1、肝硬化动物模型的研究进展作者：陈学新, 潘华, 郑月梅, 熊利泽【关键词】 肝硬化动物模型; 麻醉药; 肝脏大部分麻醉药在肝脏代谢，肝硬化对麻醉药及手术后苏醒影响较大，建立一个类似于人类肝硬化的动物模型是深入研究与肝硬化有关课题不可缺少的环节。理想的肝硬化模型应具有人类肝硬化的基本形态特征，其病理改变呈阶段性进展，且造模方法简单，模型形成率高，重现性好，动物死亡率低等特点。肝硬化因其病因的多样性、动物和人的种属差异等，迄今理想肝硬化动物模型的建立仍是临床研究和实验研究中的一个难点，理想模型制作尚未完全取得成功。病毒性肝硬化模型，特别是人乙肝病毒感染的动物模型，理应成为最理想的肝硬化动物模型。然
2、而，由于人乙肝病毒只能感染人和少数灵长类动物，所以长期以来，缺乏实际可用的动物模型，现在以化学和复合等因素制备的肝硬化模型多见。国内外学者进行了大量的动物实验，建立了一些比较成熟的肝硬化动物模型。由于每种模型的致病因素不同，产生肝硬化的具体机制、稳定性、重复性以及与人患病过程相似程度等也都不尽相同。本文就近年来肝硬化动物模型的研究进展作一综述。1 以 CCl4 为主诱导的肝硬化模型1936 年 Cameron 等1首次报道应用 CCl4 制作肝硬化动物模型，此后，CCl4 广泛应用于动物实验中。CCl4 是一种化学毒物，它反复作用于肝脏引起急、慢性肝脏损害，对肝脏损害有量效关系。肝脏损害与CC
3、l4 被肝微粒体内依赖于 Cyt.P450 的混合功能酶的激活，产生自由基CCl3 及 Cl-1 有关，这些自由基可与肝细胞内大分子发生共价结合，使肝细胞损伤2,此外，二者均可导致微粒体钙泵活性降低，使胞质 Ca2+升高，细胞内 Ca2+稳态遭到破坏，从而引起细胞代谢紊乱甚至死亡3。坏死物质及其继发的炎性细胞浸润产生肝纤维化刺激因子，后者促进贮脂细胞成纤维细胞增生，产生大量胶原纤维形成肝纤维化4。一般采用 40%50%CCl4 油溶液，经口服、腹腔注射、皮下注射造模，造模时间依给药途经和剂量不同，24 个月不等，一般在 812 周可完全肝硬化，所用动物包括大鼠、小鼠、家兔、犬、猴等。该模型在实
4、验早期即可见明显的肝细胞损伤和炎症反应，在实验第 69 周时即可见明显的纤维组织增生。用 CCl4 攻击建立的肝纤维化模型，具有简便、易行、价廉且耗时短的特点，在形态学、病理生理学的某些方面与人肝硬化相似。Krahenbuhl 等5分别给鼠口服 CCl4 辅以苯巴比妥为唯一饮用水的方法建立肝纤维化动物模型，苯巴比妥的浓度分别采用 0.05 mg/mL 和35 mg/dL，其作用为诱导肝酶的活性，增加肝组织对 CCl4 的敏感性。Krahenbuhl 制备模型时 CCl4 的首次用量为 0.05 mL/kg，以后每周 2 次，每次用量以前次用量引起体重变化减少 6%9%为指标来决定，第 5 周时
5、用量为(22020)L/只，第 10 周为(22040) L/只，其建模时间 10 周时，结果显示肝脏表面可见结节形成，实质变致密，镜检可见在结节周围有少量纤维组织沉积，同时伴有脾大、慢性门脉高压表现。皮下注射吸收过快入全身循环系统，脑肾毒性大，注射位置易发生浸润性脓肿和溃疡，故死亡率可高达 30%40%，降低 CCl4 浓度可降低死亡率，但马学惠6采用 20%的 CCl4 死亡率为 11%。也可以用腹腔注射、灌胃、蒸汽吸入或拌于食物中快速口服的方法。腹腔内注射门静脉浓度高，肝硬化形成时间短，但死亡率较高(20%35%)7;灌胃法 CCl4 亦可直接吸收入肝，但操作复杂，肠道反应大;蒸汽吸入需
