1、加味四逆散对心理应激损伤大鼠海马 nNOS表达的影响【摘要】 观察调肝治法方药-加味四逆散对慢性心理应激损伤大鼠海马神经元神经型一氧化氮合酶（nNOS）表达的影响。 【方法】取 Wistar大鼠 24 只随机分为 3 组：正常组（不施加任何刺激） 、模型组（给予 21d的随机应激刺激） 、加味四逆散组（每次刺激前 1h 灌胃中药 1 次，剂量为 3.38g/只） 。正常组及模型组每次灌胃等容积生理盐水。采用免疫组织化学方法检测 nNOS 表达。 【结果】3 组大鼠海马的 CA3 区锥体细胞均有nNOS 表达，而模型组表达的强度显著高于正常组，其阳性细胞数及阳性累积分显著性增多（.） ；加味四逆
2、散可显著性降低大鼠海马nNOS 表达，减少其阳性细胞数及阳性累积分（.） 。 【结论】加味四逆散改善慢性心理应激的作用与其能抑制大鼠海马神经元 nNOS 的高表达，从而避免 NO 升高损害细胞有关。 【关键词】 加味四逆散药理学 慢性心理应激中药疗法 脑酶学 疾病模型 动物 大鼠 心理应激是指由于个体在生活适应过程中的对环境要求与自身应付能力不平衡的认识所引起的一种身心紧张状态。心理应激可以通过感知、情感、行为和生理机制影响健康，机体的应激机制与许多疾病的发生、发展和转归有着密切的关系。研究发现，慢性应激作用下，海马神经元会发生萎缩、甚至死亡1 。 一氧化氮（NO）在体内是一种含自由基的气体分
3、子，易扩散，不稳定，过量的 NO 可生成毒性代谢产物而损害神经元2 。本文采用免疫组织化学的方法观察调肝治法方药-加味四逆散对心理应激损伤大鼠海马神经型一氧化氮合酶（nNOS）表达的影响，探讨该方抗慢性心理应激海马 NO 损伤的相关机理。现将结果报道如下。 材料与方法 1.1 动物 SPF 级 Wistar 大鼠 24 只，雄性，体质量 180220g，由南方医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：2002-009。 1.2 药物 加味四逆散组成：柴胡 5g，白芍 15g，枳壳 6g，枸杞子15g，山栀子 5g，干地黄 18g，石决明 30g。药材由广州市药材公司提供，经药剂科鉴定均为纯正药材
4、，常规煎煮取汁后浓缩至含生药 1.69g/mL。药液常温冷却后，置 4冰箱内保存备用。 1.3 主要试剂 即用型 SP 免疫组化试剂盒（ZYMED 公司HISTMOUSETMSP 系列，859643 ，购自晶美生物工程有限公司） ；nNOS一抗、复合消化液（博士德公司，8BA0360） 1.4 仪器 三用电热恒温水浴箱（HHW21600 ，上海） ；电热恒温鼓风干燥箱（DHG9070A 型，深圳） ；光学显微镜及摄像系统（OLYMPUS，1X71，日本） ；超纯水机（NPG1020499，HUMAN CORPORATION，厦门）;制冰机（SANYO，SIM123 ，日本） ；精密轮转切片机（
5、RM2135） 、染色机（ST4040） 、石蜡包埋机（EG1160） 、摊片机（HI1220） 、展片机（HI1210） 、脱水机（TP1020）均由德国 LEICA 公司提供。 1.5 动物分组及给药 大鼠随机分为 3 组：正常组（不施加任何刺激） 、模型组（给予 21d 的随机应激刺激） 、加味四逆散组（每次刺激前1h 灌胃中药 1 次，剂量为 3.38g/只） ，每组各 8 只。正常组及模型组每次灌胃等容积生理盐水。 1.6 慢性心理应激动物模型制备3 电击足底（30V，电流强度1.0mA，每隔 1min 刺激 1 次，每次持续 10s，共 30 次） 、冰水游泳（4，5min） 、夹
6、尾（1min） 、禁水（24h） 、禁食（24h） 、限制（2h） 。以上应激刺激每天 1 种，随机安排在 21d 内，第 22 天取材。 1.7 标本的制备 用 30g/L 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（50mgkg-1） ，开胸经左心室插管至升主动脉，先用生理盐水 200mL 灌注，再用250mL 含 40g/L 多聚甲醛的 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.27.6）灌注，取脑，置于含 40g/L 多聚甲醛的 0.01mol/L PBS 中放置 46h，常规石蜡包埋，切片，片厚 4m。 1.8 检测方法 采用免疫组织化学法检测大鼠海马 nNOS：（1）切片脱蜡、水化，PBS
7、洗 2min3 次；（2）蒸馏水新鲜配置体积分数为3%H2O2，室温放置 510min 以灭活内源性酶，蒸馏水洗 5min3 次；（3）滴加复合消化液，37作用 510min，蒸馏水洗 5min3 次；（4）滴加体积分数 5%血清封闭液，室温 20min，甩去多余液体，不洗；（5）滴加一抗（1：200）4过夜，PBS 洗涤 2min3 次；（6）滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG，37作用 20min，PBS 洗涤 2min3 次；（7）滴加试剂链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC） ，37作用20min，PBS 洗涤 5min4 次；（8）联苯二胺（DAB）显色：使用 DAB 显色试剂
