1、血栓与止血检验的临床应用,安徽医科大学第一附属医院 司 力,交流提纲,血栓与止血常用检测项目 血栓与止血检验的临床应用 常见问题及对策,3,血栓与止血检验涉及临床多学科多种疾病： 心梗； 脑梗； 重症肝炎； 血友病； 血管性血友病（VWD）； 深静脉血栓（DVT）和肺栓塞（PE）； 弥散性血管内凝血（DIC）； 抗磷脂血栓综合征； 易栓症诊断和分型； 肿瘤 ,止凝血的动态平衡机制,血管中流动的血液为什么不凝固破损的血管为什么能止血,止血过程,BV Injury,PlateletActivation,Plt-Fusion,Blood Vessel Constriction,Coagulation
2、Activation,Stable Hemostatic Plug,Thromibn,Fibrin,ReducedBlood flow,Tissue Factor,Primary hemostatic plug,Neural,凝血与抗凝调节,凝血与纤溶调节,血栓的形成,凝血酶是血管损伤、凝血激活和血小板激活的纽带,胶原,组织因子,凝血酶IIa,血小板激活,凝血酶原II,ADP,TXA2,凝血瀑布,纤维蛋白原,纤维蛋白,血小板聚集,Thrombin is a critical mediator in coagulationElicits multiple responses in platele
3、ts,一、血栓与止血检测,（一）血管壁检测,表1 血管壁检测,注：BT，出血时间；vWF:Ag，血管性血友病因子抗原； vWF:A，血管性血友病因子活性； TM：A，凝血酶调节蛋白活性；ET-1，内皮素-1。,（二）血小板检测,表2 血小板检测,注：PLT，血小板计数；PAIg，血小板相关抗体；PAgT，血小板聚集试验,表2 血小板检测,注：PPA，血小板促凝活性；CRT，血块收缩试验；TXB2，血栓烷B2,X,Xa,XII,XIIa,XI,XIa,IX,IXa,VIII,PROTHROMBIN,THROMBIN,FIBRINOGEN,FIBRIN,XIIIa,VII,TISSUE FACTO
4、R,X,VIIa,XIII,V,Ca2+ PL,Ca2+,Ca2+ PL,Ca2+,INTRINSIC PATHWAY,EXTRINSIC PATHWAY,FINAL COMMON PATHWAY,STABLE FIBRIN CLOT,（三）凝血系统检测,图3 凝血机制示意图,表3 凝血系统检测,注：CT，全血凝固时间；APTT，活化部分凝血活酶时间；PT，血浆凝血酶原时间；Fg，血浆纤维蛋白原,表3 凝血系统检测,注：F:C，凝血因子活性；F:C，凝血因子活性；FPA，纤维蛋白肽A；F1+2，凝血酶原片段1+2；TF，组织因子；sFMC，可溶性纤维蛋白单体复合物,（四）抗凝血系统检测,细胞（
5、组织）抗凝： 单核-巨嗜细胞及肝细胞吞噬、灭活活性凝血物质。体液抗凝： 丝氨酸蛋白酶抑制因子 AT（50-67%）、HC-II、2-MG PROTEIN C抗凝系统（PC、PS、TM、PCI） TFPI,表4 抗凝血系统检测,注：TT，凝血酶时间；ACLA，抗心磷脂抗体；LEA，狼疮抗凝物质,表4 抗凝血系统检测,注：AT:Ag，抗凝血酶抗原；AT:A，抗凝血酶活性；PC:A，蛋白C活性；TPS/FPS，总蛋白S/游离蛋白S；TFPI:A，组织因子途径抑制物活性；TAT，凝血酶-抗凝血酶复合物,（五）纤溶血系统检测,纤溶降解产物,22,纤维蛋白原,纤溶酶,交联纤维蛋白,Y碎片,D碎片,X碎片,
