1、荧光 一、 定义 荧光 （ fluorescence ） 又作“ 萤光 ”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种 波长 的 入射光 （ 通常是紫外线或 X 射线 ）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并 发出比 入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段） ；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 二、 原理 光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到
2、基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。 荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下，发光波长比吸收波长较长， 能量 更低。但是，当吸收强度较大时，可能发生 双光子吸收 现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。当辐射波长与吸收波长相等时，既是共振荧光。 荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。荧光量子产率 Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。 荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关 。 三、 荧光蛋白 1、 绿色荧光蛋白（ green fluores
3、cent protein,GFP） 在光谱的绿光区（ 500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的 Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与 EGFP相比，也没有明显的优点。或许目前活细胞成像最好的选择是 GFP衍生的 Emerald（祖母绿），它与 EGFP的特性相似。 Emerald包含 F64L和 S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、 37时的突变率以及亮度。虽然 Emerald比 EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。 下面主要介绍 GFP及其衍生型荧 光蛋
4、白： （ 1）来源 绿色荧光蛋白最早由 美籍日裔科学家下村修 于 1962年在水母中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（ Ca2+）相互作用。在 水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为 2730kDa，而编码 GFP的基因序列也很短，为 2.6kb。 （ 2）性质 GFP由 238个氨基酸残基组成。 GFP序列中的 65-67位残基（ Ser65-Tyr66-Gly67）可自发形成荧光发色基团 对羟基苯咪唑啉酮 GFP的 激发光谱在 400nm附近有一个主激发峰，在 470nm附近有一
5、个次激发峰。发射光谱在 505nm附近有一尖锐的主发射峰，在 540nm附近有一肩峰 GFP的化学性质相当稳定，无光漂白现象（ Photobleaching），用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。 （ 3）野生型 野生型 GFP（ wild type GFP, wtGFP）从一开始就引起了人们极大的兴趣，而且被用作新型的简单报告基因及体内标记 ， 但 GFP 在异源生物体中的表达并非那么简单。例如，研 究人员很早就发现需要在较高的温度下孵育才能在细胞或生物体中表达 GFP，并且 wtGFP 在 37的热稳定性差。这些都阻碍了
6、它在转基因中的应用。这些难题促使人们进一步筛选分离 wtGFP 的变体。现在，人们已经找到了荧光强度更强且更耐热的变体。这些变体多数为经突变的脱辅基蛋白，它们可防止高温导致的错误折叠。近年来出现的新型 wtGFP 基因突变体的激发和发射谱发生了改变，热稳定性和荧光强度得到了提高， GFP 报告基因在小鼠中的应用就是以这些变体作为基础的。 （ 4）增强型绿色荧光蛋白（ EGFP） 现在，应用最为广泛的是红移变 体增强型 GFP（ EGFP）。诸如 EGFP 这些红移变体的最大激发峰发生红向移动，大约为 490nm，这一波长也恰好是多数分光设备、流式细胞仪及共聚焦显微镜的常用波长。 EGFP 有两
