1、逆转录病毒载体介导 HSV1作者：杜标炎， 谭宇蕙， 吴映雅， 赵鹏， 周联， 赵亚刚 【关键词】 自杀基因 摘要：【目的】探讨自杀基因抗肿瘤系统构建的方法。 【方法】用DNA 重组技术将单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV1tk）定向克隆入逆转录病毒载体 pLXSN，并用限制性内切酶进行酶切及测序鉴定；用 PolyFect Transfection 试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系 PT67，通过G418 筛选建立稳定产病毒的细胞株，将病毒感染人胃癌细胞，检测HSV1tk 自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应。 【结果】经酶切鉴定和DNA 序列测定，证明 HSV1tk 基因成功定向插入到 pLX
2、SN 载体中；重组病毒 DNA 转染包装细胞，筛选出对 G418 具稳定抗性的克隆 PT67tk，扩大培养，获取病毒滴度为 4?cfu/mL 的重组逆转录病毒培养液；感染胃癌细胞 SGC7901 后再筛选出 G418 抗性克隆株 SGC7901tk。丙氧鸟苷（GCV）对 SGC7901/tk 有明显杀伤作用，对 SGC7901 无明显毒性，证明该病毒表达 HSV1tk 基因，表达产物具有生物活性。 【结论】将 HSV1tk定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取表达 HSV1tk 基因的逆转录病毒，成功建立了肿瘤自杀基因治疗系统，这将为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础。 关键
3、词：自杀基因； DNA，重组； 基因，肿瘤抑制； 基因疗法 肿瘤的基因治疗，特别是自杀基因治疗，已经成为继传统手术切除、放射治疗、化学药物治疗等疗法之后一种新的抗肿瘤治疗措施。目前应用的肿瘤自杀基因治疗系统主要有单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk） 、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶（tk） 、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（） ；P53 等。单纯疱疹病毒胸苷激酶丙氧鸟苷（tk）治疗系统为最常用、最重要的治疗系统之一。 HSVtk 基因在肿瘤细胞内表达胸苷激酶，可催化核苷类似物，如丙氧鸟苷（GCV）等，形成单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶作用下形成三磷酸产物，干扰细胞分裂时 DNA 合成，从而导致肿瘤细胞死亡 。 但由
4、于在体内不可能每一肿瘤细胞都导入自杀基因，故旁观者效应（bystander effect）对基因治疗效果起到至关重要的作用。 旁观者效应不仅可使导入自杀基因的细胞杀死，还使邻近未导入的细胞也被杀死34 。 研究表明，旁观者效应与机体的免疫状态密切相关56 ；许多中医方药能有效提高机体的免疫功能79 ，这就有可能通过调节自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境，使荷瘤机体从免疫抑制转化为免疫激活，从而增强自杀基因的旁观者效应，起到协同抗肿瘤作用。这一研究工作必须在自杀基因治疗系统建立后才可进行。故本工作仅探讨了以逆转录病毒载体介导自杀基因抗肿瘤系统建立的方法。 1 材料与方法 11 细胞与质粒 pIC
5、19R/MC1tk 质粒（克隆了 HSV1tk 的载体质粒）由美国匹兹堡大学药理教研室 Huang L教授惠赠，广州军区总医院赵亚刚博士提供；pLXSN 逆转录病毒表达载体、病毒包装细胞 PT67 均购自美国 Clontech 公司；人胃癌细胞 SGC7901 和小鼠 NIH3T3 细胞均购自中山医科大学细胞库；Ecoli DH5 菌株由本校生化教研室保存。 12 试剂 高纯度质粒提取试剂盒和 DNA 片段凝胶回收试剂盒均购自上海sangon 生物工程技术有限服务公司；DNA 片段连接试剂盒，购自广州宝泰克生物科技有限公司；转染试剂盒 Polyfect Transfection 为 QIAGE