6、D二聚体,纤溶酶,纤维蛋白,凝血酶,E碎片,D碎片,因子、Ca2+,DD/E碎片,DY/YD碎片,YY/DXD碎片,DD碎片,表5 纤溶系统检测,注： ELT,优球蛋白溶解试验;t-PA:A,组织型纤溶酶原激活剂活性;PLG:A,纤溶酶原活性;PAI-1:A,血浆纤溶酶原激活物抑制剂活性;2-AP:A, 2-抗纤溶酶抑制物活性;FDP,纤维蛋白（原）降解产物;D-D,D-二聚体;PAP,纤溶酶-抗纤溶酶复合物;TAFI，凝血酶激活纤溶抑制物,常见止凝血项目的检测方法,Clotting 凝固法（PT,APTT,Fg,TT,Factors） 光学法（比浊法） 粘度法（磁珠法）,Chromogeni
7、c 发色底物法（AT,PLG,2-AP,PC,PS）,Immunological 免疫法（D-Dimer,FDP,vWF）,根据血浆凝固过程中浊度的变化来测定 干扰因素：黄疸、脂血,凝固法,光学法（比浊法）,根据血浆凝固过程中粘度的变化来测量 不受黄疸、脂血、试剂浊度干扰,凝固法,粘度法（磁珠法）,Activating coil,Activating coil,基于粘度法的STAGO 检测系统,钢球,该检测基于被测血浆的粘度增加，可通过一个钢球的运动状态测得。钢球被2个线圈激活，后者交替作用维持自然震荡力。,当初始试剂加入时，检测即立刻开始,当钢球开始左右摆动时，计时器开始计时,检测小球的振幅
8、,当凝块出现时，粘度增加，振幅变小。,基于不同的计算方法，即使凝块形成很弱，即使小球没有停止运动，计时器也停止计时。,凝血因子等具有蛋白水解酶的活性，能作用于人工合成的肽段底物，从而释放出产色基团(PNA)使溶液呈色,检测显色的深浅进行测定。,底物显色法,利用抗原抗体反应后,浊度的变化对被检物进行定性或定量测定,免疫法,临床常用血栓与止血测试项目,血浆凝血酶原时间-PT 活化部分凝血活酶时间APTT血浆凝血酶时间-TT纤维蛋白原-FIB凝血因子活性、V、X；、抗凝血酶-AT纤溶酶原-PLG纤维蛋白(原)降解产物-FDP血浆D-二聚体-D-D血管性血友病因子-vWF低分子肝素-LMWH蛋白C、蛋
9、白S-PC、PS狼疮样抗凝物-LAC血小板聚集试验-PAgT因子XIII定性因子VIII抑制物,二、血栓与止血检测的应用,（一）在出血性疾病的应用,一期止血缺陷（血管壁-血小板型止血缺陷）二期止血缺陷（凝血因子-抗凝物质型止血缺陷） 纤维蛋白溶解亢进,一期止血缺陷,一期止血缺陷,38,病例1：血管性血友病（vWD）,女性，28岁，月经30d未净。有鼻衄，月经量多史。PE：轻度贫血貌，皮肤散在新鲜出血点与陈旧性紫斑。实验室检查：血常规：Hb 82g/L，WBC 6.8109/L，PLT 96109/L。BT 20，APTT 44.7s，PT 11.7s，TT 15.2sPAgT：ADP（2 mo
10、l/L) 53.4， 53.2， 59.8 Risto(1.25mg/L) 12.7， 10.1， 15.3 vWF:Ag 21.7%（参考范围70%150%）,二期止血缺陷,41,病例2：血友病 HA（重型）,男孩9岁，自幼反复膝关节疼痛肿胀，1周前运动后，右膝关节疼痛难忍，肿胀。X示膝关节骨膜囊肿行骨科手术，术中出血不止。 其舅舅有类似病史。实验室检查： PLT 18.4109/L，BT 4 ，PT 13。 APTT 90，Fib 3g/L，TT 18 FVIII:C 1%（参考范围：103% 25.7%） FIX 84% ，FXI 100%。HA分型：（根据FVIII:C减低程度） 重型
11、（ 1%）中型（2%5%）轻型（6%25%） 亚临床型（26%45%）,Clinical Bleeding History(preferably with a validated questionnaire),Screening StudiesCBC，PT，APTT，TT+/-Bleeding time or PFA100,Coagulation Factor Deficiencies,Defects of Primary Haemostasis,FVIIIFIXFXI,APTT-based assays,FVIIFXFV,PT-based assays,Fibrinogen,vWF:AgvW
