1、原发性乳腺癌微小转移灶的检测及其意义,概述,乳腺癌为妇女最常见的恶性肿瘤(31%)， 死亡率仅次于肺癌而位居第二(1996)。全世界每年死于乳腺癌约120万。恶性肿瘤细胞转移是主要致死因素。,转移途径：,血行转移淋巴道转移局部浸润扩散临床出现远处转移病人，80%有骨及骨髓(BM)转移,目前临床应用检查方法难以查出微小转移癌灶。 常规病理检查（RPE）腋淋巴结阴性病例术后5年内远处转移发生率20%-30%。 准确检测LN或BM微转移有助于指导治疗和判断预后。,1.淋巴结微小转移灶的检测,1.1 微小转移灶的定义,Huvos (1971): 2mm直径,首先引入微转移概念。Fisher (1978
2、): 1.3 mmBlack (1980): 受累淋巴结的20%。,1.2 微小转移灶的检测方法及检出率,连续组织病理切片检查(Serial Sectioning)免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC)分子生物学检测,1.2.1连续组织病理切片检查,连续切片检查H&E染色比RPE增加微转移检出率7%-33%。根据切片间隔的不同，结果有很大差异。,Ludwig小组：将LN分成6个层次，每层取6张3m切片，提高检出率9%。Pickren: 间隔12m连续切片，97例中发现24例（22%）。Fisher:间隔5m，每4张取1张行H & E染色，78例中检出19例（24%
3、）Saphir & Amrommin:无间隔连续切片，每两张检测1张，30例中检出10例（33%）。,缺点,工作量繁重， 临床难以常规应用。,1.2.2 免疫组化染色,IHC应用不同MoAb检测乳腺癌LN,10%-23%阳性,提高检出率14%-17%。浸润性小叶癌检出率更高些。 连续切片再行IHC检测，隐性癌灶检出率会更高。McGuckin（1996）每100 m切取4张切片行IHC，208例查出53例（25%），其中67%转移灶最大直径0.5mm。,缺点,工作量大价格昂贵需要有经验的病理医师结合细胞形态才能确诊,1.2.3 分子生物学检测,RT-PCR技术检测肿瘤细胞中特定标志物mRNA水平
4、的表达,用于乳腺癌微转移灶的检测。 应用PCR方法最早报道于1988年对CML的监测，对实体瘤始于1991年对PB中MM细胞的检测。,RT-PCR检测敏感性,Wang(1994):107淋巴细胞中检测出3个MM细胞。Mattano(1992): 107正常细胞中检测出1个成纤维细胞瘤细胞。Noguchi(1994):106淋巴细胞中检测出1个MCF-7细胞。Schoenfeld(1997):106正常BM细胞中检测出1个乳腺癌细胞。,PCR比IHC方法敏感10-100倍，成为目前检测乳腺癌LNM最敏感的方法之一。 在RPE-的LN中发现9%-38%的微转移。,2.骨 髓微转移灶的检测,2.1
5、BM微转移灶的定义,临床现有检查手段，包括X-ray，骨扫描，ALP和羟脯氨酸（hydroxyproline）检测等均未能发现的转移灶即为微转移。此时处于骨基质尚未出现破坏的亚临床阶段。,2.2 BM微转移灶的检测方法及检出率,常规细胞学检查IHC检查分子生物学检测,2.2.1 常规细胞学检查,无BM转移临床症状的病例,常规细胞学检查阳性率甚低。虽然多点BM穿刺活检是检测BM转移瘤的有效方法，但对微小转移灶的检测价值仍很有限，其最高阳性率为3.6%(Mattano,1992),2.2.2IHC染色检测*敏感性,Osborne(1989): 2105 BM细胞检出1个MCF-7细胞,检出率达95
6、%,而常规细胞学检查全部阴性。Molino(1991):利用三种不同方法（形态学、IHC 和流式细胞）检测BM中的MCF-7细胞，结果：,* IHC：检测阳性浓度0.00025%(1:4105)* 行态学分析:检测阳性浓 度0.05% (1:2103)* 流式细胞分析:检测阳性浓度0.2%(1:5102)作者认为IHC染色,无论是敏感性还是特异性方面均优于其它两种方法。,*标本采集,骨穿多于手术当日麻醉后进行，可选胸骨、双侧髂前上棘或双侧髂后上棘等单或多部位穿刺。抽取5-10ml骨髓液，经Ficoll-Hypoque液离心分层，吸取L-c层洗涤后涂片，针对特异性抗原行IHC检查。,*检出率,I