6、N公司产品；多聚阳离子（Polybrene） 、G418、GCV 均为 Sigma 公司产品；DMEM、胎牛血清和 RPMI1640 均为 Gibco 公司产品；新生牛血清为杭州四季青公司产品。 13 质粒的抽提、酶切、DNA 片段的连接、转化 按 Sambrook 法或试剂盒产品说明书的方法进行，提取的质粒 DNA 浓度与纯度用 RNADNA Caculator 测定。 14 重组质粒的构建 pIC19R/MCItk 质粒和逆转录病毒表达载体pLXSN 质粒均转化 DH5 后扩增、抽提纯化，均用限制性内切酶 EcoR I/Bam H I 酶切，凝胶电泳证实 pIC19R/MCItk 质粒有
7、17kb HSV1tk cDNA目的片段，回收、纯化此 tk 基因片段及 pLXSN 载体双酶切后的大片段，在适当的反应体系中用 DNA 片段连接试剂盒将 tk 基因定向克隆入逆转录病毒表达载体 pLXSN 中，构建成重组的 pLXSNtk 质粒。 15 限制性内切酶鉴定和序列鉴定 重组质粒经转化、扩增、提纯后，采用 EcoR I、BamH I 单酶切和 EcoR IBamH I 双酶切，酶切后采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，图象分析仪拍照、分析。然后分别在 pLXSN 载体上单克隆位点中的 EcoR I、BamH I 酶切位点上下游附近各选 23 个碱基的片段为测序引物，将新构建 pLXSNtk 质
8、粒进行测序。 16 细胞培养 包装细胞 PT67、小鼠 NIH3T3 细胞分别培养于含体积分数为 10%的新生牛血清的 DMEM 高糖培养液和 RPMI1640 培养液中，置于 37、体积分数为 5%的的培养箱内，25g/L 胰酶 EDTA 消化传代。将细胞置于梯度浓度的 G418 中，观察细胞对 G418 敏感性，确定 G418 筛选浓度：PT67细胞为 400mg/L，NIH3T3 细胞为 300mg/L。 17 PT67 的转染及阳性克隆细胞的筛选 取 4孔 PT67 接种于 35mm 的 6 孔培养板，待次日融合率达 80%左右时，将 25g 的重组质粒 DNA 用不含血清的培养液稀释
9、至体积为 150L，再加入 15L 的PolyFect Transfection 试剂混匀，室温放置 10min 后，再加入 1?mL 的完全培养液，混匀后，立即把转染混合物转移到 PT67 细胞的培养板中，培养 2d 后，用 G418（400mg/L）筛选 2 周，获得抗性细胞集落后，再用25g/L 胰酶消化，以 1继续传代，在含 500?mg/L 以上 G418 的选择性培养液中分别扩大培养，选择最高抗性克隆留种，命名为 PT67tk 细胞。 18 NIH3T3 的感染及病毒滴度的测定 收集 PT67tk 细胞上清液，以 045?m 的过滤器过滤，进行10、10、倍系列稀释，加入对数生长期
10、 NIH3T3 细胞，随后加 Polybrene 至终浓度为 8?mg/L，2?d 后更换含300?mgL G418 的选择培养液，连续筛选 2 周后，观察各稀释度中抗性细胞（NIH3T3/tk）克隆数（m） ，按“滴度（cfu/mL)=m稀释度”测定病毒滴度(其中 cfu 为 colony forming units)。 19 人胃癌细胞的感染及 GCV 对其体外杀伤效应的测定 同上方法感染人胃癌细胞 SGC7901，感染后癌细胞用 G418 筛选 2 周，获得抗性细胞克隆，命名为 SGC7901tk，将它与 SGC7901 分别等量接种于 24 孔板，各 12 孔，各选 6 孔分别加入 1
11、00mg/L 的 GCV，余下各 6 孔为不加药对照组，3?d 内用台盼蓝染色活细胞计数法计算SGCtk、SGCtk、SGC、SGC共 4 组活细胞数目，记为 n、n、n、n，按nn（nn）100计算生存率 pr、pr。 2 结果 21 重组质粒的构建和鉴定 质粒构建过程见示意图 1。提纯所得质粒 DNA 的光密度D（260?nm/280?nm）比值为 1722。 EcoR I/BamH I 双酶切后的 pIC19R/MC1tk 质粒，经琼脂糖凝胶电泳显示有 17kb 的 DNA 片段（图 2a） ，与背景资料（图 1a）相符；逆转录病毒载体 pLXSN 质粒经 EcoR I、BamH I 单
