1、1本科毕业论文系列开题报告资源与环境几种海洋微藻对石油标准品的响应一、选题的背景与意义1、国内外研究背景油污染对沿岸和大洋生物结构造成影响，很可能彻底改变海洋生态系统。海洋游泳动物或浮游动物对油污染的反应方式比较直观明显，对它们的研究较多且较易于进行。由于浮游植物对油污染的响应比较隐蔽不易观察到，其研究相对少得多。但是，对浮游植物的影响直接关系到水域生态系统的初级生产者基础。因此，尚存在大量的研究空白。从对浮游植物响应油污染的现有研究中来看，硅藻在油污染水域中受到的影响比较显著，而且由于硅藻是海洋初级生产力的主要组成，因此，关于油污染对硅藻的影响研究工作较多。油污染可以影响硅藻细胞致死或细胞分
2、裂停止。例如在MIRONOV（1968）的研究中发现，硅藻中布氏双尾藻是对油污染最敏感的种类，该研究中就有关于油污染敏感指示种的讨论。近期西班牙科学家通过对硅藻的研究，得出油污染对硅藻的影响取决于藻类的大小。直径小于20M的硅藻在油污染中生长加快；但超过20M的会受到抑制。这是由于光合途径和对PAHS的敏感度决定的。比较油污染海区和清洁海区的浮游植物结果显示在油污染海区中，甲藻占优势，浮游植物多样性指数低；清洁的海区，浮游植物多样性指数高，以硅藻占绝对优势。说明甲藻在细胞水平的耐受性和种群水平的群体行为上具有较硅藻耐油污的某些机制。多数甲藻具有混合营养方式，在不利于完全自养的环境中，部分甲藻可
3、以通过异养或回避实现种群的延续。油污染造成浮游植物群落结构改变，有机营养水平增加，耐受力高的种类增加。同时，因增强的有机物分解作用以及全球温暖化作用，使局部海水的缺氧状况加剧，在此改变的海水环境中，竞争能力强的种类可能形成优势爆发。从这个角度来看，研究耐油污的浮游植物其耐受油污染的机制之一，是比较富氧环境和缺氧环境中的耐受能力及其生理生化响应。最新的一项研究表明，几种广泛分布的绿藻具有高的抗油污染能力，能在长期严重污染的水体中形成优势，并且其耐油污的特征具有遗传能力。对盐藻的耐油污基因突变研究显示，2盐藻耐油污遗传突变是发生在油污前的随机突变而非获得性的遗传特征。由此可见，油污染并没有形成类似
4、极端环境的生物种类，而只是广泛分布种类的环境筛选。这种来源于长期耐受过程中逆境对随机突变基因的筛选过程，是否在浮游植物界具有普遍的生物学基础尚待解明。2、研究目的及意义海水油污染是继氮、磷因素之后的一个主要海水富营养化因素。除突发性溢油外，港口或船舶使用带来的油污以及陆源径流油污染都是海水油污染的主要来源。油污染的物质可以是多种多样的，包括原油、炼制油，如汽油、柴油及其副产品、船舶油污、陆源径流来源的生活油污等等。由于油污染具有种类和污染物质多样、作用复杂、持续时间长短差异明显的特征；并且，不同油污染对不同种类的浮游植物具有利、弊差异不同种类对不同油的反应各不相同，有些研究显示抑制有些显示促进
5、，但尚未有定论。诸多方面的因素，造成了关于油污染对浮游植物的影响机制研究的复杂性。到目前为止，虽然油污染的危害和某些微藻的响应有不少研究工作，但对浮游植物响应油污染的根本机制研究还存在巨大的空白，对典型微藻种类的耐受机制及其生态效应的研究也很缺乏。海洋油污染与浮游植物的关系是系统和时间上的累积效应，研究问题涉及浮游植物多样性、海洋初级生产力、海洋赤潮种类历史变迁、海洋浮游植物优势种变迁、对生物地化循环有显著作用种类的优势变迁、全球生态系统水平上的作用等等。因此，正是由于上述研究的复杂性，在研究油污染对浮游植物的影响时，重点关注的应该是代表性的油污染物质在浮游植物系统水平上的作用包括对种类组成、
