1、四川省食品安全地方标准水果蔬菜中氯吡脲残留量的测定 液相色谱-质谱/ 质谱法(项目编号: 省卫生厅 2012-001)标准编制说明（征求意见稿）四川出入境检验检疫局技术中心二 O 一三年十二月第 2 页 共 33 页目 录 一 任务来源 3二 制标依据 3三 标准化过程 3四 研究背景 41 氯吡脲理化特性与应用 42 标准制定的意义 5五 主要试验技术论证 61 提取溶剂的选择与优化 62 样品净化方法优化 73 仪器条件优化 84 不同基质多反应监测色谱图 11六 方法技术指标 181 线性范围和测定低限 182 回收率与精密度 193 不同实验室间验证 20七 方法应用 21八 参考文献
2、 22第 3 页 共 33 页水果蔬菜中氯吡脲残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法标准编制说明一、 任务来源本标准的制定工作是由 2012 年四川省卫生厅组织并批准。由中华人民共和国四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心根据膨大剂氯吡脲在国内外果蔬中广泛使用的情况承担制标工作。名称为水果蔬菜中膨大剂-氯吡脲残留量的测定方法 高效液相色谱-质谱/质谱法 。二、 制标依据本标准的编制遵循 GB/T 1.1-2009 标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则 、GB/T 20001.4-2001标准编写规则 第 4 部分：化学分析方法 、SN/T 0001-1995 出品商品中农药、兽药残留
3、量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定和 GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范 食品理化检测的要求进行编写制订的。三、 标准化过程本标准起草人通过查阅相关国内外标准和文献资料，结合本实验室的条件和本方法的技术特点，从 2006 年下半年开始，由于出口猕猴桃要求检测其中的果实膨大剂-氯吡脲残留量，因此着手在本实验室建立猕猴桃中氯吡脲的检测方法，并于 2007 年在核心期刊色谱杂志上发表了分散固相萃取-高效液相色谱法快速检测猕猴桃中的氯吡脲 （色谱，2007，25（3） ） ，获得了国家质检总局优秀论文“鼓励奖”和四川检疫局论文一等奖。原方法参考了美国农业部快速农残检测方法，采用液相
4、色谱-紫外检测猕猴桃中氯吡脲。后申请为四川省地方标准后，对方法进行了第 4 页 共 33 页改进，参考了美国 AOAC Official method 2007.01、英国标准方法 BS EN 15662：2008 和日本厚生劳动省推荐的测定方法食安発（第 12270001号）中氯吡脲残留量检测方法。结合本实验室多年检测经验并进行了修改，提出以乙腈提取试样中的待测物,分散固相萃取净化,液相色谱-三重四极杆串联质谱检测的方法，大大提高了样品中氯吡脲检出灵敏度，LC-MS/MS的使用有效的消除了杂质色谱峰对待测物质色谱峰的干扰。同时引入美国农业部 QuEChERS 样品前处理方法，使得样品前处理时
5、间大大缩短，方法更能适应检验检疫快速、准确的特点。通过本实验室前期应用，以及大量的室内回收率、精密度及应用范围等一系列实验研究，建立了一个高选择性、高灵敏度测定西瓜，葡萄，猕猴桃，水蜜桃，苦瓜，黄瓜，茄子，番茄，芹菜等新鲜果蔬中氯吡脲残留量的测定方法液相色谱-三重四极杆串联质谱。本标准经成都市质检院、四川省农科院分析测试中心、重庆出入境检验检疫局、河南出入境检验检疫局、河北出入境检验检疫局 共五个实验室验证，方法测定低限、添加回收率和精密度均符合要求。制定工作时间进度安排见表 1。表 1 本标准制定工作时间进度安排时间 工作内容 完成情况2010.42010.8 查阅并整理相关文献资料，确定标
6、准的技术路线。 完成2010.92013.6进行方法的前处理实验研究，优化前处理条件和检测条件；进行方法室内和室间验证，起草标准征求意见稿。完成2012.112013.09 征求意见，汇总意见，形成送审稿。 完成2013.10 标准送审四、 研究背景第 5 页 共 33 页1、 氯吡脲的理化特性与应用氯吡脲(Forechlorfenuron)是一种高效植物生长调节剂，商品名吡效隆，又称为调吡脲、吡效隆醇、施特优，英文别名Fulmet, CPPU, KT-30,4PU-30。由于其细胞分裂活性高，生长促进作用效果优异等特性，被作为一种新型高效植物生长调节剂而广泛应用于农业生产。美国Sandoz公