12、酶切后显示为 59kb 的 DNA 带，新构建的 pLXSNtk 质粒经 EcoR I/BamH I 双酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示 2 条 DNA 带，分别为 17?kb 和 59kb 左右（图 2b） 。新构建的 pLXSNtk质粒结构见图 1b，分析测序结果，碱基序列与文献报道一致，证明 HSVtk 基因已被定向克隆入 pLXSN 载体中。 22 pLXSNtk 转染包装细胞 PT67 的结果 转染后，用 400?mg/L 的 G418 筛选 2?d 后，细胞开始死亡，在 4?d内死亡达到高峰，5?d 后有少数细胞贴壁生长，再过 1 周，这些细胞逐渐形成阳性克隆细胞团（图 3） ，用最终高
13、达 1?g/L 的 G418 筛选到的PT67tk 扩大培养后，收集病毒液，感染 NIH3T3 测定病毒滴度，经测定滴度为 4cfu/mL。 23 GCV 对人胃癌细胞 SGC7901 的体外杀伤试验 台盼蓝活细胞计数结果显示：tk 与两组细胞数 n与n比较，nn，即重组 pLXSNtk 病毒的感染对的生长无明显影响；（100?mg/L）对tk 有明显的杀伤作用，且呈时间依赖性的特点，而对亲本细胞（）无明显的杀伤作用（图 4） ，两组细胞数目nn比较：1?d 后，2?d 后，从而验证了 tk 基因在胃癌细胞中的表达，而且表达产物具有活性。 apIC19R/MC1tk 质粒结构? bpLXSNt
14、k 质粒结构 图 1 质粒构建示意图（略） Figure 1 Illustration of plasmid construction apIC19R/MC1tk 质粒 1marker（ DNA HindIII） ； 2pIC19R/MC1tk 质粒； 3pIC19R/MC1tk 质粒BamH I； 4pIC19R/MC1tk 质粒BamH IEcoR I； 5marker（ DNAEcoR IHindIII） bpLXSNtk 质粒 1pLXSN 质粒EcoR I； 2marker（ DNA HindIII） ； 3pLXSNtk 质粒EcoR I； 4pLXSNtk 质粒BamH IEco
15、R I； 5marker（ DNAEcoR IHindIII） 图 2 质粒限制性内切酶酶切鉴定电泳图谱（略） Figure 2 Electrophoregram of the plasmid after restriction endonuclease cutting aG418 筛选 5?d 后的 PT67 b筛选 2 周后形成的阳性克隆细胞团 图 3 pLXSNtk 质粒转染包装细胞 PT67 结果（略） Figure?3?Results?of?transfection?of?PT67?with?pLXSNtk?plasmid 图 4 GCV 作用 3?d 内细胞存活率（略） Figur
16、e 4 Survival rate of SGC7901 and SGC7901/tk after 3day treatment with GCV 3 讨论 本研究将tk 基因定向克隆入逆转录病毒载体 pLXSN 中，并进行病毒包装，筛选出稳定生产带有该重组逆转录病毒的细胞株PT67tk。将逆转录病毒感染肿瘤细胞，检测tk 自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应，经 GCV 对人胃癌细胞 SGC的体外杀伤试验，结果表明tk 基因已在胃癌细胞中表达，而且能有效地把转变成细胞毒性产物，导致感染细胞死亡，而 GCV 对未感染重组逆转录病毒的对照组癌细胞无明显毒性，说明表达产物具有生物活性。 即自杀基因治