6、优势种、多样性、种类演替等方面的影响。其中，针对油污染严重海区中，重要优势种类的耐受机制及其环境生态效应研究，则是复杂系统研究的锲入口。本研究为浮游植物对油污染的响应机制提供前期研究基础，并为分析现代海洋中油污染导致的浮游植物优势种变迁及其生态意义提供依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题本研究拟选择的浮游植物种类包括耐油污种类和非耐受种类，以国家标准物质中心提供的油标准、几种石油化学品以及生活油污等作为油污染源，进行单种种群响应差异的比较研究以及油污对共培养体系中微藻种间消长的影响研究。三、研究的方法与技术路线研究的重点多种微藻分别在单种种群水平上对油污染响应的生理指标。3研究难点精确定
7、位油污染所造成的微藻代谢物质的典型差异。研究内容和技术路线1、实验藻种的筛选结合文献资料，以东海海域和象山港港口海域分离的浮游植物种类为基础，拟选择硅藻、甲藻、绿藻和金藻各两种微藻进行研究。藻种在F/2培养液中连续继代预培养23代，获取细胞生长周期基本一致的微藻样本进行研究。2、油污染对浮游植物种群动态和光合作用的影响检测油污染影响下，8种微藻的种群生长和光合色素的变化。以饵料金藻（球等鞭金藻）为样本，研究油污对金藻粒径变化的可能影响。以及不同粒径大小的微藻对油污染的耐受差异。3、油污染对几种微藻共培养体系中种间消长的影响建立微藻的共培养体系，跟踪油污组和对照组中几种微藻的动态消长。四、研究的
8、总体安排与进度2010720109查阅资料、预实验等前期准备。20109201011实验藻种的筛选201011201012油污染对浮游植物种群动态和光合作用的影响实验2011120115整理数据，撰写论文。五、主要参考文献1VICTORIALPEZRODASDANIELCARRERAMARTNEZ,EVSALGADO,ARNZAZUMATEOSSANZ,JOSCBEZ,EDUARDOCOSTASAFASCINATINGEXAMPLEOFMICROALGALADAPTATIONTOEXTREMECRUDEOILCONTAMINATIONINANATURALSPILLINARROYOMINERO,
9、RONEGRO,ARGENTINAANRACADJNACFARM2009,7548838992SIRON,R,PELLETIER,EFIGUEIRAS,FGETALEFFECTOFSIMULATEDOILSPILLONNATURALASSEMBLAGESOFMARINEPHYTOPLANKTONENCLOSEDINMICROCOSMSJESTUARINECOASTALSHELFSCIENCE2009,8332652764TOMAJKA,JTHEINFLUENCEOFPETROLEUMHYDROCARBONSONTHEPRIMARYPRODUCTIONOFTHEDANUBERIVERPLANKT
10、ONJACTAHYDROCHIMIEHYDROBIOLOGIE1985,13,6156185GOUTZ,HM,BERLAND,B,LEVEAU,METALEFFECTSOFPETROLEUMBIODEGRADATIONPRODUCTSONPHYTOPLANKTONGROWTHJSECONDINTERNATIONALCOLHQUIUMONMARINEBACTERIOLO,1984,6216276王福华,倪晓华柴油对3种海藻光合和呼吸作用的影晌J上海环境科学,1989,17（3）38417DCARRERAMARTNEZ,AMATEOSSANZ,VETALCOSTASMICROALGAERESPON