6、快速吸入，呼吸道刺激大，动物不耐受，中枢毒性大，易污染环境和伤害实验人员6。溶于少许食物快速口服，少吃多餐，挥发减少，浓度低胃肠刺激减小，但受动物食欲影响，剂量难掌握，实验终点不明确，周期长。添加苯巴比妥可缩短造模时间，810 周可形成肝硬化，但死亡率高达 40%。原理为苯巴比妥诱导肝内混合功能氧化酶，增加细胞色素P450 活性，加速 CCl4 向-CCl3 转化从而增加 CCl4 肝毒性8。添加乙醇能诱导 P450 活性从而增加 CCl4 的肝毒性，在乙醇的致肝脂肪变作用下使用 CCl4 能加速肝细胞坏死，造模时间明显缩短，同时可减小两者剂量以降低药物副反应与动物的不耐受现象。吴孟超9报道在
7、小鼠使用该方法 60d 即可致成肝硬化，肝硬化稳定，分期明显，动物死亡率低。但 CCl4 为主诱导的肝硬化模型缺点是死亡率较高，停止造模给药后，有一定自然恢复趋势的缺点。2 CCl4、乙醇复合高脂肪饮食为主诱导的肝硬化模型此为多因素导致动物肝硬化，是目前较为常用的方法，此可节约时间、成功率高与死亡率低。韩得五10等最早采用复合因素制作大鼠CM。采用高脂低蛋白食物，30%酒精为唯一饮料，皮下注射 CCl4(第 1 次用 5mL/kg，以后每隔 3d 皮下注射 40%CCl4 油剂 3mL/kg)，第 6 周末即可形成肝硬化。该方法简单、成功率高(100%),且死亡率低(20%)。肝硬化形成后饲料
8、中加入 2%的氯化钠可制作肝硬化腹水模型。CCl4 是复合因素中的决定因素，单纯玉米面仅能供给所需蛋白质的一半，并属于低胆碱饮食，饮酒可增加对胆碱的需求量，均可促进肝脂肪变性，使肝细胞对CC4 更敏感，这一模型目前已被广泛采用，具有简便易行、价廉及病变典型等优点。该 CM 分期明确，在第 1、2 周以肝细胞变性坏死为主，第3、4 周以弥漫性纤维增生为其特征，第 5、6 周，纤维间隔、结节与假小叶形成。因其分期明显，该模型有助于研究外在因素对肝硬化进程的干预作用。该方法用于小型动物较多，大型动物的尝试较少，与人肝炎肝硬化仍有差距。本实验室采用四因素法11，即用苯巴比妥钠诱导一周;染毒期用四氯化碳
9、(CCI4)皮下注射 8 周;以食用白酒为唯一饮用水加速成模;饮用水中加入适合动物易饮用的甜味素以减少其死亡率，节约所需动物数量，降低实验成本，适合批量制作。3 二甲基亚硝胺(DMNA)建立肝硬化模型DMNA 是一种具有肝毒性、细胞毒性和免疫毒性药物，其建立模型的给药途径为腹腔注射12-14， George 等15 给鼠腹腔每周注射 DMNA三次，处理 3 周，结果 17d 即可见中心肝小叶坏死及嗜中性细胞浸润，21d 可见胶原纤维沉积、局部脂肪变、胆管增生、中央静脉周围纤维沉积，此模型与人类肝硬化早期改变及胶原纤维沉积相似，可作为筛选抗纤维化药物的方便模型。4 硫代乙酞胺(TAA)建立肝肝硬