12、F:RcoFVIII:C,vWF multimersRIPA,Platelet Disorders,Platelet numberPlatelet morphologyPlatelet function studies,vWD,出血性疾病的诊断流程,（二）在血栓性疾病的应用,1、冠心病与血栓形成,冠心病的发病机制是冠状动脉管壁粥样斑块的堆积，或同时有冠状动脉痉挛或血栓形成。凝血、纤溶与血小板活性异常在冠心病的发病中具有重要意义。,动脉粥样硬化造成动脉管腔狭窄,粥样斑块破裂引发的动脉完全堵塞,动脉粥样硬化：一种渐进性过程,纤维斑块,脂肪条纹,粥样硬化斑块,斑块破裂溶合及血栓形成,正常,临床静止期
13、,心绞痛短暂性脑缺血发作(TIA)间隙跛行-PAD,心肌梗死,脑卒中,严重下肢缺血,心血管死亡,年龄增长,检查项目： FIB：健康人FIB水平与将来发生心血管疾病呈正相关。 AT、vWF、FVIII：与致命性冠状动脉事件相关。 PLG 、PAgT：升高易患冠心病。 D-D：高危人群中升高。,2、脑血管病与血栓形成,病因：是由于供应脑的动脉因动脉粥样硬化等 自身病变使管腔狭窄、闭塞，或在狭窄的基础 上形成血栓所致。因此，血管内皮的损伤、血小板功能亢进、凝血因子增多、抗凝蛋白减少、纤溶活性的改变均有助其血栓形成。,检查项目： vWF、TM 、PAgT（血管内皮、血小板） FIB、FVII、AT、P
14、C、PS （凝血、抗凝） D-D、 PLG、FDP （纤溶）,49,静脉血栓栓塞症（VTE）是继心血管血栓和脑血管血栓后的第三大血栓疾病。深静脉血栓形成(DVT)和肺血栓栓塞症(PTE)是VTE病程中的两个连续阶段，也是VTE在不同脏器中的表现。诊断PTE时应联想到DTV，诊断DTV时也应联想到PTE，以免漏诊。,3、静脉血栓栓塞症（VTE）,大约有80%的DVT患者无临床症状,栓塞物,大约50%有腿部近端DVT的病人患有无症状的PE,在80%患有PE的病人中能查到DVT (无症状),转移,血栓,1. Pesavento R, et al. Minerva Cardioangiologica
15、1997;45:369-375.2. Girard P, et al. Chest 1999;116:903-908.,静脉血栓栓塞：DVT和PE之间联系紧密,静脉血栓栓塞症的危险因子,AT缺乏症异常纤溶酶原血症PS缺乏症高同型半胱氨酸血症异常纤维蛋白原血症低纤溶酶原血症APC低效性(Factor V Leiden)凝血酶原遗传因子变异（G20210A）抗磷脂综合征恶性疾病、肾硬变症候群口服避孕药服用雌激素制剂手术、妊娠、红细胞增多症、脱水等,长期卧床长途旅行（经济舱症候群）肥胖、妊娠淤血性心力衰竭脑血管障碍等,凝固功能亢进,静脉血淤积,先天性,后天性,静脉壁损伤,手术引起的损伤（整形外科、妇
16、产科、普外科）各种导管检查、治疗静脉炎 等,美国PET年患病率约为69/10万；DVT年患病率约为145/10万，其病死率高达25%30%。在有症状的PTE中，约60%的患者被漏诊，仅7%得到合理诊断和治疗。在我国，有关PTE的发病率缺乏准确统计，但近年PTE的诊断有明显的增长。PTE“少见”的原因主要原因是存在较高的漏诊率（77%87%）,检查项目 FIB、vWF：增高 AT、PC或PS ：减低 PLG：减低 FDP、D-D：增高,D-D检测在DVT和PE诊断中的应用,用临床症状来诊断DVT和PE是不准确和不敏感的。D-D检测在无症状的高危患者中对DVT进行早期筛查，有利于血栓的预防。对临床