11、SETOPETROLEUMSPILLANEXPERIMENTALMODELANALYSINGPHYSIOLOGICALANDGENETICRESPONSEOFDUNALIELLATERTIOLECTACHLOROPHYCEAETOOILSAMPLES4FROMTHETANKERPRESTIGEJAQUATICTOXICOLOGY2002,9720101511598PRINCERC,GARRETTRM，BARERE,ETA1THEROLESOFPHOTOOXIDATIONANDBIODEGRADATIONINLONGTERMWEATHERINGOFCRUDEANDHEAVYFUELOILSEJS
12、PILLSCIENCEFIGUEIRAS,FGETALEFFECTOFSIMULATEDOILSPILLONNATURALASSEMBLAGESOFMARINEPHYTOPLANKTONENCLOSEDINMICROCOSMSJESTUARINECOASTALSHELFSCIENCE2009,8332652764TOMAJKA,JTHEINFLUENCEOFPETROLEUMHYDROCARBONSONTHEPRIMARYPRODUCTIONOFTHEDANUBERIVERPLANKTONJACTAHYDROCHIMIEHYDROBIOLOGIE1985,13,6156185GOUTZ,HM,
13、BERLAND,B,LEVEAU,METALEFFECTSOFPETROLEUMBIODEGRADATIONPRODUCTSONPHYTOPLANKTONGROWTHJSECONDINTERNATIONALCOLHQUIUMONMARINEBACTERIOLO,1984,6216276王福华,倪晓华柴油对3种海藻光合和呼吸作用的影晌J上海环境科学,1989,17（3）38417DCARRERAMARTNEZ,AMATEOSSANZ,VETALCOSTASMICROALGAERESPONSETOPETROLEUMSPILLANEXPERIMENTALMODELANALYSINGPHYSIOLOG
14、ICALANDGENETICRESPONSEOFDUNALIELLATERTIOLECTACHLOROPHYCEAETOOILSAMPLESFROMTHETANKERPRESTIGEJAQUATICTOXICOLOGY2002,9720101511598PRINCERC,GARRETTRM，BARERE,ETA1THEROLESOFPHOTOOXIDATIONANDBIODEGRADATIONINLONGTERMWEATHERINGOFCRUDEANDHEAVYFUELOILSJSPILLSCIENCEOILDELAYEDFLUORESCENCEPHOTOSYNTHETICPARAMETERS
15、3引言油污染是海洋环境污染最严重的环境问题之一。除突发性溢油外，港口或船舶使用带来的油污以及陆源径流油污染都是海水油污染的主要来源。油污染的物质多种多样，包括原油、炼制油，如汽油、柴油及其副产品、船舶油污、陆源径流来源的生活油污等等。石油污染会破坏海洋固有的CO2吸收机制,形成碳酸氢盐和碳酸盐，缓冲海洋PH值，从而破坏了海洋中O2、CO2的平衡；油膜使透入海水的太阳辐射减弱；分散和乳化油侵入海洋植物体内，破坏叶绿素，阻碍细胞正常分裂，堵塞植物呼吸孔道。以上因素会破坏海洋食物网的中心环节浮游植物光合作用，进而破坏食物链，导致生物死亡。各种针对微藻对油污染响应的研究显示，油污染的存在对浮游植物的生
16、长来说并非都是有害的1。微藻是海洋的初级生产者，是海洋食物链及海洋生态系统能量输入的基础。不同种类的微藻，受复杂多样的油污染源的影响是不同的，从而形成了微藻种间竞争能力的差异，造成浮游植物群落演替发生相应变化，造成群落结构、功能的变迁，以致影响整个生态系统27。KARYDIS8等研究了石油烃类对于海洋硅藻的影响。低浓度的污染物对于硅藻的生长具有促进作用，而高浓度则抑制了硅藻的生长。石油烃类中芳香烃是毒性最强的一种，而烷烃类对于藻类的生长或光合作用都没有观测到明显的影响。但是芳烃和烷烃都对藻类的叶绿素A，蛋白质和细胞糖含量产生了影响。在石油污染严重的海区，赤潮的发生概率增加，虽然赤潮发生机理尚无
