1、贫铀对人肾小管上皮细胞的恶性转化及苯乙酸、亚硒酸钠的抑制作用作者：李蓉，艾国平，徐辉，楼淑芬，程天民，粟永萍，郑怀恩，蒋建新，黄跃生 【关键词】 亚硒酸钠 【Abstract】 AIM: To investigate whether depleted uranium (DU) could transform human kidney cells (HKC) to tumorigenic phenotype and whether antitumor inhibitor could be used as an effective measure to prevent carcinogenesis
2、. METHODS: After 24 h exposure to soluble DU (0.063-0.500 g/L), HKCs were incubated for 1 day to 3 months with or without 1.0-2.5 mol/L phenyl acetate or sodium selenite. The colony form efficient (CFE), growth curve and ConA agglomeration test in cells were observed. Some experiments such as anchor
3、ageindependent growth, tumor formation in nude mice, production of fragile histidine triad （FHIT）tumorsuppressor protein in cells were conducted. RESULTS: From 20 to 30 passages, HKC induced by DU formed colonies in soft agar and produced tumor in athymic mice. Expression of FHIT protein in some cel
4、ls decreased. Both phenyl acetate and sodium selenite reduced the frequency of colony formation in soft agar to (0.60.1). No tumor was found in athymic mice (0/3) (P0.05). CONCLUSION: HKCs treated with DU solution are transformed into tumorigenic phenotype. The transformation in vitro can be suppres
5、sed effectively by phenyl acetate and sodium selenite. 【Keywords】 depleted uranium; tumorigenic phenotype; phenylacetates; sodium selenite 【摘要】 目的： 探讨贫铀（DU）是否会引起人肾小管上皮细胞（HKC）向恶性表型转化，以及抑制物是否可有效地抑制这种恶性转化. 方法： 将 HKC 用可溶性 DU 溶液（0.0630.500 g/L）作用 24 h 后，再与 1.02.5 mol/L 的苯乙酸（PA）或亚硒酸钠(SS）孵育 1 d3 mo，观察不同代龄细
6、胞的集落形成率、生长曲线、刀豆蛋白（ConA）凝集实验、半固体琼脂集落形成率及裸小鼠成瘤性；检测脆性组氨酸三联体（FHIT）蛋白在转化细胞中的表达. 结果： 传约 2030 代后，HKC 在半固体琼脂中形成集落，注入裸小鼠后成瘤. 部分转化细胞的 FHIT 蛋白表达也较正常 HKC 减弱. PA, SS 可明显减少 HKC 在半固体琼脂集落形成率至(0.60.1)，裸小鼠也无皮下肿瘤形成（0/3） （P0.05). 结论：DU 可诱发 HKC 向恶性表型转化；用 PA, SS 抑制这种恶性转化的效果相似. 【关键词】 贫铀；恶性表型；苯乙酸；亚硒酸钠 0 引言 1991 年海湾战争后的十余年间
7、，关于退伍军人和平民癌症发生率增高的报道不断出现，贫铀(depleted uranium, DU)致癌的问题已引起重视1,2. 肾脏是贫铀蓄积的主要器官3，4 ，急性贫铀中毒会导致肾功能严重损伤5 ，而慢性铀蓄积是否会导致肾脏的恶性改变，目前还不清楚. 故研究 DU 对人肾小管上皮细胞（human kideny cell, HKC）的恶性转化作用，对探讨铀的蓄积效应，阐明 DU 对沉积器官肾脏是否有潜在危害，具有重要意义. 1 材料和方法 1.1 材料 人肾小管上皮细胞株由第三军医大学附属新桥医院肾脏病研究中心提供，细胞培养液由 RPMI1640 培养基、10 mL/L 的小牛血清、10 g/
8、L 的青霉素和链霉素组成. 无胸腺免疫缺陷型裸小鼠，BALB/c 系，断奶后 6 wk，由华西医科大学动物中心提供（动物合格证号：中科动检No.0000658）(分组见后面).兔抗人脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad ，FHIT）多克隆抗体、生物素标记的羊抗兔 IgG 和SPAB kit 购自北京中山公司. 苯乙酸（phenyl acetate, PA） 、亚硒酸钠（sodium selenite, SS）购自 Sigma 公司.其余试剂均为市售分析产品.酶联免疫检测仪为 Perkin Elmer 公司生产，型号为 HTS 7000 plus. 1.2 方法 1.
