1、金属硫蛋白 MT2a 与 Cd 和 Cu 络合的电喷雾质谱表征作者：沈金灿 叶卫翔 康海宁 葛丽雅 庄峙厦 王小如 【摘要】 采用电喷雾质谱法（ESIMS ）研究金属硫蛋白（MT，存在 和 两种结构域）2a 与金属离子 Cd 和 Cu 的络合作用。MT2a由反相色谱分离纯化制得，并以电喷雾质谱鉴别。通过 ESIMS 考察MT2a 与不同量的 Cd 和 Cu 的络合，结果表明，Cd 能够优先与 MT 的 结构域络合，形成 M2+4S11 结构，并且该络合过程存在着明显的协同效应；Cd 与 MT 的 结构域的络合形式为 M2+4S9，其呈现出明显的随机松散络合特性；Cu 优先与 MT 的 结构域络
2、合，其络合形式由 Cu4逐渐过渡到更高结合态；在 Cu 含量较高的条件下，Cu 与 MT 呈现出多种络合方式。 【关键词】 电喷雾质谱, 金属硫蛋白, 镉离子, 铜离子, 络合作用Abstract Mammal metallothionein(MT) folds into two separate domains that exhibit different structure and metal binding propertity independently, the study of the strategy of metal ions binding with MT would giv
3、e better understanding of their exact biological functional mechanisms. In this study, a method using eletrospray ionization mass spectrometry (ESIMS) had been developed and employed to study the stoichiometries of Cd and Cu binding with MT2a. MT2a was purified from MT mixture by reversed phase liqu
4、id chromatography and identified by ESIMS. Different amounts of Cd or Cu were then added in MT2a samples and ESIMS was employed to determine the mass difference of MT in different samples. The results showed that Cd prefer to cooperatively bind in domain with the form of Cd2+4S11; while Cd is attach
5、ed in separate binding sites for the formation of Cd2+3S9 cluster, which intermediately formed with five and six Cd ions were detected. For the Cuprous ions, it prefers to cooperatively bind in domain with the form of Cu4MT. The binding form in domain would convert from Cu4 into more Cu binding form
6、 with the addition of Cu. When high concentration of Cu was added in samples, the result suggested that MT can bind with Cu in multiple stoichiometries.Keywords Electrospray ionization mass spectrometry, metallothionein, cadmium, copper, complexation1 引 言金属硫蛋白（metallothionein, MT）的分子量约为 67 kDa，富含巯基（
7、SH）基团（每 MT 分子中的半胱氨酸约占其氨基酸总量的 30%） ，不含芳香氨基酸。它是能络合大量金属离子的热稳定蛋白质，具有广泛的生理功能，如参与微量元素的储存、运输和代谢，对重金属离子的解毒，清除体内自由基等1,2。自 1957 年 MT 被发现以来，其结构一直是科学家关注的热点。MT 具有很强的金属络合能力,哺乳动物每分子 MT 可络合 7 个二价金属离子或 12 个一价金属离子，其中 Cd7MT 和Cd5Zn2MT 的三维结构已分别用 NMR3和 X 射线衍射法4测定。文献36报道, 在 MT 中二价金属离子全部与硫原子呈四面体配位,并通过桥联的硫原子形成 M2+4S11 和 M2+