17、定论，但应考虑石油烃类的影响9,10。石油污染影响多种海洋浮游生物的生长、分布、营养吸收、光合作用及浮游植物参与二甲基硫DMS的产生和循环的过程，可以引发耐受油污染种类的单种赤潮1115。油污染对于浮游植物影响的多样性，表现在不同的浮游植物对于油污染物表现出不同的反应，包括对种类组成、优势种、多样性、种类演替等方面的影响。微藻类对于原油的污染物的生理反应研究鲜有报道1。由于油污染具有种类和污染物质多样、作用复杂、持续时间长短差异明显的特征；并且，不同油污染对不同种类的浮游植物具有利、弊差异不同种类对不同油的反应各不相同，有些研究显示抑制有些显示促进，但尚未有定论。诸多方面的因素，造成了关于油污
18、染对浮游植物的影响机制研究的复杂性。到目前为止，虽然油污染的危害和某些微藻的响应有不少研究工作，但对浮游植物响应油污染的根本机制研究还存在巨大的空白，对典型微藻种类的耐受机制及其生态效应的研究也很缺乏。正是由于上述研究的复杂性，在研究油污染对浮游植物的影响时，尚缺乏统一的标准方法、缺乏对敏感种类和耐受种类的认识、缺乏微藻受到油污染时其生理生化特性的变化规律和受到的影响程度的认识等等，尚存在大量的研究空白。本文试图就油污染对不同微藻的影响开展初步的研究，在基于多种微藻筛查的基础上，探索该领域研究中相关研究方法的可行性、检测指标的合理性、敏感与耐受微藻种类、受油污染时的生理响应以及受污染时的种群消
19、长等特征，为进一步深入研究提供指导与依据。41材料与方法11油污染源本研究所使用的油污染物样品为203石油标准，购自国家海洋局环境监测中心，规格1G/L12主要仪器设备及材料本研究中所需要的主要设备见表1。表1试验所需主要设备TABLE1MAINEQUIPMENTSFOREXPERIMENTS设备名NAME型号MODEL生产商MANUFACTURE实验中的主要用处USE多功能酶标仪3001THERMOFINLAND测定活体吸光值、延迟荧光值GXZ型智能光照培养箱GX2宁波江南仪器厂提供稳定的光温条件高压灭菌锅YQLS50S上海博讯实业灭菌实验用材料双目显微镜CX41RFOLYMPUS细胞计数电
20、热恒温干燥箱DHG9123A宁波江南仪器厂烘干、灭菌超声清洗机TP300天鹏电子油样品萃取浮游植物荧光仪APFP100PHOTONSYSTEMSINSTRUMENTS测定微藻光和参数照度计TES1330TESELECTRONICCORP检测光照强度颗粒计数仪TTCASYTECHNOLOGU细胞计数、径粒比对13藻种及其培养本研究所选用的全部微藻种类详见表2，所有藻种均为宁波大学微藻种质库存种类，除标记外均分离自浙江象山港海域，单种培养。实验前藻种在F/2培养液中连续继代预培养三代，获取细胞生长周期基本一致的微藻样本进行研究。表2本研究所用微藻种类TABLE2THEMICROALGAESPECI
21、ESUSEDINTHISSTUDY中文名拉丁名本研究中所使用代号硅藻门三角褐指藻PHAEODACTYLUMTRICORNUTUMPT小新月菱形藻NITZSCHIACLOSTERIUMFMINUTISSIMANF尖刺拟菱形藻PSEUDONITZSCHIAPUNGENSPSENDN中肋骨条藻SKELETONEMACOSTATUMSCXMB2冠盘藻STEPHANODISCUSSPST514实验方案设计141油污染对微藻活体吸光的影响目的在于分析不同油污浓度可能对微藻种群生长造成不同的影响，在24孔组织培养板柔弱角刺藻CHAETOCEROSDEBILISCH圆海链藻THALASSIOSIRAROTUL