9、2.1DU 及抑制剂的作用分组如下： 正常 HKC 作为对照，DU 组的浓度点分别为 0.500, 0.250, 0.125 和 0.063 g/L；DU+苯乙酸组,其中 DU的浓度均为 0.250 g/L，苯乙酸的浓度分别为 1.0 和 2.5 mol/L，同时单独给予 2.5 mol/L 苯乙酸作为对照；DU+亚硒酸钠组,DU 的浓度均为0.250 g/L，亚硒酸钠的浓度分别为 1.0 和 2.5 mol/L，同时单独给予2.5 mol/L 亚硒酸钠作为对照. 分别用 0.0630.500 g/L 4 个 DU 浓度、以及作为对照组的 2.5 mol/L 苯乙酸、亚硒酸钠，诱导处于半对数生
10、长期的细胞，作用 24 h 后，换新培养液传代培养. DU+抑制剂组是将0.250 g/L DU 作用 24 h 后，分别加入 1.0 和 2.5 mol/L 的抑制剂苯乙酸和亚硒酸钠，作用 7 d，弃上清，继续换液传代培养. 1.2.2DU 及抑制剂作用后细胞集落形成率及存活分数各组细胞继续传代培养 5 代后，以 1103/25 cm2 接种细胞，8 d 后终止培养，PBS 漂洗3 次，纯甲醇固定，Giemsa 染色，低倍显微镜下计数 100 个视野的集落数.集落形成率=集落数/接种细胞数100%，存活分数=处理细胞集落形成率/对照细胞集落形成率100%. 1.2.3 生长曲线测定以 510
11、3/孔接种于 96 孔板，孵育 4 d 后，每个浓度点（包括 DU 和抑制剂）每日选择 3 孔，每孔加入 5 g/L 的 MTT 20 L，继续孵育 4 h，弃上清，加入 150 L DMSO，振荡 10 min. 在酶联免疫检测仪上测定 A492 nm 吸光度值，以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线. 1.2.4 刀豆蛋白（ConA）凝集实验向凹玻璃板中加入 5107/L 细胞悬液 0.1 mL，再分别加入不同体积的 ConA，使终浓度依次为 100, 50, 25, 12.5 mg/L，同时设空白对照，振荡 15 min，观察凝集现象. 1.2.5 半固体琼脂集落形成实验将 70
12、g/L 琼脂糖沸水熔化，与含 20 mL/L 小牛血清的 RPMI1640 全培养基混合，加入 24 孔板，铺制底层琼脂（浓度 7 g/L） ，每孔 0.8 mL，凝固后备用.制备细胞悬液，置于 39水浴箱中，加入已溶的 7 g/L 琼脂，混匀，使琼脂浓度为 3.5 g/L，最终细胞密度为 500 个/孔，将其注入底层琼脂，顶层琼脂凝固后表面覆以 1 mL的无血清培养基，置于 50 mL/L CO2 孵箱中培养. 14 d 后计数集落数，计算集落形成率. 1.2.6 裸小鼠成瘤实验制备细胞悬液，每只小鼠注射 1107 个细胞，每组接种 6 只，观察肿瘤生长情况并记录.当肿瘤达 1 cm3 时，
13、处死动物，解剖，固定包埋肿瘤组织块，进行病理学检查. 1.2.7 检测 FHIT 蛋白在转化细胞中的表达将转化的克隆挑出，加入置有盖玻片的 6 孔板中，当细胞贴壁并增殖到一定程度时，弃上清，取出盖玻片，多聚甲醛固定细胞 30 min，自然风干，免疫组化染色，按试剂盒说明书操作. 以 TBS 代替第一抗体作阴性对照. 结果判断： 镜下细胞显示黄色或棕色颗粒状沉淀物为阳性,则将该病例判为蛋白表达阳性,否则判为表达阴性. 记录阳性染色细胞的百分数以评估抗体作用的差异. 0 分： 无沉淀物染色，1 分： 1%25%细胞沉淀物阳性染色，2 分： 26 %50%细胞沉淀物阳性染色,3 分: 50%细胞沉淀
14、物阳性染色. 阳性对照为正常 HKC，细胞内染色. 没有内部阳性对照染色的病例认为结果不确定. 统计学处理： 用 SPSS10.0 软件包作方差分析及均数间两两比较的显著性检验,方差不齐时采用非参数方法. 对 Tab 4 的等级资料作非参数检验（KruskalWallis 检验）. 2 结果 2.1DU 及抑制剂作用后细胞集落形成率和存活分数在 0.0630.500 g/L 范围内，随 DU 浓度的增加，细胞集落形成率逐渐下降（P0.01）;受DU 和抑制剂同时作用的细胞，细胞的存活和集落形成率均上升（P0.01） ，两种抑制剂效果差异不显著;单独受抑制剂作用的细胞存活和集落形成率比正常细胞稍
