1、阳离子选择性耗尽进样 胶束扫集法测定尿液中的麻黄碱和可待因作者：李斯光 李海燕 蔡卓 程昊 李利军【摘要】 联用选择性耗尽进样和胶束扫集两种在线富集技术，建立了尿样中麻黄碱和可待因含量测定的灵敏方法，并通过日内、日间、柱间实验考察了方法的稳定性。胶束扫集电动色谱缓冲体系为 80 mmol/L 十二烷基磺酸钠(SDS)20 mmol/L NaH2PO4(pH 2.20)18% 乙腈(V/V)，分离电压-20 kV，进样电压 10 kV，进样时间 150 s，测量波长 200 nm。同时讨论了 pH 值、SDS 浓度、选择性耗尽进样萃取液电导、进样电压、进样时间和进水长度等对分离效果的影响。结果显
2、示，方法富集功能很强，对麻黄碱和可待因含的富集倍数分别达 5800 和 2490 以上。在优化条件下，方法线性关系良好(r=0.9999)，麻黄碱和可待因的线性范围分别为 0.50016.0 g/L 和 2.0048.0 g/L，检出限分别为 0.10 和0.80 g/L。方法稳定性良好，日内、日间和柱间的 RSD 分别为2.6%，5.9%和 6.6%。应用于实际尿样分析，回收率在 96.8%106%之间，RSD4.7%，结果比较满意。 【关键词】 选择性耗尽进样，胶束扫集电动色谱，麻黄碱，可待因，人尿1 引 言针对毛细管电泳紫外检测器浓度灵敏度较差的问题，出现了多种新技术和新方法，包括应用高
3、灵敏度检测器、改造检测池和在线富集技术等。其中在线富集技术无需增加设备或改造检测池，仅通过对缓冲液组成和进样程序进行调控就可显著提高灵敏度，颇受重视。在线富集技术大致可分为样品电场堆积1、高盐堆积2,3、胶束扫集4和移动化学介面技术5等，其中堆积技术往往在进样时实现，可与后两种技术联用68，进一步改善灵敏度。本实验结合阳离子选择性耗尽进样(CSEI)和胶束扫集(SweepMEKC) 两种在线富集技术，成功对尿液中的麻黄碱和可待因进行了测定9。可待因、麻黄碱等常用于止咳药，但这两种药物滥用容易引起药物依赖性，严重可导致服药者精神崩溃甚至作出极端行为。因而，尿液中这两种成分的含量测定对临床医学、药
4、代动力学均具有重要意义。已报道的相关测量方法较多，主要有高效相色谱法10,11、气相色谱法12,13、毛细管电泳法14,15和微乳液电动色谱法16,17，但未见毛细管电泳在线富集法同时检测尿液中麻黄碱和可待因的报道。相比而言，CSEIsweeping 法具有灵敏度高、选择性好、样品用量少、样品处理简便、方法经济快速等优点。2 实验部分2.1 仪器与试剂ACS2000 型高效毛细管电泳仪(北京彩陆公司)，包括实验室自制电动进样器，未涂层熔融石英毛细管(62.0 cm50 m， 40.0 cm)，检测波长 200 nm。UV2102PC 型紫外 可见分光光度计(美国 Unico 公司); SXZ8
5、1 光学显微镜(梧州光学仪器厂); DL60D 超声波清洗器(上海之信公司)，分析天平(美国奥豪斯上海公司);Mettler toldedo Delta 320型酸度计(瑞士梅特勒托利多公司);DDS11A 电导率仪(上海雷磁公司)。2.2 实验方法配制盐酸麻黄碱、磷酸可待因和盐酸曲马多标准贮备液，浓度分别为 416, 400 和 492 mg/L，置于冰箱中 4 保存。pH 值及电导率均使用 85% H3PO4 调节。所有溶液进入毛细管前均用 0.45 m 滤膜过滤，超声脱气。实验前依次用 1 mol/L NaOH 溶液、水、萃取缓冲液分别冲洗 10 min。选择性耗进样 胶束扫集方法：先将
6、毛细管充满萃取缓冲液，10 kV 下进样 150 s，迅速采用-20 kV 进行分离。两次进样间毛细管用萃取缓冲液冲洗 5 min。日内实验：对同一标准品，每隔 2 h 测定一次，连续测定 5 次，统计。日间实验：配制标准样品溶液，等分成 5 份，每天取一份测定 3 次，连续测定 7 d，统计。柱间实验：截取等长毛细管柱 3 根(同批次，并在显微镜下对进样端进行修整)，使用同一标准样品，每根柱子测定 3 次，统计。尿样采自服用磷酸可待因口服液的病人。取 100 L 尿样，加入 5 L 2.5 mol/L NaOH，再加入乙酸乙酯 2.00 mL，旋涡振荡 10 min，3000 r/min 离