7、司最早确证其植物生长调节功能。日本协和发酵工业株式会社开发并申请专利。1987年在国内由四川大学化学系成功合成，1988-1993年在全国几十个农业科研教学单位进行了试点试验。目前已在欧盟、美国、日本等登记使用，我国于1992年获准临时生产。其化学名称N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲，结构式如下：它属于苯脲类细胞分裂素，其生理作用主要有：促进细胞分裂，扩大细胞体积；促进器官形成和蛋白质的合成；增强抗逆性、延缓衰老；打破顶芽优势；诱导休眠芽的生长；促进坐果、果实膨大；提高光合作用效率；诱导单性结实。其生理作用与一般嘌呤类细胞分裂素类似，但作用浓度更低，活性更高。浓度高时还可以作除草剂。膨大
8、剂（氯吡脲）在所有项目(急性毒、致癌物、内分泌扰乱、生殖和神经毒性)中的情况目前都是Not Listed(未列入)或Not Likely(不太可能)。美国、欧盟都允许使用。LD50大白鼠急性经口4918mg/kg，兔急性经皮2000mg/kg，鹌鹑2250mg/kg。该产品至诞生来由于其细胞分裂活性高，生长促进作用效果优异等特性，被作为一种新型高效植物生长调节剂而广第 6 页 共 33 页泛应用于农业生产，被广泛应用于西瓜，葡萄，甜瓜，猕猴桃，苦瓜，黄瓜，苹果等多种作物上。孙竹波等用0.1氯吡脲涂抹西瓜雌花果柄可显著提高西瓜座果率，提高产量，同时增加含糖量和维生素C含量。唐湘如等发现喷施氯吡脲
9、和多效唑，能提高水稻籽粒的可溶性淀粉合成酶和淀粉分支酶活性，同时有利于改良米质。孙瑞红等用3.3-14.3 mgkg氯吡脲处理葡萄，增产效果达到20.2。O.1氯吡脲涂抹甜瓜幼果可显著提高座瓜率，提高甜瓜产量，同时明显增加甜瓜含糖率。2、 标准制定的意义现代农业生产受益于植物生长调节剂（植物生长激素）是无可厚非的，但也有专家对此表示担忧,他们 担心这些激素的应用虽然可以改善水果外观、提高其产量，但其内在质量却明显下降 2;更重要的是摄入过量激素可能对人体带来潜在健康危害。2011 年 5 月，有媒体报道了镇江丹阳一户瓜农种植的几十亩西瓜莫名“爆裂”的消息。后经证实 西瓜的“爆裂”是因为过量使用
10、了果实“膨大剂”的结果。此事件的直接后果是导致国内市场大量西瓜滞销，瓜农损失巨大。 同时，西瓜开裂引发社会的广泛关注，人们担心，植物生长激素存在滥用风险，使用了膨大剂等植物生长激素后，用激素催熟的瓜果或果实中残留的植物生长激素会不会对人体有害。欧盟、日本等国家对氯吡脲的残留量作出了限定，欧盟要求其成员国第 7 页 共 33 页常规监测环境中的氯吡脲，防止其对环境可能产生的危害。日本“肯定列表”对果蔬中氯吡脲的限定，规定在香瓜、葡萄、梨、猕猴桃等水果蔬菜中的残留限量值暂定为 0.1 ppm；以色列规定梨、猕猴桃、葡萄中氯吡脲的残留限量为 0.01 ppm；韩国规定，瓜类中氯吡脲的残留限量值为 0
11、.05 ppm。我国在 2009 年农业部 NY 1500.75.1-2009 中规定了西瓜为 0.1 mg/kg,黄瓜为 0.1 mg/kg,猕猴桃为 0.05 mg/kg,葡萄为 0.05 mg/kg。查阅我国有关植物生长调节剂的规定发现，目前还没有相关的检测国家标准，相关产品说明多借鉴国外标准。目前，随着仪器分析的不断发展，液质联用分析法在农兽残分析检测中占据了重要的地位，特别是三重四极杆质谱的出现，相比传统的高效液相色谱法，使液相色谱-三重四极杆串联质谱能快速的定性，也能准确的定量。多年来，液相色谱法广泛地用于各种药物的检测，但方法的前处理较复杂，检测器的灵敏度也不能达到目前各国限量要
12、求。且每个样品通常需要过一次甚至于几次固相萃取小柱，不能适应于大量样品的快速检测。同时，国外最低限量为 0.01mg/kg，这对液相色谱-紫外检测的传统手段来说，干扰大，对低残留已无法达到检测要求。本标准主要参考国内外文献，并进行了部分改进性实验，建立了用乙腈提取试样中的氯吡脲，键合硅固相吸附剂净化，高效液相色谱-串联质谱法测定的方法。该方法简单、经剂、快速，同时净化效果好，回收率稳定，易于掌握。本方法氯吡脲在新鲜水果蔬菜中的检出限为 5g/kg。四川省是猕猴桃和巨峰葡萄生产和出口大省。全省有多个猕猴桃和巨峰葡萄生产基地，根据我中心实验室多年的统计，在我省出口的猕猴桃和巨峰葡萄中常有氯吡脲检出