17、疑诊为VTE的患者，当血浆D-D浓度低于临界值(0.5g/ml)时，其阴性预测值为99.6%，可以作为排除VTE诊断的筛选试验。,英国胸科学会可疑急性肺栓塞管理指南,血D-D检测应在临床可能性评估后使用D-D不应该在高临床PE概率患者中使用，应尽快进行治疗对于中低临床可能性的患者，D-D阴性的患者可以除外PE，且无需影像学检查每个医院应该提供D-D检测试验的灵敏度和特异性信息,D-Dimer的诊断灵敏度和特异性比较,常用D-D试剂盒（胶乳免疫比浊法）性能比较,注：FEU：纤维蛋白原等量单位；DDU：D-二聚体单位；1FEU=1.72.2DDU,合理设置D-D的Cutoff值的重要性,D-D测定
18、的方法学存在差异，在应用上难以实现标准化，应根据每个体系的检测特性，各自建立具有临床应用价值的Cutoff值：该值应在大规模临床试验的基础上获得还应根据检出特征选择适当的灵敏度和特异性来确定该值D-D的的Cutoff值设置要合理：Cutoff过低，灵敏度过高，假阳性过多，检测的特异性差，达不到筛查的效果。Cutoff过高，假阴性过多，漏诊了深静脉血栓或肺栓塞，后果将不堪设想。Cutoff的选择不应简单照搬厂家推荐值，应参考在权威杂志发表的有临床诊断价值的实验结果，并在使用之初针对本地人群或患者加以验证。,合理设置Cutoff值的重要性(PE),怀疑DVT的诊断步骤,临床怀疑DVT,评估主要的临
19、床可能性(PCP)（低、中、高）,测定D-二聚体,低于临界,无DVT,高于临界,静脉加压超声,阴性(46),阳性(24),PCP,DVT,低/中,高,静脉造影,阴性,阳性,无DVT,DVT,(500 g/L),(500 g/L),怀疑PE的诊断步骤,临床怀疑PE,评估主要的临床可能性(PCP)（低、中、高）,测定D-二聚体,低于临界,无PE,高于临界,静脉加压超声,阴性,阳性,通气灌注扫描概率,PE,正常/近正常,高,肺血管造影,阴性,阳性,低,PE,(500 g/L),(500 g/L),低/中,PCP,无DVT,中/高,肺栓塞,4、恶性肿瘤与血栓形成,肿瘤的血栓形成在1865年被第一次报道
20、(Armand Trousseau) 并在1878年确定了肿瘤生长与血液凝固存在密切关系的假设。近30年的基础研究和临床研究证实肿瘤与血栓形成至少存在两个方面的联系：其一，是恶性肿瘤的代谢产物或其对组织、血管的损伤激活凝血和血小板系统；其二，是血栓形成会保护肿瘤细胞不被破坏，并利于其转移。,恶性肿瘤与血栓形成,恶性肿瘤患者中血栓发生率为10%30%，其中以腺癌并发血栓最常见。（如：胰腺癌为18%，支气管肿瘤16%，胃癌3.8%，卵巢癌8%，前列腺癌4%，大肠癌3.5%，泌尿道癌3%，造血系统恶性疾病2%。）同样，也有不少恶性肿瘤会导致出血，或者在血栓形成的同时伴随有出血，一般认为10%40%的
21、恶性肿瘤有明显的出血表现。血栓与出血是恶性肿瘤致死原因之一。,恶性肿瘤转移时导致高凝状态的机制,血小板和纤维蛋白原包裹肿瘤细胞,D-D F F FIB ,恶性肿瘤,组织因子,血流淤滞,运动减少,阻塞静脉,自身表达,手术放化疗,血栓形成(主要为VTE),XaIIa,VEGF纤溶活性血小板活性物质释放,转移、侵润,血小板活化,注：VEGF（血管内皮生长因子）,检查项目： vWF、FVIII、FVII、FIB、AT、PLG、D-D、FDP PAgT、FPA、TAT、F1+2、PF4、PAP FIB和AT减少，D-D、FDP增高，提示肿瘤有较 广泛的转移。,病例3：早期胆管癌,男性，65岁， 椎管内注