22、AHGNJ1直链藻MELOSIRASPATOC海毛藻THALASSIOTHRIXFRAUENFELDIIGRUNOWHM双眉藻AMPHORASPATOS盒形藻BIDDUIPHIASPHX几内亚藻GUINARDIAGUN续表2中文名拉丁名本研究中所使用代号圆筛藻COSCINODISCUSSPCOS双尾藻DITYLUMSPSW针胞藻赤潮异弯藻HETEROSIGMAAKASHIWOH1赤潮异弯藻HETEROSIGMAAKASHIWOH2赤潮异弯藻HETEROSIGMAAKASHIWOH3甲藻门亚历山大藻ALEXANDRIUMLUSITANICUMAL1海洋原甲藻PROROCENTRUMMICANSP
23、M1无纹环沟藻GYRODINIUMINSTRIATUMGS塔玛亚历山大藻ALEXANDRIUMTAMARENSEAT东海原甲藻PROROCENTRUMDONGHAIENSEPDH锥状斯克里普藻SCRIPPSIELLATROCHOIDEASKT微小卡罗藻KARLODINUMMICRUMGM2米氏凯伦藻KARENIAMIKIMOTOIMK微小原甲藻PROROCENTRUMMINIMUMPSP金藻门金藻ISOCHRYSISGALBANA3011金色巴夫藻PAVLOVAGYRANSBUTCHER02颗石藻PLEUROCHRYSISCATERAECOCCOLITH颗石藻PLEUROCHRYSISSPCO
24、CCO2APEDINELLARADIANSXSF1绿藻门青岛大扁藻PLATYMONASHELGOLANDICAPLT小球藻CHLORELLASP820隐藻门隐藻CRYPTOMONASEROSASPA56上进行小体积高通量的筛查，并检验该方法的可行性。根据BECKER在微藻生长处理方法描述，本试验中藻生物量的测定采用浊度比色法16。使用多功能酶标仪（THERMO）在680NM波长处测定藻液的活体吸光值（A680），通过比较微藻活体A680的变化情况来反应油标准污染下微藻的生长相对于对照组的变化情况。1411试验藻种对32种微藻（表2）进行了石油标准物污染实验，实验前藻种在F/2培养液中连续继代预
25、培养3代，获取细胞生长周期基本一致的微藻样本进行研究。1412培养基配置石油标准品萃取后添加。A用移液枪取120L203石油标准于200ML容量瓶，用F/2培养液定容，用力摇晃半小时后转入三角瓶贮存，母液石油标准溶液06MG/L。配好的溶液转入三角瓶，保存。B分别取（A）中配好的溶液1ML和100UL到100ML的容量瓶用F/2培养液定容，配置浓度为006MG/L和0006MG/L的石油标准溶液。配好的溶液转入三角瓶，保存。1413实验设置微藻于24孔板进行培养，油水母液藻液按照11比例添加，最终工作石油标准浓度为0003MG/L、003MG/L、03MG/L。并设置空白对照组。每组实验设置组
26、平行样。1414培养箱条件温度20；光照29003000LX；光照黑暗12H12H。1415吸光值测定各组藻液用多功能酶标仪（THERMO）在680NM处吸光值，检测时间0，1，5，24，48，72小时。142油污染对微藻色素延迟荧光的影响延迟荧光DF是植物光合器官在停止光照后的发光现象17。因为它与荧光有相同的波形且比荧光要迟，所以也叫延迟发光。它能够从NS持续到几分钟。因为光诱导延迟荧光在发光时间上比荧光慢，而且DF本身也是在光合作用电子链中产生，所以较叶绿素荧光有利于研究光合作用822。现在公认的观点是在放氧组织中的延迟荧光来自于光系统PS23。延迟荧光的光谱学研究结果表明延迟荧光光谱中
