膜炎11 ；喂食大鼠乙酰胆碱受体(AChR)可预防 EAMG 的发生5 ；给小鼠喂食猪胰岛素可预防非肥胖型小鼠发生糖尿病
5、12 。这些研究结果表明，人工免疫耐受是防治自身免疫病的一种很有希望的途径。当然，这一研究的最终目的不是预防自身免疫病(因目前尚无法预测其在个体中发生的可能性)，而是试图终止或减弱机体已发生的异常免疫应答。 Lider 指出，喂食抗原可诱导 CD8+抑制性 T 细胞的激活，并可抑制其他免疫细胞活性，包括攻击该类抗原的特异性淋巴细胞。Weiner 等认为，CD8+T 细胞的作用可能源于其释放的转化生长因子-(transforming growth factor-,TGF-)8,13 ，TGF- 是抑制淋巴细胞反应的细胞因子，可关闭免疫应答信号。但 Whitacre 根据她的研究结果，确信免疫耐受
6、是由于特异性细胞克隆的消除(clone delection)或克隆无反应性(clone anergy)，即对该抗原发生反应的免疫性 T 细胞功能失活，而并非由于 CD8+抑制性 T 细胞的激活9 。 Higgins2等发现免疫耐受均以抗原剂量依赖方式使临床症状及病理改变受到抑制，并发现大鼠服食 MBP 致脑炎片段和非致脑炎片段均可抑制发病，且后者反而能获得更完全的免疫抑制，这提示 MBP 分子中抑制表型存在于与其致脑炎源区截然不同的部位。Miller 等发现了非常有趣的抗原驱动旁观者抑制现象(antigen-driven bystander suppression)14 。喂食 Lewis 大
7、鼠卵清白蛋白(OVA)，然后用 MBP+ 完全福氏佐剂(CFA)+OVA 给大鼠皮下注射，大鼠可免于发生 EAE；若喂食OVA 的大鼠用 MBP+CFA 皮下注射，未加 OVA，则不能防止发生 EAE。抗原驱动旁观者抑制现象显然是口服抗原诱导的抗原驱动外周免疫耐受的一种重要机制，并推测它是发生在一种微环境中，这可以解释口服耐受产生的抗原特异性抑制。 3 口服及鼻粘膜免疫耐受治疗神经免疫病的现状与前景 口服和鼻粘膜免疫耐受使用方便，没有毒性，与临床应用的目标更为接近。人工免疫耐受与天然免疫耐受不同，过一段时间会自然消除，免疫耐受的维持有赖于耐受原的持续存在，即患者可能需要长时间或终生口服抗原。虽
8、然口服抗原提供了一种诱导系统耐受的方便途径，但最初人们所看到的临床应用价值却非常有限，因即使反复口服大量的耐受原，产生的耐受效应也是短暂和微弱的。更何况高纯度抗原的提取和纯化工艺复杂，价格昂贵，在已发病的动物宿主诱导耐受也难以控制发病。因此，如何将免疫耐受的治疗策略付诸临床实施，即制定一个最佳的耐受原处方和找到一个最佳耐受途径，成为当前研究的焦点。这一处方应满足以下两条要求，一是尽可能减少耐受原的用量，以降低花费；二是尽可能延长诱导免疫耐受的持续时间。 近年来各国学者在这一领域竞相探索，已经取得了一些进展。用霍乱弧菌 B 亚单位(cholera toxin B subunit, CTB)作为经
9、肠粘膜的载体-释放系统的实验研究即是一个好的开端15 。霍乱弧菌肠毒素属于外毒素，是相对分子质量约 84000 的蛋白质，含 A、B 两个亚单位，A 亚单位相对分子质量为 28000，是具有毒性的致病原；B 亚单位相对分子质量为56 000,可与小肠粘膜的上皮细胞受体单唾液酸神经节苷脂(GM1)结合，不具有毒性。由于 B 亚单位可与肠道或其他部位粘膜受体牢固结合，使连结于 B 亚单位的抗原长时间地与肠道集合淋巴小结等处的免疫活性细胞接触，使之发生识别，通过尚未确定的免疫耐受机制对口服抗原产生免疫耐受效应。给未经免疫和已经免疫的小鼠一次口服与 CTB 偶联的小量颗粒性和可溶性抗原，可明显地抑制其
10、系统性免疫应答。喂食一次剂量的 CTB 偶联抗原之后，其早期(24 h)和晚期(2448 h)迟发性超敏反应受到强烈的抑制，血清抗体反应也有所下降。免疫大鼠发病之前或之后，喂食小量偶联于 CTB 的 MBP 抗原即可预防发生 EAE。而且，抑制IL-2 产生和 T 细胞增殖试验与反复喂食 50100 倍单一 MBP 的效果相似。所不同的是，大量喂食抗原可使淋巴结 T 细胞产生 IFN- 减少，小剂量偶联 MBP 常伴有 IFN- 生成增加16 ，这提示口服 CTB 偶联髓鞘素自身抗原预防 EAE 可能有免疫调节机制参与。 经鼻粘膜给予 AChR 有效地抑制 EAMG 的实验研究是这一领域的最新
11、成果7,17,18 。其优势是抗原用量是微克级，约为口服剂量的 1/100，与 CTB 偶联方式的用量类似，但比后者更方便。经鼻粘膜耐受不仅可有效地抑制临床症状，也有效地下调 AChR 特异性 B 和 T 细胞免疫应答，如抑制 EAMG 实验大鼠 AChR 特异性 IgG 抗体分泌细胞和血清 AChR-Ab 水平，减轻对 AChR 的迟发性超敏反应，抑制免疫接种区域的腹股沟淋巴结 AChR自身应答性 IFN- 分泌性 T 细胞反应。 目前口服及鼻粘膜免疫耐受动物实验结果已使研究者们对开始人体实验充满信心。在 MS、类风湿性关节炎(RA)、眼葡萄膜炎和糖尿病患者所进行的先期实验已被证明有肯定的效
12、果，无明显毒性，并显示 T 细胞自身应答降低1921 。Weiner 曾在 30 例早期复发-缓解 MS 患者进行口服髓鞘素的临床实验研究19 ，这些患者入院前 24 个月都至少经历了 2 次确定的临床发作。按随机双盲原则分为 2 组，每组 15 例，治疗组患者每日口服牛髓鞘素 300 mg,时间长达 1 年，另 15 例为服用安慰剂组。结果表明，服髓鞘素患者的临床反应因 HLA-DR2 表型不同而异，该表型在 MS 患者中较为多见。髓鞘素治疗组 HLA-DR2 表型阴性患者与安慰剂组比较临床有明显改善，6 例 HLA-DR2 阴性患者无 1 例发作；而 9 例用髓鞘素治疗的 HLA-DR2
13、阳性患者中，6 例仍有过临床发作。在动物实验有报告口服抗原在个别情况可增强已有的免疫应答，但在人类 MS 和 RA 免疫耐受治疗中尚未见到免疫应答增强22 。最近在 515 例复发-缓解型 MS 患者的双盲、安慰剂对照单次剂量牛髓鞘素口服耐受 3 期临床试验中，并未发现治疗组和对照组复发次数的差异，但 MRI 的改变显示治疗有效2 。 参考文献 1 Marx J. Testing of autoimmune therapy begins. Science, 1991, 252:27-28 2 Higgins PJ, Weiner HL. Suppression of experimental
14、autoimmune encephalomyelitis by oral administration of myelin basic protein and its fragments. J Immunol, 1988, 140:440-445 3 Meyer Al, Benson JM, Gienapp LE, et al. Suppression of murine chronic relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis by the oral administration of myelin basic protein.