8、3S9 两个金属 硫醇簇,相应组成 和 两个结构域; 而哺乳类动物 MT 与 Cu+络合的方式是多样化的。在体内，MT 与 Cu+的最大络合数是 12；而在体外，MT 能络合更多的 Cu+。在 MT 与金属的结构研究中，常采用的表征方法有紫外光谱、圆二色谱和 NMR 等光谱技术79。然而，采用光谱技术只能提供 MT 中形成的金属团簇与巯基的络合性质信息，而不能提供络合量的信息。电喷雾质谱法（ESIMS ）是一种新的软电离质谱技术，在生命科学领域中得到了广泛应用1014。由于 ESIMS 能够提供分子量信息，故通过ESIMS 检测得到的分子量变化信息可以推断 MT 与金属的络合信息及其络合的金属
9、的数量的变化13,14。Cd 是常见的重金属元素，而 Cu 是动物体内必需的微量元素，这两种金属均能诱导动物体内产生 MT，通过 MT 捕获并贮存进人体内的 Cd和 Cu, 以缓解这些金属元素对细胞和组织的毒害作用1。本研究以ESIMS 技术研究 Cd 和 Cu 与 MT2a 的络合作用，所得结果有助于进一步理解 MT 的的解毒机理及其与微量元素间的作用。2 实验部分2.1 仪器与试剂1100 型四极杆质谱仪（美国 Agilent 公司） ，蛋白分子量的计算及质谱的解析采用 Agilent Chemistation 软件。三羟甲基氨基甲烷（Tris） 、醋酸铵、乙酸，均为优级纯（Alfa Ae
10、sar, USA） ；Cd （国家标准物质研究中心） ；Cu(CH3CN)4PF6（Aldrich 公司） 。实验用水由 Nanopure Diamond (Barnstead, USA)超纯水装置制备。所用流动相和溶剂都经氩气脱气除氧，避免 MT 被氧化。2.2 样品制备0.01 mol/L Cd 溶液；Cu 溶解在 30（V/V）乙腈溶液中，其浓度为 0.01 mol/L。储备液存放于 4 冰箱，工作液按需要以缓冲液适当稀释。所用 Zn 诱导兔肝金属硫蛋白（湖南麓谷生物有限公司） ，该样品为经排阻色谱分离所得到混合 MT。由于混合 MT 含有多种 MT 的亚型异构体，采用混合 MT 进行实
11、验将使所得质谱结果的谱峰难以确认和归属，因此先将混合 MT 通过反相色谱柱进行分离，收集 19 min 洗脱组分。所用色谱柱为 Zorbax 300 SB C18 柱（150 mm2.1 mm, 5 m，30 nm）（Agilent，USA） ，色谱条件为：流速 0.25 mL/min，流动相 A 为 10 mmol/L Tris 缓冲液（pH 7.4） ，流动相 B 为乙腈。混合 MT 采用 050 min 内由 5% B 上升到 10% B 的梯度洗脱程序进行分离。将收集到的洗脱液冷冻干燥后，加少量水溶解，样品转移到截流分子量为 3 kDa 的超滤离心管中（Millipore，USA） ，
12、超滤离心脱盐。脱盐后的样品作为储备液于4中保存。目前用于 MT 浓度测定的方法有电感耦合等离子体法和Ellman 法等15,16，以 Ellman 法测定储备液中 MT 的浓度为 2.5 g/L。实验所用 MT2a 浓度为 0.20 g/L。2.3 色谱质谱条件采用流动注射进样，进行阀为 7725i 型带有 5 L 采样环的六通阀（rheodyne, CA, USA） ，流动相为 50%(V/V）乙腈溶液，流速为 0.1 mL/min，实验前质谱进行调谐以使仪器达到最优状态，连续进样 3 次达到稳定后才开始质谱实验。扫描范围为 8002000 Da，扫描步长 0.15 amu，毛细管电压 4
13、kV，碰撞电压为 100 V，干燥气体温度为 300 。 3 结果与讨论3.1 MT2a 的质谱鉴别MT2a 经反相液相色谱分离制得，采用电喷雾质谱对 MT2a 样品进行鉴别。在 0.1%甲酸溶液中，络合在蛋白上的主要金属（Zn）将被脱去，从而检测得到脱金属硫蛋白的分子量。图 1 为经色谱纯化得到的MT2a 样品的质谱图，由图 1 可见，脱金属 MT 以 4+、5+、6+和 7+的电荷状态存在，并且强度逐渐递增。通过质谱软件解析得分子量为 6125，与 MT2a 的理论分子量（6125）一致。3.2 Cd 与 apoMT 的络合哺乳动物 MT 分子存在 和 两种结构域，这两个结构域与金属络合的