7、个氨基酸突变， 当被蓝光激发时 ， 它发出的荧光要比 wtGFP 亮 30-40 倍。 wtGFP 和包括 EGFP 在内的多数变体半衰期长，所以不适合精确追踪表达的减少或损耗。 （ 5）不稳定增强型绿色荧光蛋白（ dEGFP） 为克服这一问题，人们在 1998 年构建了 不稳定增强型绿色荧光蛋白（ dEGFP） 。原理就是将 EGFP 的 cDNA 融合到小鼠鸟氨酸脱羧酶（ Ornithine decarboxylase, ODC）基因的 C-末端。 ODC 含有一个 PEST 序列，这个序列可促进该蛋白在细胞内的降解。虽然，目前这些不稳定变体还没有在小鼠中应用，但这些变体有利于实时追踪基因
8、表达动力学的研究。 （ 6）增强型黄色荧光蛋白（ EYFP） 另一种红移变体是增强型黄色荧光蛋白（ EYFP），该变体有四个氨基酸突变。在527nm时， EYFP的发射光从绿色变为黄绿色。 EYFP荧光的亮度水平与 EGFP相当。EYFP 抗酸性差、对卤化物敏感，使它的应用受到限制 。 在 EYFP 基础上改进的突变体 mCitrine21和 mVenus22是目前应用最多的黄色荧光蛋白。 （ 7）增强型蓝色荧光蛋白（ EBFP） 在光谱的另一端是蓝色 /蓝绿色变体，包括增强型蓝色荧光蛋白（ EBFP）变体。它有四个氨基酸突变，激发波长和发射波长分别为 380nm 和 440nm。由于这些突变
9、改进了蛋白折叠和发色团形成的效率，所以也增强了所发出荧光的亮度（与蓝色变体相比）和蛋白溶解性。但唯一的不足之处，就是 EBFP 产生的荧光信号 大致与 wtGFP 相当。 蓝色荧光蛋白发光较弱，抗光漂白和抗酸性较差，用于细胞成像时背景信号高。 针对 EBFP 开 发 的 3 个更亮的突变体： Azurite (亮度是 EBFP的 1.6 倍 )、 EBFP2(亮度是 EBFP 的 2 倍， mTagBFP(亮度是 EBFP 的 3.7 倍 )。最亮的蓝色荧光蛋白 。 mTagBFP 是由红色荧光蛋白 TagRFP 突变而来 。 （ 8）增强型蓝绿色（青色）荧光蛋白 （ ECFP） 增强型蓝绿色
10、荧光蛋白（ ECFP）是发出蓝色 /蓝绿色荧光的另一种变体，产生的荧光信号要比 wtGFP 强。 ECFP 有六个氨基酸突变（表 3），发射光谱从绿色迁移到蓝绿色，最大激波长在 433nm（主峰）和 453nm（次峰），最大发射在 475nm，于 510nm 处有一肩峰（图 11）。 ECFP 另一特点是比其它蓝色 /蓝绿色变体光漂白效应弱，而且比 EBFP 的亮度强。值得一提的是， wtGFP 的主要绿色荧光变体，如 EGFP 等已经在 ES 细胞、基因打靶和转基因小鼠研究中得到充分应用。 2、 蓝色及蓝绿色荧光蛋白 虽然 EBFP 是 Aequorea GFP 来源的最早的光谱变体之一，但
11、其亮度低、光稳定性差，使其很久以来没有引起多数研究者的注意。最近，有三个研究小组报道指出，改进的蓝色 Aequorea 荧光蛋白变体与 EBFP 相比，亮度和光敏感性有明显增强。这些新的变体被命名为 Azurite（石青或蓝铜矿）、强力增强型蓝色荧光蛋白 2（ strongly enhanced blue fluorescent protein 2, SBFP2）及 EBFP2，它们第一次使得活细胞在蓝色光谱区域成功地长时间成像成为可能。即使这三种荧光蛋白在高浓度的微环境中表现出很弱的二聚体特性，但是它们能够在与亚细胞定位的靶蛋白融合中有效地发挥作用，并且它们能够很容易地通过滤光片设备与标准的
12、 BFP及 4, 6-二脒基 -2-苯基吲哚（ 4,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）一起成像。所有 这些 BFP 变体都可以通过 A206K 突变改造成真正的单体，而且这种突变不会影响它们的特性。更重要的是，亮度最强、光稳定性最强的蓝色荧光蛋白 EBFP2，是 EGFP 在活细胞中 FRET 的很好的供体。 3、 黄色荧光蛋白 荧光蛋白的改造遵循这样一个宗旨，那就是越红越好 .普遍认为，长波长光子的激发对细胞和组织的光毒性小，且自体荧光和动物组织的光吸收都是最小。这些因素意味着红色的荧光基团对比度提高（因为背景应该降低），且更适合于体内成像 。 于是，荧光蛋白