17、疗系统已成功建立。但对于自杀基因治疗来说，这只是第一步。体内基因转染效率低，是目前限制基因治疗在临床应用的重要原因。为了提高体内基因转染效率，目前医学界一方面正在寻找更有效的病毒载体和采用介入法把重组病毒直接输入实体癌灶等方法；另一方面，提高旁观者效应成为研究热点之一。根据旁观者效应产生的机制，目前认为提高旁观者效应可通过下列途径：增加细胞间的“缝隙连接” ，使 GCV 的代谢产物从 tk细胞进入 tk细胞增多；延长凋亡细胞存在时间，增强机体抗肿瘤免疫反应；改善自杀基因抗肿瘤作用的整体免疫状态和局部炎症免疫微环境 。 其中，改善自杀基因肿瘤作用的炎症免疫微环境是提高自杀基因疗法疗效的重要策略。
18、黄欣、Jones R K 等的研究结果表明联合细胞因子或细胞因子基因能有效增强机体免疫机能，从而增强自杀基因疗法抗肿瘤作用效果 。但细胞因子毒副作用较大，价钱昂贵；导入细胞因子基因又可能存在无法持续表达以维持有效浓度、使用病毒载体多而潜在毒副作用增大、操作复杂成本高等缺点。 研究表明中医方药能有效改善荷瘤机体免疫状态15 ，因而设想在本研究构建的 HSVtk自杀基因治疗系统基础上利用中医方药调整自杀基因产生作用的炎症免疫微环境，有可能是提高自杀基因旁观者效应，增强自杀基因的抗肿瘤作用有效途径之一。由此可见，本研究是今后研究工作的起始和关键步骤。 参考文献： 1曹蕾，刘新垣癌症基因治疗新进展 国
19、外医学分子生物学分册，1994，16（5）：212 2Huber B E，Richards C A，Krenitsky T A，et alRetroviralmediated gene therapy for the treatment of hepatocellular carcinoma:an innovative approach for therapy Proc Natl Acad Sci USA，1991，88（18）:8039 3郭语彬HSVtkGCV 体系的旁观者效应及其研究进展 国外医学分子生物学分册，1999，21（4）：249 4Ramesh R，Marrogi Aj，Mu
20、nshi A，et alIn vivo analysis of the bystander effect:a cytokine cascade Exp Hematol，1996，24（7）:829 5Caruso M，Panis Y，Gagandeep S，et，alRegression of established macroscopic liver metastasis after in situ transduction of a suicide gene Proc Natl Acad Sci USA，1993,90（15）:7024 6Freeman S M，Ramesh R，Marr
21、ogi A J，et alImmune system in suicidegene therapy Lancet，1997,349（9044）:2 7苏州市第三人民医院中西医结合病区免疫室四君子汤、四物汤、六味地黄丸及参附汤对细胞免疫功能影响的研究 江西中医杂志，1980,2：32 8杜标炎，徐勤，罗惠，等六味地黄汤抗糖皮质激素所致小鼠胸腺萎缩的病理学研究 广州中医药大学学报，1999,16（2）：111 9杜标炎，徐勤，吴绍锋，等六味地黄汤对糖皮质激素肾阴虚模型免疫器官淋巴细胞凋亡的抑制作用（） 广州中医药大学学报，2000,17（3）：204 10杜标炎，谭宇蕙，吴映雅，等建立自杀基因疗法
22、联合中医中药肿瘤基因治疗方案的设想 广州中医药大学学报，2002，19（1）：1 11Wagner M J，Sharp J A，Summers W C，et alNucleotide sequence of the thymidine kinase gene of herpes simplex virus type 1 Proc Natl Acad Sci USA，1981，78:144 12曹雪涛，鞠佃文CD 自杀基因联合淋巴细胞趋向因子基因疗法的肿瘤治疗作用及免疫机理研究 中国肿瘤生物治疗杂志，1998,5（3）：180 13黄欣，曹雪涛，章卫平，等SCF 或（和）GM体内基因转染对“自杀基因”疗法抗肿瘤作用的增强效应及其相关机理的研究 中华肿瘤杂志，1998,20（4）：270