14、能力不同， 结构域中的 9 个半胱氨酸与二价金属形成 M2+3S9 团簇，而 结构域中的 11 个氨基酸与二价金属以 M2+4S11 形式络合，在这两个结构域中二价金属离子以四面体形式与巯基进行配位。为了研究金属离子与脱金属 MT 的络合形式，在酸性条件下（1%甲酸）将制备得到的 Zn7MT2a ，进行脱金属，并经凝胶色谱纯化得到apoMT2a 。所用 0.20 g/L MT2a 在 10 mmol/L 醋酸铵溶液（pH 6.0）中进行反应。Cd 与 apoMT2a 的络合如图 2 所示。由图 2 可见，随着 Cd 量的增多，Cd 与 MT 的络合数量逐渐发生变化。当样品中加入 2 或 4 倍
15、 MT 量的 Cd 时，ESIMS 质谱图上出现了Cd4MT 络合信号，并且随着 Cd 的增多，Cd4MT 的信号逐渐增强，而apoMT 的信号逐渐减弱。Stillman 等17的研究表明，Cd 可以优先与 结构域中的 11 个氨基酸络合形成 M2+4S11，所得质谱结果亦印证了本结果。当加入 Cd 的量小于 MT 量的 4 倍时，并未检测到 Cd13MT的络合物，Cd 与 MT 的唯一络合方式是 Cd4，即 Cd 与 MT 的络合表现为“全有”或“全无”的络合形式，Cd 在该结构域络合呈现明显的协同效应18,19。当加入 Cd 的量超过 MT 量（ 结构所能络合的 Cd 的数量）的 4 倍时
16、，过量的 Cd 将与 结构域上的巯基络合；当加入Cd 的量为 MT 量的 5.5 倍时，质谱上出现了 Cd5 和 Cd6 与 MT 的络合信号；继续加入 Cd ，质谱上出现了 Cd6 和 Cd7 与 MT 的络合信号；当加入Cd 的量超过 MT 量的 7 倍时，质谱上只出现络合 7 个 Cd 的 MT 的信号。与 Cd 在 结构域的络合不同，Cd 在 结构域的络合相对松散，单个 Cd 的络合并没有促进后续 Cd 与巯基的络合，即 Cd 与 结构域的络合不具有协同效应。综上可知，Cd 与 MT 的 、 结构的络合能力不同，优先与 结构域络合，其络合形式为 Cd4MT ，并且呈现协同效应；而在 结
17、构域，Cd 的络合能力较弱，并且其络合呈现出较为松散和无规则的状态。、 结构域与金属的络合能力的差异与其具有不同的生物功能有关，由于 结构域与重金属具有较强的络合作用，故其在重金属（如 Cd 和Hg）的解毒方面具有重要作用，而 结构域在金属交换过程中起了重要作用20。3.3 Cu 与 apoMT 的络合文献21指出，每个 MT 能络合 715 个或更多的 Cu ；而在体外研究中，Nielson18和 Winge22通过酶解研究发现，哺乳类动物 1 分子 MT 可以络合 12 个 Cu ，MT 的 、 结构域均可以络合 6 个Cu 。Cu 与两个结构域的络合能力相同， 结构域的络合能力优于 结构
18、域。Cu 与 MT 间具有较强的络合力，即使在 pH 1.5 下也能与 MT 络合23，酸性条件不仅有利于 MT 的 ESIMS 检测，还能使 apoMT 稳定存在，故 Cu 与 apoMT 的络合实验在 0.2%甲酸溶液（pH 2.5）中进行。由图 3 可见，在 apoMT 中加入 2 倍于 MT 量的 Cu 时，质谱图上出现了 Cu4MT 的信号；当加入 Cu 的量达到 MT 量的 4 倍时，Cu 与MT 的络合表现为 Cu4MT 、Cu5MT 、Cu6MT 、Cu7MT 和 Cu8MT ，其中丰度最大的质谱离子对应于 Cu4MT ；当加入 Cu 的量为 MT 量的 6 倍时，质谱上同时出
19、现 Cu4MT 、Cu5MT 、Cu6MT 、Cu7MT 和 Cu8MT的质谱信号，Cu5MT 、Cu6MT 、Cu7MT 和 Cu8MT 的信号逐渐增强，其中以 Cu8MT 的信号增强最为明显；当 Cu 的量 10 倍于 MT 的量时，Cu4MT 、Cu5MT 、Cu6MT 和 Cu7MT 的信号消失，检测到的质谱信号对应于 Cu8MT 、Cu9MT 、Cu10MT 、Cu11MT 和 Cu12MT ，其中Cu8MT 的信号强度最高；继续加入 Cu ，检测到的 Cu 络合 MT 离子的信噪比较低，使得对 Cu 络合 MT 的质谱解析十分困难。因此，本实验只考察了 10 倍于 MT 量范围内
20、Cu 与 MT2a 的络合。由以上结果可知，当 apoMT 中加入极少量 Cu 时，Cu 与 MT 的络合形式为 Cu4MT ，此结果与文献24一致。Cu4MT 的络合形式被认为是 Cu 与 MT 的 结构域上的 9 个半胱氨酸以四面体形式络合而产生的，并且该络合过程存在着协同效应，因而，即使只加入少量 Cu 也会形成(Cu4)MT 。样品中加入 4 倍于 MT 量的 Cu 后，出现 Cu48 系列结构，表明该条件下 Cu 与 MT 存在着多种络合形式。由于(Cu4)MT较稳定，因而再加入的 Cu 主要参与了 结构域的络合，从而形成(Cu4)(Cu14) 结构。这也表明 Cu 在 结构域的结合