8、盒。取 1mL 蒸馏水，加试剂盒中 A、B、C 试剂各 1 滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下观察控制反应时间 530min，自来水洗涤，蒸馏水洗涤；（9）苏木素轻度复染，脱水，透明；（10）封片胶（中性树脂）封片，干燥后显微镜下观察结果。 试验中设立严格的阴性对照（以 PBS 缓冲液代替一抗） 。每只大鼠选取 2 张切片，每张切片选取 1 个固定的高倍视野（4010 倍） ，以两种方法处理结果4：（1）记数阳性细胞和神经细胞的总数，计算阳性细胞所占的百分率；（2）采用半定量方法，分别按阳性细胞的分布和染色深度记分，计数阳性累积分。阳性细胞的分布记分标准：分：无着色细胞；分：阳性细胞数少于整个
9、组织细胞数的；分：阳性细胞数介于整个组织细胞数的2/3；3 分：超过整个组织细胞数的。染色深度记分标准：分：不着色；分：介于分和分之间（棕色） ；分：深染（褐色） 。以者相加分数作为阳性累积分，计算出平均值。 1.9 统计学方法 采用 SPSS 11.0 统计软件包进行方差分析。 2 结果 各组大鼠海马 nNOS 的表达见表 1 和图 1。结果可以看出，nNOS 散在分布于正常组大鼠海马的各个区域，胞体主要呈圆形或椭圆形、梭形等多种形态，但阳性细胞数不多。与正常组相比，模型组海马内 nNOS 表达强度显著高于正常组，阳性细胞数及阳性累积分显著增多（.） 。加味四逆散组与正常组比较无显著性差异（
10、.）;与模型组比较，海马内 nNOS 表达显著性降低，阳性细胞数及阳性累积分显著性减少（均.） 。表 1 各组大鼠海马nNOS 的表达结果 3 讨论 NO 具有双重作用。生理范围的 NO 对机体有益，可参与中枢神经系统的信息传递；当机体内合成过量的 NO 会引起神经毒性作用2 。 在 NO 的生物合成中，NOS 起着关键性作用。它是一种同源二聚体，由两个单体在细胞色素和细胞色素还原酶的作用下聚合而成。NOS 是一组同工酶，根据酶的来源、对 Ca2/CaM 依赖性的不同，以及是否受内毒素、细胞因子诱导等特点，一般将 NOS 分成神经型 NOS（neuronal NOS，nNOS）或型 NOS、巨
11、噬细胞型 NOS（isoforms NOS，iNOS，又称免疫型）或型 NOS、内皮型 NOS（endothelial NOS，eNOS）或型NOS。nNOS 和 eNOS 为 Ca2/CaM 依赖型，二者又合称原生型NOS（constitutive NOS，cNOS） 。nNOS 主要分布于神经元，在一些非神经组织中也有表达，与突触可塑性、神经再生、神经传导及神经元的发育、神经内分泌的调节等多种中枢神经系统生理功能相关5 。 对慢性心理应激损伤引起的 NO 含量升高的机制尚未完全清楚。兴奋性氨基酸谷氨酸（Glu）可能在 NO 含量升高中起重要作用。慢性应激时下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴活
12、动亢进、血浆糖皮质激素（GC）浓度升高，高浓度的 GC 可引起 Glu 过多释放，造成细胞外 Glu 堆积6-10 。Glu 与突触后膜 N 甲基D 天（门）冬氨酸（NMDA）受体结合，引起神经元持续去极化，导致离子渗透压力和电化学改变，Ca2+通过电压依赖性钙通道或 NMDA 受体联结的通道内流，使细胞内 Ca2+增加；Ca2+与CaM 偶联并结合于胞浆中 NOS 相应的位点上激活 NOS；后者催化 NO 的生成11 。升高的 NO 一方面直接通过其代谢产物过氧亚硝酸盐阴离子（ONOO）抑制 Glu 的摄取12-13 ，加重细胞外 Glu 堆积；另一方面又作为逆行信使再扩散到突触前膜，与细胞
13、内可溶性鸟苷酸环化酶活性中心的 Fe2+结合，改变酶的立体构型，导致酶的活性中心增强和环磷酸鸟苷（cGMP）合成增多，通过 cGMP 进一步促进 Glu 的释放，最终也导致Glu 水平显著升高14 。慢性应激可能通过 NO 与 Glu 这种互为因果的关系，形成一个 Leza 等15提出的 GluNOGlu 正反馈环路，不断放大毒性分子的效应16 。 我们的观察结果表明，3 组大鼠海马的 CA3 区锥体细胞均有 nNOS 表达，而模型组表达的强度显著高于正常组和加味四逆散组。正常组有nNOS 表达，表明生理状态下海马 CA3 区锥体细胞也有 nNOS 的表达，很可能正是由于这种表达保证了低浓度
14、NO 的存在，以维持神经元的兴奋性和促进突触传递的长时程增强（LTP）的形成15-16 。模型组 nNOS 表达增强可能是慢性应激引起 NO 生成过多的原因之一。加味四逆散组 nNOS 表达与模型组比较显著性降低，表明调肝治法方药可以抑制慢性应激引起的 nNOS 表达，从而避免 NO 升高损害锥体细胞。与 Gould 等17认为海马各亚区锥体细胞均有 nNOS 表达，但 CA3 区和门区中间神经元 nNOS mRNA 表达的变化与慢性应激引起海马 CA3 区神经元的损伤有关的结论相符。其确切机制有待进一步研究。 【参考文献】 1 McEwen B S.Stress and hippocampa
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