7、HC技术用于乳腺癌BM微转移的检出率为16-48%。Singhal(1994):对116例肿瘤切检后病人行BM穿刺，微转移阳性率为32%；260例未曾切检的病人阳性率为39%，二者无统计学差异。Diel(1992):证实手术前和手术后微转移阳性率亦无显著性差异。,*不足之处,IHC技术检测乳腺癌BM微转移，虽然诊断阳性率大大提高，但也有其局限性。某些正常BM细胞，如淋巴类上皮细胞等可能会出现不同程度的交叉反应，以及肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性，均可能影响对转移细胞的正确评判。,2.2.3 RT-PCR方法检测,Schoenfeld(1996):对IHC和RT-PCR两种方法进行比较,IHC检
8、出1/105 MCF-7细胞,而RT-PCR为1/ 106。4例乳腺原位癌有1例（导管原位癌）IHC和RT-PCR均发现BM及血液中存在微转移，经仔细检查切除之病灶结果发现有微浸润（Micro-invasion)存在。此例进一步证实乳腺癌具有早期播散特性。,Kruger等（1996）报道利用RT-PCR技术，骨髓微转移的检出率为41.7%。 Eaton等（1997） 报道，先用免疫磁珠法分离癌细胞，再结合RT-PCR（Immunobead RT-PCR），检测乳腺癌外周血中的瘤细胞，结果能由106白细胞中检出1个瘤细胞，其敏感性与单用RT-PCR相仿。,* RT-PCR特异性：,联合south
9、ern杂交技术能够进一步提高微转移的检出率。但SCH（1994）报道利用巢式（nested）PCR进行两步扩增，结果在正常淋巴结中亦出现CK-19表达，说明某些正常非上皮细胞亦可能有内源性CK-19 mRNA模板的极低水平表达，故一味追求敏感性会导致特异性的降低，而以40轮PCR扩增联合southern杂交为宜。,3.联合检测淋巴结和骨髓的微转移,淋巴结和骨髓联合检测可更加全面地了解肿瘤的微转移情况，为此，我院于1998年3月11月，采用RT-PCR并Southern杂交方法，以CK-19为标志物，对54例可手术原发性乳腺癌病人的BM标本进行了微转移的检测,其中联合检测了35例病人的LN和BM
10、。,4.用于检测转移肿瘤细胞的生物学标志物,欲检测转移肿瘤细胞，需利用能区别于转移部位组织而肿瘤细胞特异表达的生物学标志物。如MM中酪胺酸酶（Tyrosinase）基因的表达，前列腺组织中PSA的表达等。遗憾的是截止目前尚未发现乳腺组织特异性标志物，尽管Maspin基因对乳腺组织较为“特异”，但其在乳腺外转移部位仅有20%35%的表达。,* CK-19：研究最多。实际上，细胞角蛋白并非乳腺癌特异表达蛋白，其为主要表达于上皮类细胞的一组蛋白质（CK-1CK-20），以CK-19在正常上皮细胞和上皮性癌细胞的表达最为特异。 Brown等（1995）在非上皮组织中分别检测了CK-8、CK-18、CK
11、-19的mRNA，结果显示，在广泛的不同种类非上皮组织中均有CK-8和CK-18的表达，而CK-19表达阴性。,几乎所有正常上皮细胞、上皮性肿瘤均有CK-19表达,，而非上皮来源的细胞通常不表达。 Bartek等于1985年即用CK-19 MoAb检测其在乳腺组织和肿瘤中的表达。以后有多篇报道采用IHC或RT-PCR等不同手段对不同组织进行了CK-19的检测。, Kwaspen（1997）实验证实CK-19单抗RCK108与其它角蛋白抗体相比具有高度敏感和分布广泛的特性，可用于常规处理石蜡切片上皮性肿瘤的检测。, EGP-2：是上皮细胞的又一标志基因,几乎所有上皮来源的肿瘤均表达EGP-2,而
12、非上皮来源的肿瘤,如淋巴瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤和MM等则无表达。已有数篇应用单抗MoC-31检测SCLC骨髓、外周血及胸水中的癌细胞。De Graaf（1997）等研究显示四种乳癌细胞系均有EGP-2基因的高表达,故EGP-2基因亦有望用于乳腺癌微转移灶的检测,多形表皮粘蛋白MUC1：是又一检测乳腺癌微转移的生物学标志物，其为一种高分子糖蛋白，主要存在于某些上皮性组织和器官中，如乳腺、胰腺、卵巢和结肠等，特别是在所有正常及癌变组织中均表达，而在间叶组织中不表达。但有报道检测CK-19基因表达比MUC1敏感10倍。, c-myc和PIP：c-myc 为一种与肿瘤发生有关的原癌基因（proto-
