1、环孢素 A 微球抑制兔后囊膜混浊的安全有效剂量【摘要】 目的: 研究环孢素 A 微球(CsA MS) 抑制兔眼晶体后囊膜混浊的安全有效浓度. 方法： 将 16 只兔眼随机分为高、中、低浓度组和空白对照组，高、中、低组含 CsA 浓度分别为：3,2,1 g/L. 均行囊外晶体摘除+人工晶体植入术,术毕实验组囊袋内注入含不同浓度 CsAMS的混悬液 0.1 mL，对照组注入 0.1 mL 混悬液含空白微球(MS)0.2 mg，术后按时检查前房反应并测量眼压和房水 CsA 浓度. 2 mo 后摘取术眼行角膜及后囊膜组织病理学及电镜形态学检查. 结果： 术后第 1 wk 房水中CsA 浓度开始增高，2
2、 wk 时达到高峰，以后缓慢释放，持续作用 1 mo 余；裂隙灯观察实验高、中、低浓度组均可抑制后囊膜混浊，与对照组有统计学差异（P0.05） ；组织病理学和电镜观察，实验组晶体上皮细胞的增殖均不同程度受到抑制，呈浓度依赖型，高浓度组抑制后囊膜混浊作用最强，但对角膜内皮细胞有损害，中浓度组和低浓度组对组织无明显毒性. 结论： CsAMS 浓度 l，2 g/L 在实验期内是抑制兔眼后囊膜混浊的安全有效剂量. 【关键词】 环孢素 A 微球；后囊混浊；兔眼；有效剂量 0 引言 晶状体后囊膜混浊，亦称后发性白内障（posteriar capsule opacification, PCO） ，为白内障摘
3、除术后最常见的并发症，其发病机制主要是术后残留在晶状体前囊膜下和赤道部的晶体上皮细胞的增殖、移行和化生1-2. 环孢素 A（CsA）在眼科近年来发现其除了具有免疫抑制效应外，还具有抗增殖作用，体外实验可有效抑制晶体上皮细胞增殖. 我们利用聚乳糖酸(polymer polylactioglycolic acid,PLGA)为载体,携带 CsA 制成 CsA 缓释微球(CsAMS) ，应用于兔眼晶体摘除术后，观察CsA MS 抑制后囊膜混浊的安全有效剂量，为临床应用提供实验依据. 1 材料和方法 1.1 材料 16 只健康新西兰白兔，体质量 1.52.0 kg，1012 wk，雌雄兼用(西安交通大
4、学医学院实验动物中心提供)；眼科手术显微镜（T4 型苏州六六公司） ，普通光学显微镜（日本日立公司） ；电子显微镜（H600 型日本日立公司） ；裂隙灯（苏州六六公司） ；眼压计（X80型日本 Topcon 公司） ；EP 人工晶体（美国 AMO 公司） ； 30 g/L 羟丙甲基纤维素粘弹剂（天津晶明公司） ；高效液相色谱仪(美国 Waters Alliance公司)； 环孢素 A 微球(CsAMS) 由环孢霉素 A 与乳酸 羟基乙酸共聚物制成(由中国医学科学院生物医学研究所提供). 1.2 方法 1.2.1 环孢素微球(CsAMS) 的制备采用乳化溶剂挥发/萃取法制取. 微球平均粒径为 6
5、3.22 m，跨距为 1.57，载药量为 7.50%，包封率为37.50%. 30 g/L 羟丙甲基纤维素作为混悬介质，制成不同药物浓度的混悬液，实验组每 0.1 mL 混悬介质中的 CsAMS 含药量为:高浓度组 0.3 mg,中浓度组 0.2 mg,低浓度组 0.1 mg,对照组每 0.1 mL 混悬介质含空白微球(MS)0.2 mg. 1.2.2 动物分组及手术实验动物分 4 组，每组 8 只眼，分别为高、中、低浓度组和对照组. 盐酸氯胺酮和盐酸氯丙嗪肌肉注射麻醉，开睑器开睑，3.2 mm 穿刺刀作 1112 点钟透明角膜切口，2 点位作辅助切口，注入透明质酸钠,做连续环行撕囊,囊口 3
6、4 mm 直径大小，水分离，娩出晶体核，吸出囊袋内残余皮质. 注入甲基纤维素，扩大切口，囊袋内植入人工晶体. 将含不同浓度药物及对照物的混悬液 0.1 mL 注入囊袋内,结膜下注射庆大霉素 1 万 U 及地塞米松 2 mg,用 10 g/L 阿托品眼膏涂眼. 所有操作由术者一人完成. 1.2.3 术后检查术后 114 d，1 mo，2 mo 进行眼部裂隙灯检查及眼压测量，后囊膜混浊分级按 Odrich 分级标准3 ，第 1,2,4,8 周麻醉后前房穿刺抽取 0.2 mL 房水，放射免疫法检测房水 CsA 浓度. 1.2.4 组织病理学检查术后 8 wk 空气栓塞处死动物，完整取出晶状体囊袋放入
7、 40 g/L 甲醛溶液中固定，按常规 HE 染色后,于光镜下观察晶状体后囊情况. 1.2.5 电镜检查术后 8 wk 将兔眼晶状体后囊膜及角膜取出后立即放入 4的 25 g/L 戊二醛溶液中固定,按常规方法制作电镜标本,锇酸染色,透射电镜检查. 统计学处理：计量数据以 xs 表示，应用 SPSS13.0 统计软件进行统计学处理，组间比较采用重复测量方差分析，等级资料用非参数秩和检验，以 P0.05 为有统计学意义. 2 结果 2.1 眼的前房反应术后 15 d 各组都有不同程度的结膜充血，角膜水肿，前房出现纤维渗出，710 d 后症状消退，4 组间比较无明显差异，术后各期均未见虹膜新生血管、