7、心 5 min，取乙酸乙酯层 100 L，加入 5 L 0.05 mol/L HCl，45 下减压蒸干，残余物用 1000 L 水溶解，得待测液。待测液稀再稀释 12 倍测定麻黄碱。3 结果及讨论3.1 胶束扫集缓冲体系、有机改性剂和 SDS 浓度的选择本实验利用低 pH 抑制电渗流，采用磷酸盐体系，考察了体系的 pH值(2.00, 2.20, 2.40 和 2.60)、有机改性剂的种类(乙腈、甲醇、异丙醇、乙醇)及浓度(10%25%，V/V)对麻黄碱、可待因和曲马多出峰情况的影响， 图 1 SDS 浓度对峰高的影响1. 麻黄碱(ephedrine);2. 可待因(codeine); 3. 曲
8、马多(tramadol)。最后选定缓冲体系为 20 mmol/L NaH2PO4(pH 2.20)18% 乙腈(V/V)。考察了 SDS 浓度为 20, 40, 60, 80 和 100 mmol/L 时 3 种样品的出峰情况，结果如图 1 所示，当 SDS 浓度增加时，峰高增大，出峰时间缩短，这是由于当 SDS 浓度增大时，被测物的保留因子增大，样品与胶束的作用增强，浓缩到更高的浓度，因而峰高增高，出峰时间略有缩短。但是 SDS 浓度的增高会导致电流增大，使 SDS 形成的堆积区宽度增大，引起峰宽增大，峰高减小。本实验在 SDS 浓度大于 80 mmol/L 时，出现峰高降低的现象，因而 S
9、DS 的浓度选择为 80 mmol/L。3.2 胶束扫集分离电压考察了负电压为 16, 18, 20, 22 和 24 kV 时 3 种样品的出峰情况。结果显示，随电压升高，3 种样品峰高呈降低趋势，但出峰速度增快。综合考虑峰高及出峰速度，分离电压选择为-20 kV。3.3 选择性耗尽进样萃取液电导考察萃取液电导率是影响电堆积效果的主要因素。根据体系相近的原则，实验选择以不含 SDS 的分离缓冲液为萃取液，并使用 H3PO4 进行调节，考察了电导为 3.5(不含 SDS 的分离缓冲液), 5.6, 6.6(优化条件下分离缓冲液电导), 7.6 和 8.6 mS/cm 时曲马多、麻黄碱和可待因的
10、出峰情况。结果显示，在萃取液电导与电泳分离缓冲液电导一致时，出峰最高(如图 2A 所示)，这是样品及 SDS 的电堆积行为和电泳电流共同作用的结果。实验最终选择 20 mmol/L NaH2PO4 乙腈 18%(电导 6.6 mS/cm) 为萃取液，此时电泳电流也较稳定。3.4 选择性耗尽进样中进样电压、进水柱长度及进样时间的影响考察了进样电压为 8, 10, 12, 14, 16, 18 和 20 kV 时的进样效果。结果表明，随进样电压的升高，进样效率增大，但峰宽有所展宽，进样时或随后的分离过程中出现断流的机率增大，为了保证较高的进样成功率，实验选用较低的进样电压 10 kV。为考察水柱的
11、影响，比较了进水时间为 0, 20, 40, 60, 90, 120 s(H=16.0 cm)时的出峰情况。结果表明，对于使用正电源进样，进样时间长达数分钟，毛细管进样端经物理修整的情况，进水长度对进样效果的影响并不明显。考虑到简化操作有利于提高实验的稳定性，进样前不引进水柱。考察了进样时间为 60, 120v150, 180, 210 和 240 s(U=10 kV)时的出峰情况，结果如图 2B 所示。随进样时间增长峰高呈增高趋势，但峰宽增大，柱效略有下降。当进样时间180 s 时，样品量过载，峰严重展宽，甚至分峰。综合考虑峰高和峰形，进样时间设定为 150 s。3.5 方法富集能力和方法性