13、。因此，为保护消费者健康和此类农产品的正第 8 页 共 33 页常出口贸易，有必要建立该药物的地方标准。同时也为应对国外贸易壁垒作技术储备。五、 主要试验技术论证1. 提取剂的选择与优化1.1提取剂的选择 本标准参考美国农业部快速多农残检测方法，因氯吡脲易溶于极性有机溶剂，如丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯等，故乙腈、丙酮和二氯甲烷等都是良好的提取剂，但二氯甲烷对人毒性较大，易造成环境污染；丙酮是农残经典提取溶剂，但同时又能将基质中的油脂和色素提取出来，且与水互溶后加入盐不能与水分离，导致提取液中大量水无法去除。而乙酸乙酯对极性物质的提取效率较差,通常需要在提取过程中加入大量的无水硫酸钠以提高极
14、性物质的提取效率,而且乙酸乙酯提取体系中会共提取许多大分子的脂质和蜡质的物质,因此经丙酮和乙酸乙酯提取的样品一般都需要过固相萃取小柱或 GPC 净化处理。 乙腈是一种良好的提取剂，在现代的农兽残检测中常用来作为提取剂，与其性质有关。乙腈可以与水任一比混溶，可更有效的与样品组织细胞中待测物接触，当加入盐后又能迅速与水分层，且乙腈本身对样品中的糖、脂肪和蛋白质的溶解性较小，对蛋白有沉淀作用。1.2 酸碱度的影响分别用含有 0.1%冰乙酸的乙腈，0.01%氢氧化钠的乙腈和乙腈作为提取剂的提取效率试验，发现三者之间并无明显差别。但从文献资料中显示，保证提取液为酸性，可有效防止待测物质的损失，故参考美国
15、农业部方法第 9 页 共 33 页选择 0.1%冰乙酸的乙腈作为提取剂。1.3 提取方式及温度的选择实验比较了超声提取和机械振荡提取，其它条件一致，发现超声提取的回收率要稍微高一些。可能的原因是超声提取中超声波可以破坏动植物细胞的细胞壁，可以使乙腈能更好的渗透进入细胞内部进行萃取。而机械振荡无法破坏植物细胞壁。因此本方法选择用超声提取的方式。超声提取的水浴温度对回收率也有影响，如果温度过低，不利于溶剂渗透到样品内部提取。因此要保持适当的提取温度，本方法选择超声提取温度为 30 。2净化方法的优化2.1 净化方法选择日本厚生劳动省方法操作较为繁琐，样品需要液液萃取两次，过两支固相萃取小柱，提取液
16、及洗脱液用量过大，导致方法的可操作性降低，试剂浪费，对环境造成了危害。故未采用日本方法。本标准采用乙腈作提取溶液，不进行净化处理，对基质成分简单的试样可行，如西瓜，猕猴桃，等部分水果蔬菜样品。但对深色试样，杂质有一定干扰。本实验尝试了对较复杂基质样品的进一步前处理研究。QuEChERS 是近年来国际上兴起的快速高效多残留检测前处理技术。2003年，美国农业部专家 Steven 博士提出了 QuEChERS ( quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)快速多农残检测方法 ,它是一种快速、简便、价格低廉、适用面广的样品前处理方法。在该方法出现后
17、的几年间，欧盟每年已有超过 100 个实验室参加此方法的验证实验，证明这种方法在实验室间第 10 页 共 33 页取得成功。目前，该方法已被很多国家列为农药残留分析标准分析方法。如 AOAC Official method 2007（01） 、英国标准方法 BS EN 155662: 2008等等，本实验室在总结多年的应用基础上对该方法进行了一些改进。C18 固相吸附剂是一种非极性吸附剂，可以吸附高分子量的非极性干扰物质，特别适用于低脂类水果蔬菜的净化，对样品中的蛋白、脂质物质、部分维生素、色素和甾醇等杂质也有一定的吸附作用。PSA 是一类性质与氨基柱固相萃取小柱填料相同性质的固相吸附剂，不同
18、的是 PSA 有两个氨基，它们的主要作用力是极性和阴离子交换作用。它常用来消除各种有机酸、部分色素以及蛋白质、糖类和脂肪酸。石墨化碳（GCB ）主要是用来去除类甾体、叶绿素等色素。有参考文献考察了 NH2 类填料和 GCB 的实际效果,发现 NH2 可去除 90%以上的脂肪酸和 50%左右的色素;GCB 可去除 90%以上的色素，但对脂肪酸的净化能力仅只有 10%左右。我们考察了石墨化碳（ GCB）对氯吡脲的吸附情况时，发现石墨化碳（GCB）对氯吡脲的有较强的吸附作用，故在实验中放弃了加入石墨化碳（GCB）来作净化的手段。2.2 吸附剂用量的影响试验考查了 C18 和 PSA 吸附剂对氯吡脲的吸留作用。吸取浓度为10g/L 的氯吡脲标准液分别用两种固相吸附剂分别进行净化。测定结果见表 2。表 2 C18 和 PSA 吸附剂对氯吡脲的吸附试验吸附剂吸附剂用量（mg）回收率(%)C18 20 101