15、降低. 存活分数表现相似(Tab 1).表 1 细胞集落形成率和存活分数（略） 2.2 细胞生长曲线的改变受 DU 作用的细胞增殖速度在 4872 h 时与正常 HKC 接近，以后增殖较快；受 DU 和抑制剂同时作用的细胞，增殖与正常 HKC 基本上按相同比例生长，趋势走向相似；仅受抑制剂作用的细胞也与正常细胞相似（Fig 1）. 2.3ConA 凝集实验结果 DU （0.500 g/L）作用的细胞在 12.5 mg/L ConA 时就有凝集现象，在 25 mg/L ConA 时凝集进一步增强;受 DU 和抑制剂同时作用的细胞，凝集度与正常细胞相似（Tab 2）.表 2 刀豆蛋白（ConA）凝
16、集实验（略） 2.4 半固体琼脂克隆形成实验和裸小鼠成瘤实验检测 20 代细胞在半固体琼脂中的克隆形成率，正常细胞无克隆形成，接种裸小鼠后 3 mo 内仍未观察到肿瘤形成.受 0.500 g/L DU 作用的细胞克隆形成率最高，2 mo 内即可观察到肿瘤形成，平均潜伏期（56.33.2） d. 受 2.5 mol/L 苯乙酸或亚硒酸钠抑制后，0.250 g/L DU 诱导的转化细胞克隆形成率显著下降，裸小鼠在 3 mo 未成瘤(Tab 3).表 3 半固体琼脂克隆形成实验和裸小鼠成瘤实验（略） 对瘤组织切片的病理学鉴定，呈低分化癌，有的癌细胞呈巢团状、腺管状或散在分布，有的癌细胞呈条索状排列(
17、Fig 2). 经核型分析为人来源的细胞. 2.5FHIT 蛋白在转化细胞的表达 FHIT 定位于正常肾小管上皮细胞胞质内（Fig 3A） ，为一种细胞胞质内蛋白，其发挥功能的场所位于细胞内. DU 作用的细胞中可见 FHIT 弱表达（Fig 3B） ，表达类型为胞质弥漫型，随 DU 浓度的上升，FHIT 蛋白失表达增加（P0.05） ，阳性率降低. 加入抑制剂可使 FHIT 失表达的几率降低，发生恶性转化的几率大大缩小，两种抑制剂效果相似（Tab 4）. 表 4 受贫铀和抑制剂作用的细胞中 FHIT蛋白表达情况（略） 3 讨论 公众最关心的是 DU 导致的远期效应，尤其 DU 致癌的问题目前
18、已引起广泛关注. Miller 等6发现 DU 会诱发培养的人成骨细胞向肿瘤表型转化，用苯乙酸、苯脂肪酸可抑制这种转化. 杨陟华等7发现难溶性 DU 可诱发人支气管上皮细胞恶性转化，用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）可抑制这种转化. 肾脏是 DU 滞留的主要器官，DU 对 HKC 具有细胞毒性8. 在本研究所用的 DU 浓度范围内，细胞传至数代，逐渐出现形态改变、生长速度加快、转化细胞刀豆蛋白凝集度增强等，说明细胞已经过了形态变化的阶段.再经过数代后，出现半固体琼脂集落形成实验阳性，说明细胞对血清和细胞之间通讯的依赖性降低，具有了低密度条件下在半固体琼脂中形成集落
19、的能力，表明可能已失去接触抑制，并具备了非贴壁生长能力，出现了恶性表型.但可能因人的转化细胞异质性，它们并不能完全反映其成瘤性.裸小鼠成瘤是判断受试物诱发恶性转化的最终指标，结果表明，受 DU 作用的细胞具有成瘤性，即这些细胞已发生了恶性转化；正常HKC、贫铀和抑制剂共同作用的细胞均未出现致瘤性，有力地证实了 DU对离体人类细胞具有恶性转化能力，抑制剂可显著减少以至消除这种转化能力. 对 DU 作用形成的恶性转化细胞，其转化机制是什么，是否与 fhit基因表达异常有关，弄清这些问题，有助于进一步阐明 DU 致癌的机制，为防治提供依据. Fhit 基因位于人类染色体 3p14.2，包含人类最常见