22、射止痛药造成机械性损伤住康复科；检查时，D-二聚体3000g/L LMWH应用无效；相关血栓筛查指标正常肝功能检查正常肿瘤标志物（CA242、CA199） 进一步影像学检查 早期胆管癌切除痊愈。提示：当患者血浆D-二聚体水平增高，并难以降低时应首先考虑存在三个问题：（1）血栓形成和高凝状态？（2）肝脏疾患？（3）恶性肿瘤？,5、创伤、手术与血栓形成,创伤或手术诱发的血栓形成主要机制有：血管壁损伤、血流减慢和血液凝固性增高。最常见的血栓栓塞并发症为 DVT 和 PE。检查项目： D-D、 FIB AT、PC、PS、PLG、FDP PLT、TAT、TM、F1+2,临床困惑：术后静脉血栓的观察时机,
23、许多临床医生认为外科术后监测D-D意义并不大，因为术后D-D水平增高是必然的。往往认为手术损伤造成的D-D增高会掩盖患者自身病理性增高的趋势。问题是恰恰术后患者易发血栓。根据国内外的研究资料，大体上将腹部外科手术严重程度分为三型：腹壁手术（型）腹腔内手术（型）腹膜后或肝脏手术（型）患者D-D水平在术后增高，在术后第7天达到峰值。,型腹壁手术后，D-D峰值没有超过正常范围。型腹腔内手术后，D-D峰值可达到1500 g/L，约在最多25天后恢复至正常范围。型腹膜后或肝脏手术后，D-D峰值可达4000 g/L，约在最多38天内恢复至正常范围。D-D在达到峰值水平后通常是以指数方式清除（约每天减少6%
24、）。这种清除方式使D-二聚体有足够的预测能力以评估患者在手术后的血栓风险。连续监测其水平的变化，对于评估患者术后的静脉血栓风险具有重要价值。,不同手术后D-二聚体变化的特点,6、弥散性血管内凝血-DIC,病理：全身血管内微血栓形成结果：消耗大量凝血因子诱发全身抗凝系统亢进，引起继发性纤维蛋白溶解，减弱正常凝血系统功能纤溶所产生的纤维蛋白降解产物(FDP)的强抗凝作用最终导致严重的全身性出血、休克、组织脏器功能障碍。,易引发DIC的基础疾病,DIC被描述为低水平代偿和爆发两大类，但对于出现怀疑DIC的病人，这种区分并不明显。病人往往处于两个极端之间的进展期。早期诊断和适当处理对于DIC的预后有着
25、重要意义。,DIC实验室诊断标准,同时有下列3项以上异常 PLT100109/L或呈进行性下降 （肝病、白血病患者血小板小于50109/L） FIB1.5g/L或进行性下降 （白血病及其他恶性肿瘤低于1.8g/L，肝病低于1.0g/L） 3P试验阳性或D-二聚体升高（阳性）。 PT延长3s以上或呈动态变化 （肝病延长5s以上） APTT延长10s以上或缩短5s以上。, AT活性小于60%（不适用于肝病） 血浆因子:C活性小于50%（肝病必备） DIC相关分子标志物异常： A. 凝血激活分子标志物：F1+2，TAT，FPA，SFMC B. 纤溶分子标志物：FDP、D-D、PAP。 C. 血小板激
26、活分子标志物：-TG，PF4，TXB2，P-选择素。 D. TF升高，TFPI 水平下降。,7、炎症与血栓形成（全身炎症反应综合征-SIRS）,病原微生物侵入机体后，一方面激活免疫相关细胞产生促炎性介质并诱发TF的表达；另一方面激活接触凝血系统，包括补体、激肽和FXII。这种炎症-凝血交叉反应的结果是血栓形成的重要基础。炎症引起：TF表达、FIB合成增加、抗凝和 纤溶活性减低。检测项目： PT、APTT 、 FIB AT:A、PLG:A、D-D、TF、TFPI vWF、VIII:C可反映SIRS病情严重程度,8、其他疾病,糖尿病与血栓形成肾病与血栓形成妊娠与血栓形成烧伤与血栓形成,（三）在抗血