8、萎缩或坏死等表现. 2.2 眼压变化术后第 1 日各组眼压与术前及术后第 3，7 日有统计学差异（P0.05） ，组间同期比较无统计学差异. 3 d 以后眼压稳定，同期各组比较亦无差异（P0.05，表 1）. 表 1 各组术后眼压值 2.3 眼房水 CsA 浓度三组术后第 1 周 CsA 浓度均逐渐增高，2 wk 时达到最高峰，以后逐渐下降，8 wk 时近乎检测不出(图 1). 图 1 术后不同时间房水 CsA 浓度 2.4 后囊膜混浊情况术后第 8 周裂隙灯显微镜检查各组后囊膜混浊程度，按 Odrich 分级标准，高浓度组 0 级 7 眼，1 级 1 眼；中浓度组 0 级5 眼，1 级 3
9、眼；低浓度组 0 级 3 眼，1 级 4 眼，2 级 1 眼；对照组 0 级2 眼，1 级 2 眼，2 级 4 眼. 高、中、低浓度组与对照组比较差别有统计学意义（P0.05） ，高浓度组与低浓度组间比较差别亦有统计学意义（P0.05）. 2.5 组织病理学后囊膜经 HE 染色，可见术后 8 wk 高浓度组后囊膜光滑，无上皮细胞增殖（图 2A）. 中浓度组亦无明显增殖（图 2B） ；低浓度组可见上皮细胞轻微增殖（图 2C） ；对照组有不同程度的增生，梭形细胞排列成宽的束状，细胞间可见胶原化，局部形成 Elschnig 小体（图2D）. A：高浓度组； B：中浓度组； C：低浓度组； D：对照组
10、. 图 2 眼后囊膜变化 HE 400 2.6 电镜形态学观察透射电镜观察中、低浓度组角膜内皮细胞形态规则、大小均匀，表面有微绒毛，无明显损害；高浓度组表现为内皮细胞肿胀，细胞与基膜连接疏松，细胞膜结构不完整. 观察晶体后囊膜显示高浓度组上皮细胞体积明显缩小，核内染色质凝集，细胞内空泡增加，线粒体肿胀明显（图 3A） ；中、低浓度组上皮细胞形态不规则，电子密度较高，线粒体轻度肿胀，细胞间连接减少，间隙增宽（图 3B，C） ；对照组晶体上皮细胞排列整齐，核仁，染色质及高尔基体等细胞器未见异常（图 3D）. 3 讨论 PCO 的预防已成为世界范围内的研究课题，药物防治 PCO 应具备：有效抑制晶体
11、上皮细胞的增殖和移行；对眼内其他组织无毒性作用；适合注入前房，有效药物浓度能够维持足够长的时间4. 环孢素 A（CsA）为高效免疫抑制剂. 近年发现 CSA 具有抑制晶状体上皮细胞增生的作用3. 可能机制为抑制细胞因子 IL1 ，IL6 的分泌或阻断细胞因子的作用而抑制晶体上皮细胞增殖5 ，从而预防 PCO. 乳酸 羟基乙酸共聚物（PLGA）微球用于制备生物降解型缓释体系是目前国内外研究的热点. 该微球体系能够控制微球大小、延长药物释放时间等. 通过改变共聚物配比的组成，可调节聚合物在体内生物降解速率6. PLGA 在体内最终被完全降解为 CO2 和 H2O 排出体外，故人体对聚合物耐受性大、
12、生物兼容性好. A：高浓度组； B：中浓度组； C：低浓度组； D：对照组. 图 3 眼后囊膜变化10000 本研究以 PLGA 为载体将 CsA 制成微球注入兔眼晶体囊袋内，观察不同浓度 CsAMS 对晶体上皮细胞的抑制程度及对眼内组织的毒性作用，筛选在眼前节的安全有效浓度. 裂隙灯显微镜、组织病理学观察晶体后囊膜混浊，均显示实验组与对照组有统计学差别（P0.05） ，高、中、低浓度组均可抑制后囊膜混浊的发生. 高浓度组对眼前节结构影响较大，术后前房反应明显比其它组重，持续时间长，电镜显示对角膜内皮亦有损伤，表现为内皮细胞肿胀，细胞与基膜连接疏松，细胞膜结构不完整. 中、低浓度组和对照组电镜
13、显示角膜内皮细胞无明显损害. 眼压测量显示 CsAMS 对眼压无影响. 房水 CsA 浓度测量，第 2 周各组浓度最高，随后几周缓慢释放，呈持续作用，1 mo 后药物浓度几乎消失. 实验结果提示术后炎症反应期内，眼内 CsAMS 持续释放，有效抑制晶体上皮细胞增殖，高浓度损伤角膜内皮，中、低浓度对眼内组织无明显毒性. 但CsAMS 是否能长期抑制晶体上皮细胞增殖仍有待研究. 综上所述，1，2 g/L CsAMS 组在实验期内能预防 PCO 的发生，满足药物防治 PCO 所应具备的条件，为临床应用提供了实验依据，有望成为临床预防 PCO 的一条新的局部用药途径. 【参考文献】 1 Schmidb
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