20、的染色体脆性部位 FRA3B 和与肾细胞癌有关的染色体易位 t(3;8)(p14.2;q24)的断裂点.近来研究发现，人类肾癌中存在 FHIT 基因及其转录产物的异常7. 免疫组化结果说明恶性转化细胞中 FHIT 表达强度明显低于正常细胞，也似乎说明表达强度的高低与转化细胞克隆的恶性程度有一定的关系，应用抑制剂可使细胞恶性转化的几率大大缩小.Fhit抑癌基因表达的缺失可能与 DU 诱发的 HKC 恶性转化关系密切，这对进一步研究 DU 致癌的机制有一定的指导意义. 用苯乙酸、亚硒酸钠来抑制 DU 诱发 HKC 的恶性转化，效果显著，二者抑制效率相似，但抑制作用的机制可能与 RAS 蛋白的信号转
21、导有关，具体如何还需进一步研究. 【参考文献】 1 Durante M, Pugliese M. Estimates of radiological risk from depleted uranium in war scenarious J. Health Phys, 2002；82:14-20. 2 authors listed. Mixed messages about depleted uranium J. Lancet Oncol, 2001； 2(2):65. 3李蓉，粟永萍，徐辉，等. 铀在植入贫铀片和取片大鼠体内的动态变化和分布J. 中华放射医学与防护杂志, 2004；24(2
22、):16-19. LI R, Su YP, Xu H, et al. Distribution of uranium in rats implanted with depleted uranium fragments and influence of the fragments taken out J. Chin J Radiol Med Prot, 2004；24(2):16-19. 4 李蓉，艾国平，徐辉，等. 吸入贫铀粉尘和/或嵌入贫铀片大鼠体内铀的分布J. 第四军医大学学报，2004；25（6）：572-575. Li R, Ai GP, Xu H, et al. Distributi
23、on of uranium in rats inhaling DU aerosol and/or implanted with depleted uranium fragments J. J Fourth Mil Med Univ, 2004； 25（6）:572-575. 5 李蓉，艾国平，徐辉，等. 植入贫铀片大鼠血液和肝肾功能的变化J. 第四军医大学学报，2004；25(2):182-185. Li R, Ai GP, Xu H, et al. Changes of hematologic and urinary parameters and functions of liver and
24、 kidney after implantation of depleted uranium fragments J. J Fourth Mil Med Univ, 2004;25(2):182-185. 6 Miller AC, Blakely WF, Livengood D, et al. Transformation of human osteoblast cells to the tumorigenic phenotype by depleted uraniumuranyl chloride J. Environ Health Perspect, 1998；106:465-471. 7 杨陟华，范保星，陆颖，等. 贫铀诱发人支气管上皮细胞恶性转化J. 癌症，2002；21：944-948. Yang ZH, Fan BX, Lu Y, et al. Malignant transformation of human bronchial epithelial cell (BEAS2B) induced by depleted uranium J. Chin J Cancer, 2002；21：944-948. 8 李蓉，艾国平，徐辉，等. 贫铀对肾小管上皮细胞的急性毒性作用J. 第三军医大学学报，2004；26(3):185-188.