27、栓及溶血栓中的应用,表6 抗栓溶栓治疗的检测监测,三、常见问题与对策,标本采集与处理同一医院采用不同检测原理的仪器结果“参考范围”、“医学决定水平”真、假危急值,1、标本采集与处理,静脉血采集（压脉带时间）静脉淤滞组织因子血浆的质量脂血、溶血、凝块、黄疸采样的时间限制血样采集与送检时间采样管 枸橼酸浓度玻璃/塑料真空采血管混匀方式轻轻颠倒混匀，切勿振摇。标本处理和保存离心：3000r/10min血浆应室温/超低温，不宜4冰箱保存。,采血技能及标本采集顺序应按SOP文件要求采血时间应注明采血应尽可能在止血带使用1分钟内采血不在输液同侧手臂采血、不在留滞针采血避免标本溶血,止凝血标本采集的影响因素
28、及其控制,1. 使用直空采血系统，使采血量得以控制2. 注意进行质量控制，保证直空量能满足需要 保证正确的抗凝比例 婴儿等不易得到足够量标本时，可用特殊的 试管以保证抗凝剂的比例正确,血栓止血检测要求的抗凝剂与血液的比例多为1:9，但血细胞比积可引起血浆与抗凝剂比例间的变化。当Hct大于55%或小于25%时要调整抗凝剂的用量 体积（血样）= 体积（抗凝剂）9 （1.00-0.45)/(1.00-HCT),标本采集的影响因素及其控制,*注：我院2013.5.15.31 止凝血标本总数6055份,临床常见止凝血检测标本拒收（不合格）原因*,2、不同检测原理或检测系统间结果应用,不同检测原理血凝仪凝
29、固法结果无可比性（Clauss法FIB除外）原由检测原理不同试剂灵敏度不同参考范围不同,不同PT试剂的敏感性不同,ISI（国际敏感度指数）检测PT所用组织凝血活酶试剂的敏感度：基因重组人脑胎盘兔脑ISI值愈小表示试剂愈敏感。目前所用基因重组凝血活酶试剂的ISI多在0.91.1，故对检测口服抗凝剂的PT-INR敏感。INR=（PT/MNPT）ISIINR不用于其他PT延长的检测。,不同激活剂对APTT 的敏感性不同,注：LA狼疮抗凝物质,纤维蛋白原的Clauss法与PT衍生法差异,Clauss法能够用参比血浆或其衍生定标血浆来保证不同体系测定的准确性，而有些PT-FIB是根本不能定标的。FIB正
30、常水平时，PT-FIB测定结果略高于Clauss-FIB，两者之间呈曲线关系，且随着FIB浓度的增高，最大差距可达2g/L。在异常纤维蛋白原血症和溶栓时，Clauss法FIB已经减低，PT-FIB却仍然表现为正常。在一些重要血栓性疾病时，比如DIC、溶栓、口服抗凝药或高纤维蛋白原血症时，两种方法学的差异非常明显。WHO推荐使用Clauss法纤维蛋白原测定。,对策应采用单一检测系统，当连续对患者进行PT-INR、D-二聚体等水平监测时，应采用来自于同一检测系统的数据。根据各自检测系统确定“危急值”、“医学决定水平”和“参考范围”。采用厂商提供的参考范围一定要进行“参考区间”验证。,3、真、假危急
31、值,判别困难标本采集因素（采集时间、部位）是否为陈旧标本解决办法：仔细检查标本是否合格复查结果是否一致及时与临床沟通，了解病人一般状况及标本来源,病例4,患者男 ，73岁，因心绞痛，心悸入院心血管内科。入院检查凝血功能结果如下：PT：17.9s ，APTT：*，FIB：3.4g/L，TT：*。重新复检后APTT与TT仍然没有结果。查看当日质控结果在控，标本、试剂均无异常。电话与临床联系：病人一般情况尚可，无出血症状；询问标本采集得知该患者由于年龄较大，采血困难，故当班实习护士从静脉留置针采血。考虑可能为肝素污染所致。静脉重新采血送检，复查后TT、APTT结果均正常。,重视与临床的沟通： 如出现与临床诊断不相符的检验结果或危急值，复查后，应尽快将结果报告临床医生，与临床医生沟通排除由不合格标本所致的假“危急值”。 同时，也希望临床对实验室多提宝贵意见和建议，促进检验质量的提高， 共同提升为病人服务的质量。,检验结果的质量保证,Thank you for your attention !,