13、的改造慢慢向红色偏移 。 黄色荧光蛋白 最早的 变体 EYFP（表 6）虽然仍被广泛应 用，但由于其 pK a 值高、对卤化物敏感，导致 EYFP 的应用还很不理想。单体形式的变体柠檬黄（ mCitrine）和维纳斯（ mVenus）是目前应用最多的黄色荧光蛋白探针，但二者都还没有商业化。然而与之相似的，来源于 Aequorea 被命名为诞生石 Topaz（黄玉）的变体可从 Invitrogen 公司买到。 另一种很有应用潜力的黄色荧光蛋白是能量转移黄色荧光蛋白（ yellow fluorescent protein for energy transfer, YPet），它经合成的 DNA 重
14、排获得，与荧光激活的细胞分 选术结合能够增强 FRET 中蓝绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的配对。 YPet 是已经开发的亮度最强的黄色荧光蛋白，并且有很好的光稳定性。YPet 对酸性环境的耐受性要比 mVenus 及其它黄色荧光蛋白变体强 。 4、 橙色荧光蛋白 在橙色和红色波长（约 560nm到 650nm）光谱区仅仅开发了几种探针。尽管如此，现有的这几种光谱型的蛋白都是从珊瑚中分离得到的，并且在多种成像情景中显现出应用潜力，但在对橙色区域荧光蛋白的命名中存在混乱。通常被命名为红色荧光蛋白 RFP的探针如 DsRed、 TagRFP及 tdTomato，实际上具有明显 的橙色多于红色的发射谱。
15、不考虑颜色的指示，用标准的四甲基罗丹明异硫氰酸脂（ tetramethyl-rhodamine isothiocyanate, TRITC）滤光片设备，橙色光谱型的蛋白在多种颜色，如蓝绿色、绿色和红色情景中更易于成像。 5、 红色荧光蛋白 红色荧光蛋白 (drFP583 )是人们从珊瑚虫 Discosoma gen。中克隆的一种与绿色荧光蛋白 (GFP)同源的荧光蛋白，在紫外光的照射下可发射红色荧光，有着广泛的应用前景 ;但它自身的缺点如寡聚化、成熟缓慢等限制了它的进一步应用。因此，人们对它进行了一 系列修饰和改进，得到了寡聚化程度低 (甚至单体 )和成熟速率快的突变体， Clontech公司
16、已将一种突变体商业化，命名为 DsRed。 与 GFP相比， DsRed的激发和发射波长较长，其发射峰位于培养基、组织培养器材及细胞成分等产生的荧光背景范围之外，具有较高的信噪比 ;而且在细胞内荧光转换效率高，更易检测。较早报道的红色荧光蛋白 (DsRed) 的突变体有 mBanana、mOrange、 dTomato、 mTangerine、 mStrawberry 和 mCherry。 在活细胞及动物全身成像中需要表现较好的红色荧光蛋白， 主要是由于在多种颜色成像实验中需要红色探针，另外基于较长的激发波长产生的光毒性较小，可以用来探测较深的生物组织。最新研究进展是，通过 mRFP1（表 6
17、）发色团残基的直接突变产生的新的荧光蛋白，得到的单体荧光蛋白发射峰在 560nm 610nm，并以相应的水果名字来命名。这其中 mStrawberry和 mCherry，发射峰分别为 596nm和610nm（表 6，图 22k），亮度分别为 EGFP的 75%和 50%左右。 mCherry的光稳定性要远强于 mStrawberry，所以长期成为成像实验中 mRFP1最好的替代品。这些 以水果命名的荧光蛋白单体与 mKO和 TagRFP共同填补了水母红移荧光蛋白（如 YPet）与大量低聚红色珊瑚荧光蛋白间的空白，并且目前已经商业化。虽然，某些荧光蛋白缺乏许多成像实验所需要的亮度和光稳定性，但是
18、它们的存在提示我们，最终可以找到跨越整个可见光谱的亮度高、稳定性强的单体探针。 6、荧光蛋白突变体 四、荧光素和荧光素酶 1、 萤火虫荧光素酶 目前常用的萤火虫荧光素酶来源于北美萤火虫 (Photinuspyralis)，是一个 61kDa的单体酶 ， 无需表达后修饰，直接具有完全酶活 ， 反应需要底物荧光素以及 ATP、 O2、 Mg2+等的参与 。 2、 海肾荧光素酶 海肾荧光素酶来源于海肾（ Renillareniformis） ， 是一个 36kDa的单体酶 ， 表达后无需修饰，即可具有完全酶活 。 反应只需要腔肠素（ Coelenterazine）和 O2参与 。 3、 Gussia 荧光素酶 Gussia荧光素酶来源于海洋桡脚类动物 Gaussiaprinceps， 是一个19.9kDa的单体酶，只有 185个氨基酸 ， 具有一个 16aa的分泌性信号肽 ，可以被细胞分泌到细胞外 ， 反应只需要腔肠素（ Coelenterazine）和O2参与 。