15、J Immunol, 1996, 157:4230-4238 4 Miller A, Lider O, Al-Sabbagh A, et al. Suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis by oral administration of myelin basic protein. V. hierarchy of suppressionby myelin basic protein from different species. J neuroimmunol, 1992, 39:243-250 5 Wang ZY, He
16、B, Qiao J, et al. Suppression of experimental autoimmune myasthenia gravis and experimental allergic encephalomyelitis by oral administration of acetycholine receptor and myelin basic protein:double tolerance. J Neuroimmunol, 1995, 63:79-86 6 Whitacre CC, Gienapp IE, Meyer A, et al. Treatment of aut
17、oimmune diseases by oral tolerance to autoantigens. Clin Immunol Immunopathol,nbs p;1996, 80:31-37 7 Shi FD, Bai XF, Li HL, et al. Nasal tolerance in experimental autoimmune myasthenia gravis (EAMG): induction of protective tolerance in primed animals. clin Exp Immunol, 1998, 111:506-512 8 Weiner HL
18、, Zhang ZJ, Khoury SJ, et al. Antigen-driven peripheral immune tolerance. Ann NY Acad Sci, 1991, 636:227-232 9 Whitacre CC, Gienapp IE, Orosz CG, et al. Oral tolerance in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol, 1991, 147:2155-2163 10 Zhang ZJ, Lee CSY, Lider O, et al. Suppression of ad
19、juvant arthritis in lewis rats by oral administration of type II collegen. J Immunol, 1990,145:2489-2493 11 Nussenblatt RB, Caspi RR, Mahdi R, et al. Inhibition. of S-antigen induced experimental autoimmune uveoretinitis by oral induction of tolerance with S-antigen. J Immunol, 1990, 144:1689-1695 1
20、2 Zhang ZJ, Davidson L, Eisenbarth G, et al. Suppression of diabetes in the NOD mouse by oral administration of porcine insulin. Proc Natl Acad Sci USA,1991, 88:10252-10256 13 Lider O, Santos LMB, Lee CSY, et al. Suppression of experimental allergic encephalomye llitis by oral administration of myel
21、in basic protein. II. suppression of disease and in vitro immune responses is mediated by antigen-specific CD8+ T lymphocytes. J Immunol, 1989, 142:748-752 14 Miller A, Lider O, Weiner HL. Antigen-driven bystander suppression after oral administration of antigens. J Exp Med, 1991, 174:791-798 15 Sun
22、 JB, Holmgren, Czerkinsky C. Cholera toxin B subunit:an efficient transmucosal carrierdelivery system for induction of peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:10795-10799 16 Sun JB, Rask C, Olsson T, et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis by feedin
23、g myelin basic protein conjugated to cholera toxin B subuint. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:7196-7201 17 Ma CG, Zhang GX, Xiao BG, et al. Suppression of experimental autoimmune myasthenia gravis by nasal administration of acaetylcholine receptor. J neuroimmunol, 1995, 58:51-60 18 Ma CG, Zhang GX,
24、 Xiao BG, et al. Cellular mRNA expression of IFN- IL-4 and TGF- in rat nasally tolerized against experimental autoimmune myasthenia gravis. Clin Exp Immunol, 1996, 104:509-517 nbsp;19 Weiner HL, Mackin GA, Matsui M, et al. Double-blind pilot trial of tolerization with myelin antigens in multiple sclerosis. Science. 1993,259:1321-1324 20 Weiner HL, Friedman A, Miller A, et al. Oral tolerance:Immunologic mechanisms and treatment of murine and human organ-specific autoimmune diseases by oral administration
