1、代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,Diagram,一、 L-苯丙氨酸的简介,二、 L-苯丙氨酸的生产方法,三、 L-苯丙氨酸的体内代谢途径,四、 L-苯丙氨酸的代谢调控,五、展望,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,一、 L-苯丙氨酸的简介,L-苯丙氨酸是芳香族氨基酸，是人体八大必需氨基酸之一。常温下是白色结晶或结晶性粉末固体，有L-型、D-型两种消旋体和DL-型外消旋体，具有生物活性的是L-型光学异构体，即L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine，L-Phe)。,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,3-脱
2、氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸,预苯酸,苯丙酮酸,分支酸,分支酸变位酶（限速反应）,预苯酸脱水酶（限速反应）,DAHP合成酶（限速反应）,三、 L-苯丙氨酸的体内代谢途径,E.coli是最常应用的菌种。图为以葡萄糖作为E.coli生长的碳源时的由DAHP生产L-Phe的详细路径图,1、增强中心代谢途径代谢流：（1）加强基因aroF的超量表达： DAHP的合成酶DS控制的反应是该途径中的第一个限速反应。DS是基因aroF、aroG、aroH控制的同工酶。,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,四、 L-苯丙氨酸代谢调控,（2）增加PEP 的合成 磷酸烯醇丙酮酸合成酶(PpsA)和磷酸烯醇丙酮酸
3、羧激酶(PckA)是糖代谢中心途径中生成磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的2个关键酶,在大肠杆菌中分别由ppsA和pckA基因编码.扩增ppsA,pckA基因，使这两个基因单独表达或串联表达，都能提高PEP的合成量，进而提高DAHP的合成量。,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,（3）改造PTS系统 野生型大肠杆菌体内PEP的消耗主要是磷酰基转移系统(PTS系统)，丙酮酸激酶(pykApykF编码)，PEP羧化酶(ppc基因编码)。此通过改造PTS系统减少PEP的消耗可提高L-Phe产量。,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,2、分支途径代谢调控：,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,在pheA
4、、tyrB基因克隆、串联克隆和表达完成的基础上,将aroG基因和pheA、tyrB基因以aroG-pheA-tyrB的顺序三基因串联到表达载体进行表达,提高酶活，提高L-Phe的产量。,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,基因克隆及基因克隆流程图：,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,表：携带不同表达质粒的大肠杆菌的粗抽提物的酶比活增减倍数,苯丙氨酸生物合成途径关键基因的串联表达：,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,优化关键酶基因 pheA、aroF、 ppsA、 tktA的协同表达,pheA:编码分支酸变位酶和预苯酸合成酶。简写成AaroF:编码DHAP合成酶。简写成FppsA：编码
5、PEP合成酶。简写成PtktA：编码转酮酶。简写成T.,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,pZE21：含有卡那霉素抗性基因的质粒；pZE12：含有氨苄林抗性基因的质粒；pZA31：含有氯霉素抗性基因的质粒 CA-AFPT为pZA31-RBS-ppsA-tktA_pZE12-AF的 简 写 CK-AFPT为 pZA31-RBS-ppsA-tktA_pZE21-AF的简写。,3、解除反馈抑制,aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶( AroG)是苯丙氨酸合成途径中的关键酶之一,受到苯丙氨酸的反馈抑制.通过使用苯丙氨酸类似物对氟苯丙氨酸(pFP)的筛选, 获得初步解除对苯丙
6、氨酸的反馈抑制突变株。通过DNAshuffiing技术有效的对ar0G基因进行改组,积累并引入有益突变,实现分子的定向进化,解除AroG的苯丙氨酸反馈抑制。,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶是Phe合成途径中的关键酶之一,受到苯丙氨酸的反馈抑制.为得到解除苯丙氨酸反馈抑制的突变AroG,分别以Escherichia coli (E.coli)野生型和突变型aroG基因和Salmonella typhimnrium(S.typhimnrium)野生型aroG基因为亲本,通过DNA suffli
7、ng技术对aroG进行改组,获得的改组分子与载体pET30a连接得到改组文库,转化到E.coliBL21(DE3)中,在含有Phe类似物对氟苯丙氨酸(p-FP)的培养基上筛选转化子,获得4个解除Phe反馈抑制的克隆.,五、展望,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,1、苯丙氨酸生物工程菌构建的成功是令人鼓舞的。代谢工程在物种改良方面已经展现出了非常强的生命力. 代谢工程在苯丙氨酸菌种选育研究中的应用，大幅提升了微生物发酵法的苯丙氨酸生产效率，但目前仍存在一定程度的局限性。2、DNA 重组技术飞跃式发展为微生物合成苯丙氨酸的代谢工程研究带来了前所未有的机遇。,3、葡萄糖一直是合成Phe的主要碳源
8、，但随着研究的深入，显现出很多弊端，如产生葡萄糖效应和大量副产物乙酸，都会使细菌生长受到抑制；而甘油价格低廉，容易获得，以甘油为碳源进行微生物的生产将会成为一种趋势。 总之，虽然目前代谢工程技术在苯丙氨酸菌种选育中的应用仍然存在许多不足之处，但代谢工程确实为发酵法高产苯丙氨酸提供了巨大的推动力，随着研究的深入，必然会为整个苯丙氨酸产业的发展做出更大的贡献。,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,参考文献,1、黄坤央.苯丙氨酸基因工程菌的构建及其发酵条件研究D .郑州大学.2012.62、郝瑞昕； 边英男； 李晓萍等.通过DNA shuffling技术获得初步解除苯丙氨酸反馈抑制的3-脱氧-D-
9、阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(AroG)突变株J .复旦学报.2010.49(3):287-2923、赵越，芦佳，黄坤央，徐琪寿，郭军，黄英武.苯丙氨酸生物合成途径关键基因的串联表达J .生物技术通讯.2012.23：488-492.4、Gerigk M，Bujnicki R，Ganpo-Nkwenkwa E，et alProcess control for enhanced L-Phenylalanine production using different recombinant Escherichia coil strainsjBiotechnol Bioeng，2002，80(7)：746-7545、刘云；许琪寿.代谢工程及其在产苯丙氨酸基因工程菌构建中的应用J .生物工程进展.2000.20.(3):35-38.,代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用,THANK YOU,