13、oncogene），与肿瘤分化及DFS、OS密切相关。PIP（催乳激素诱导蛋白），为一种与乳腺癌相关的蛋白质。 其它：上皮膜抗原（EMA）、HCG、CEA 、EGFR 、BRCA1 、BRCA2等。,5.微小转移灶检出的临床意义,5.1淋巴结,早期研究认为，微转移对患者的生存无任何不利影响,这些小的肿瘤细胞巢无临床意义,以至于普遍认为寻找这些微小转移灶徒劳无益。随着研究的不断深入,原有的观点难以立足。,Rosen：T1病人,转移灶直径100例)均显示隐性转移灶能够影响DFS或OS 。其中Ludwig小组的报道为第一篇大宗前瞻性研究，发现有微转移的病人五年FDS下降16%，OS下降9%。迄今为止
14、，Hainsworth等于1993年报道应用IHC方法检测LN微小转移灶的病例数最多，共检测了343例RPE-者，结果阳性率占12%，其五年FDS下降28%。而另一组报道十年OS下降25%，转移灶仅为0.2mm亦对生存期产生影响。,有生存差异的报道均为大宗病例(147921),且随访期至少6年。Rosen等人研究发现,淋巴结有微转移的病人与淋巴结检测阴性病人生存率的比较,随访6年虽无差异,但随访10年,有转移的病人其生存率明显降低,而与具有明显转移灶病人的结果相一致,提示欲判定微小转移灶对病人预后的影响至少需要观察10年以上。,5.2 骨髓,Sharp等将乳腺癌病人骨髓中分离出来的癌细胞于体外
15、培养，结果其可形成克隆，接种裸鼠亦可形成肿瘤。提示临床检测乳腺癌病人骨髓微转移对预测复发、转移可能具有重要意义。,Cote等检测49例I、II期乳腺癌病人，骨髓微转移检出率为37%，其中I期为23%，II期为38%，ALN-者为27%，ALN+者为41%。平均随访29个月，共有12人（24%）出现复发，BM转移最多（6例），其次为肝脏（3例）。BM微转移阳性者复发率为33%，而阴性者仅为3%。若与LN转移情况相结合，均阳性者,两年复发率为42%；均阴性者无复发，差别非常显著。,Mansi等检测350例可手术乳腺癌病人，BM微转移阳性率25%，且与肿瘤大小、肿瘤周围血管受侵及ALN转移情况有明显
16、相关性，经6年随访，微转移阳性者，复发率为48%，而阴性者为25%。再次证实BM微转移阳性的乳腺癌病人，远处转移率高，总生存期缩短。,Molino等报道，对109例I、II期乳险腺癌病人于手术前或手术后24周行BM穿刺检测微转移，结果阳性率31.1%，BM微转移与肿瘤大小、ALN转移、月经状态、和ER情况等因素比较，未发现明显相关性，且对病人无病生存期（DFS）和总生存期（OS）的影响亦无统计学意义。但作者亦认为这种结果可能与随访时间短（3年）有关。,Results of bone marrow biopsy in 128 women with operable breast cancer s
17、tage I-II(Landys, etal. Breast Cancer Res & Treat),骨髓及血液中少量肿瘤细胞的检测，对近年来开展的高危乳腺癌自体骨髓移植（ABMT）或外周血干细胞移植（PBSCT）亦有实用价值，如果这些治疗用细胞中混有肿瘤细胞，无疑将影响其治疗效果。,*PCR阳性结果的意义,时间短，无定论。亦有人认为，LN作为正常和肿瘤性上皮细胞的清理部位，阳性信号可能仅代表免疫系统清除和过滤循环中肿瘤细胞的一种功能反应。这样可能导致PCR反应特异性的降低，如何区别这种淋巴结中非转移PCR阳性信号有待进一步探索。,小 结,近十余年来，随着检测手段的进步，LN或BM微转移的检出
18、率明显提高。尽管各家报道不尽一致，但多数认为其与乳腺癌的预后、复发、转移有明显的相关性，可作为一种有效的预后指标，结合其它因素，确定出具有早期复发、转移危险的高危人群，在其发展为临床转移之前，给予积极辅助治疗，从而渴望降低乳腺癌病人的复发、转移率，提高生存率，延长生存期。,同时，又能使部分低危险（微转移阴性）病人免于不必要的化疗造成的痛苦。骨髓微转移检测，尚可作为判定辅助治疗疗效的指标，亦可作为术后病人随访过程中预测复发、转移的依据。,诚然，并非骨髓微转移的存在预示将来定会出现复发、转移，尤其是检测中发现的极少数肿瘤细胞（如IHC发现的单个肿瘤细胞），因为转移形成仍受多种因素的影响，但至少表明其具有形成显性转移的倾向。随着积累病例的增多和观察时间的延长，这些微量肿瘤细胞在骨髓中的临床意义将日趋明了。,感 谢 各 位,