12、能考察文献较多采用相对法检验在线富集技术的富集能力，即以某种电泳条件下的峰面积、峰高或检出限为参考基准18。但是不同的研究报道采用的基准往往不同，因此得到的富集倍数难以进行比较。为此，本实验设计了一种新方法：以加压推使单一样品经过检测窗口时产生的吸收峰为基准，再用选择性耗尽进样 胶束扫集法的中样品的峰高与之比较，得到绝对富集倍数。结果得出，麻黄碱、可待因和曲马多的绝对富集倍数分别为 5807, 2491 和 10256，如图 3 所示。A：样品的吸收峰(absorption response of sample); B: CSEIsweeping 电泳图(electropherogram ob
13、tained by CSEIsweeping). 分离缓冲液(separation buffer ) 80 mmol/L SDS, 20 mmol/L NaH2PO4(pH 2.20), 18% ACN(V/V); 进样时间(injection time) 150 s(10 kV); 分离电压(separation voltage)-20 kV. 曲马多、麻黄碱、可待因的浓度(concentration of tramadol, ephedrine and codeine): A. 19.7, 16.6,32.0 mg/L; B. 4.0, 8.0, 32.0 g/L。1. 麻黄碱(ephed
14、rine); 2. 可待因(codeine); 3. 曲马多(tramadol)。用系列标准溶液，在优化条件下，对选择性耗尽进样 胶束扫集法的性能进行了考察，得到麻黄碱和可待因的标准曲线、线性范围、相关系数及检出限(见表 1)。表 1 麻黄碱和可待因的标准曲线、线性范围、相关系数及检出限Detection limit (g/L)麻黄碱 Ephedrine0.516.0Y=0.205X+0.0240.99990.10 可待因 Codeine2.048.0Y=0.0601X-0.008700.99990.80 3.6 选择性耗尽进样 胶束扫集法稳定性实验在优化条件下，标准品按 2.2 项进行日内、
15、日间及柱间稳定性实验，统计结果见表 2。可见使用内标物的选择性耗尽进样 胶束扫集法稳定性良好，甚至更换毛细管对实验的重复性也无显著影响。3.7 实际样品分析及回收实验尿样稀释 400 倍后直接进样，进行定性分析，加标前后CSEIsweeping 图谱见图 4A 和 4B。可见尿样中含有麻黄碱和可待因。由于尿样含较多无机盐，直接电动进样定量分析存在干扰，因而，按样品处理项对样品进行萃取，适当稀释后测定，可待因和麻黄碱的电泳图谱见图 4C。经计算，尿样中麻黄碱和可待因的含量分别为 13.1 和 2.02 mg/L，RSD(n=3)分别为 2.5%和 1.3%。表 2 日内、日间及柱间稳定性实验Ep
16、hedrine 峰高 Peak height RSD (%)13.512.814.310.27.33.8峰面积 Peak area RSD (%)15.317.813.413.93.52.0 保留时间 Retention time RSD (%)0.30.21.41.52.32.4 相对面积 Relate area RSD (%)2.61.05.91.02.06.6 图 4 实际尿样 CSEIsweeping 图谱Fig.4 Electropherogram obtained by CSEIsweepingA. 实际尿样(real sample);B，C. 加标尿样(real sample s
17、piked with standards); D. C 样经稀释(diluted sample C)。电泳条件见图 3 (electrophoresis conditions are the same as in Fig.3)。 1. 麻黄碱(ephedrine); 2. 可待因(codeine); 3. 曲马多(tramadol)。 在优优条件下，进行回收实验，结果见表 3。结果表明，选择性耗尽进样 胶束扫集法可用于尿样中麻黄碱和可待因的含量测定。表 3 尿样中麻黄碱与可待因的回收率【参考文献】1 Quirino J P, Terabe S. J.Chromatogr. A, 2000, 9
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