10、化模型其原理是 TAA 入肝后延长肝细胞有丝分裂过程，并阻碍 RNA 从胞核到胞质的转移，进而影响依赖酶的代谢过程，最终形成肝细胞坏死，肝实质的破坏引起间质内织缔组织的生成增多，从而引起纤维组织在局部的沉积，其形成的动物模型在血流动力学、形态学及功能上的改变均与人肝硬化相似。SPahr L 等14用 TAA 制备动物模型的方法是将 TAA 用生理盐水配成 30%的溶液，作为动物的饮用水，结果发现 8 周时会产生纤维化，17 周时产生肝硬化，且各个体产生纤维化的程度相当，宜作为影像学的肝纤维化研究。Kuriyama 等16给小鼠腹腔注射硫代乙酞胺制备肝硬化模型，并用于肝细胞癌发病机制的研究.5
11、酒精建立肝硬化模型酒精引起肝纤维化的主要机制是酒精中间代谢产物乙醛对肝脏产生直接损害，其在肝脏使辅酶 I(NAD)转变为还原性辅酶 I(NADH)，从而其比值下降，而 NDA/ NADH 比例下降使三致酸循环受抑制，进而脂肪氧化减弱，肝内脂肪酸合成增多，当其增多超过肝脏的处理能力就形成脂肪肝，最终形成肝纤维化。河福金等17在大鼠常规喂养同时灌入酒精(56C )、橄榄油等的混合液，4 周后可见肝小叶中央区明显坏死或呈局限性坏死、点状坏死，间质可见炎性浸润，电镜下可见肝细胞周围胶原纤维增生，此类模型依其处于不同的时期可作酒精性脂肪肝及肝纤维化的研究。6 血清免疫法建立肝硬化模型用异种血清制品建立肝
12、硬化18-19，其主要原理是异种的血清进入体内引发机体免疫应答反应，在肝脏主要是在门脉汇管区形成免疫复合物沉积，由沉积的免疫复合物引起局部炎性反应，进一步刺激胶原增生而造成肝组织纤维化。王宝恩等18采用三种不同方法通过人血清白蛋白来制备鼠肝纤维化模型，先白蛋白皮下注射，致敏后采用三种方法尾静脉攻击注射白蛋白，第一种方法是 2 次/周，第 1 周 25mg/只，以后每次增加 0.5 mg，直至 4.5 mg，维持此剂量至少 2 个月，结果在 16周时 80%的鼠形成肝纤维化;第二种方法是尾静脉攻击注射 2 次/周，第1、3 次为 8mg，其余为 4mg/次，共 9 次，结果 30d 形成肝纤维化
13、，死亡率 56.4 %;第三种方法是在第二种方法的基础上在注射的前 1 天开始皮下注射前列腺素 E1(PGE1)200ug/次，2 次/日，结果肝纤维化形成与第二组相同，但死亡率却下降至 5%。由上述方法制备的模型可见肝组织界板区肝细胞变形坏死，炎性细胞浸润，汇管区及小叶间纤维组织增生，由于此类模型是一种免疫性损伤，与人类肝纤维化形成较接近，为一种理想的模型，虽然单纯攻击注射白蛋白可造成动物大量死亡，但辅以 PGE1 后是一种较为稳定的制模方法。Santra 等20用血吸虫血清抗原来制备肝纤维化动物模型，在实验的第 0、10、20 天分别注射血吸虫血清抗原，在最后一次注射该抗原后的 72h 可
14、见肝脏中心静脉的变性坏死，门脉区网状蛋白聚集并伸入到肝小叶，最终形成肝纤维化，此种模型可用于血吸虫的药物治疗研究。7 其它建模方法如给猪喂食黄磷21、喂食酒精建立猪的肝纤维化模型22;兔的高胆固醇饮食建立肝纤维化23-24;狗的胆管结扎建立肝纤维化模型25等。总体上肝纤维化模型的要求是模型能与人的肝纤维化有形态学、血液动力学及生化方面相似的特点，同时建立模型时模型的成功比例要尽量高。但到目前为止仍还没有与人肝纤维化完全相似的模型，这可能与人和动物种属间的差异有关，但仍可依据不同的实验目的来选择相应的实验动物模型。【参考文献】1 Cameron CR, Karunaratne WAE. Carb
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