21、较为松散且无规则，具有一定的动力学特性。当加入的 Cu 为 MT 量的 6 倍时，质谱上没有产生新的结合信号，Cu 与 结构域的络合量不断增加，其中以Cu8MT 的增加最为显著。Cu8MT 的快速增加表明，Cu 在 络合域的络合更倾向于生成 Cu4 结构，从而形成(Cu4)(Cu4) 结构。继续加入 Cu ，生成 Cu914，表明 Cu4 结构被破坏进而转变成更高结合态的结构。此结果也表明 Cu 与 MT 存在多种络合方式。4 结 论哺乳动物 MT 分子中包含 和 两种结构域，两者相互独立，结构不同，能独立的行使功能。本实验采用电喷雾质谱考察了金属离子Cd 和 Cu 与 MT 的络合方式。研究
22、发现，Cd 能够优先与 MT 的 结构域络合，形成 M2+4S11 结构，络合过程存在着明显的协同效应；Cd 与 结构域的络合形式为 M2+3S9，对 Cd 与 apoMT 的络合研究表明，Cd 与 MT 的 结构域的络合呈现出明显的随机松散络合特性。Cu 与MT 的络合实验表明，Cu 优先与 MT 的 结构域络合，其络合形式由Cu4 逐渐过渡到更高结合态，在 Cu 含量较高的条件下，Cu 与 MT 的络合呈现出多种络合方式。本研究还表明，选择合适的条件，ESIMS 能够用于金属与蛋白络合的快速表征。【参考文献】1 Klaassen C D, Liu J, Choudhuri S. Annu.
23、 Rev. Pharmacol. Toxicol., 1999, 39: 267294 Iszard M B, Liu J, Klaassen C D. Toxicology, 1995, 104(13): 2533 Arseniev A, Schultze P, Wrgtter E, Braun W, Wagner G, Vask M, Kgi J H, W thrich K. J. Mol. Biol., 1988, 201(3): 637657 Robbins H, McRee D, Williamson M, Collett S A, Xuong N H, Furey W F, Wan
24、g B C, Stout C D. J. Mol. Biol., 1991, 221(4): 12691293 Chen P, Munoz A, Nettesheim D, Nettesheim D, Shaw C F 3rd, Petering D H. Biochem. J., 1996, 317(Pt 2): 395402 Li H, Otvos J D. Biochemistry, 1996, 35(44): 1392913936 Nielsen K B, Winge D R. J. Biol. Chem., 1983, 258(21): 1306313069 Bernhard W,
25、Vask M, Kgi J H R. Biochemistry, 1986, 25(8): 19751980 Willner H, Vasak M, K gi J H R. Biochemistry, 1987, 26(19): 62876292 Loo J A. Mass Spectrom. Rev., 1997, 16(1): 123 Smith R D, Loo J A, Rachel R O L, Mark B, Harold R. Mass Spectrom. Rev., 1991, 10(5): 359451 Zhao YuFeng( 赵宇峰), Song FengRui (宋凤瑞
26、), Yue Hao(越 晧), Guo XinHua （国新华）, Li HuiLin( 李惠琳), Liu ZhiQiang (刘志强), Liu ShuYing （刘淑莹）. Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2007, 35(12): 17111715 Yu X, Wojciechowski M, Fenselau C. Anal. Chem., 1993, 65(10): 13551361 Gehrig P M, You C, Gruber C, Brouwer M, Kgi J H R, Hunziker P E. Protein Sci., 2000, 9(2): 395402 Wang Meng(王 萌), Feng WeiYue (丰伟悦), Lu WenWei( 陆文伟), Li Bai（李 柏）, Wang Bing(汪 冰), Zhu MoTao (朱墨桃), Wang Yun（王 云）, Zhao YuLiang (赵宇亮) , Chai ZhiFang (柴之芳). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2008, 36(3): 321324