27、包括685NM的主峰和730NM的次峰24。对于685NM成分主要来源于植物PS中的光化逆反应产生的激发态叶绿素分子退激发产生23。产生的机理可简述如下在光照过程中PSI1反应中心产生的氧化还原产物由于突然停止光照而发生逆转反应，即处于氧化态的P680与还原态的原初电子受体Q所带电荷复合而产生激发态的P680，而P680退激发产生685NM延迟荧光。本研究利用丙酮萃取法提取微藻色素，在多功能扫描酶标仪（THERMO）下测定延迟荧7光25。本法是在ARNON的丙酮法和HISCOX等的DMSO法的基础上改进而成。可称之为二甲亚砜和丙酮混合法。简称混台法。1421试验藻种硅藻圆筛藻（COSCINOD
28、ISCUSSPCOS）、双尾藻（DITYLUMSPSW）；甲藻东海原甲藻（PROROCENTRUMDONGHAIENSEPDH）、微小原卡罗藻（KARLODINUMMICRUMGM2）；金藻颗石藻（PLEUROCHRYSISSPCOCCO2）、金藻（ISOCHRYSISGALBANA3011）。实验前藻种在F/2培养液中连续继代预培养代，获取细胞生长周期基本一致的微藻样本进行研究。1422培养基及试剂配置石油标准品萃取后添加。用移液枪取1000L油于200ML容量瓶并用F/2培养液定容。后转入三角烧瓶，超声波处理30MIN，然后倒入分液漏斗静置30分钟后取下层液作为实验用油污试剂。配好的溶液作
29、为油水母液转入三角瓶，保存。取二甲基亚砜（DMSO）和丙酮各100ML11的比例混合后转入棕色瓶，密闭冷藏保存待用，用作色素萃取剂DMSO丙酮溶液。1423实验设置微藻于50ML三角烧瓶内进行培养，油水母液藻液按照11比例添加，最终石油标准的工作浓度为25MG/L。并设置空白对照组，每组实验设置平行样。实验设置如下实验组5ML油5ML藻液对照组5ML水5ML藻液空白一2ML油液8MLDMSO丙酮溶液空白二2MLF/2培养液8MLDMSO丙酮溶液1424培养条件温度20；光照2900LX；光照黑暗12H12H。1425色素丙酮溶液荧光值测定色素提取按08MLDMSO丙酮溶液02ML藻液的比例添加
30、入色素萃取用的2ML玻璃瓶，用力摇晃混匀，避光处理20分钟后取02ML置于96孔板上，用光密度酶标仪室温下检测叶绿素的延迟荧光。激发波长430NM，发射荧光685NM。检测时间为0H、1H、5H。143油污染对微藻细胞分裂及其粒径的影响运用颗粒技术仪（TT，CASY）微藻受到油污染影响时，微藻细胞分裂速率和粒径大小变化。81431试验藻种硅藻圆筛藻（COSCINODISCUSSPCOS）、双尾藻（DITYLUMSPSW）；甲藻东海原甲藻（PROROCENTRUMDONGHAIENSEPDH）、微小原卡罗藻（KARLODINUMMICRUMGM2）；金藻颗石藻（PLEUROCHRYSISSPCO
31、CCO2）、金藻（ISOCHRYSISGALBANA3011）。实验前藻种在F/2培养液中连续继代预培养代，获取细胞生长周期基本一致的微藻样本进行研究。实验前藻种在F/2培养液中连续继代预培养3代，获取细胞生长周期基本一致的微藻样本进行研究。1432实验设置直接添加油标准。实验组（五平行）对照组60MLF/2培养液20ML藻液实验组（五平行）60MLF/2培养液20ML藻液008MG油1433培养条件黑暗状态下温度18；光照条件下温度20；光照强度2200LX2500LX，LD1212。1434参数测定试验中采用颗粒计数仪进行细胞计数，比对径粒分布变化。并计算每日细胞分裂速率RLNNTLNNT
32、1。144油污染影响微藻光合参数变化研究采用浮游植物叶绿素荧光仪测定光合参数，用以研究不同油污浓度对微藻光合参数的影响。本实验对叶绿素荧光参数F0、FT、FV/FM、FV/FM进行了测定。各参数的意义见表3。表3光合荧光参数及其意义参数意义F0初始荧光值暗适应状态下当光系统PS的所有反应中心处于完全开放状态并且所有的非光化学过程处于最小时的荧光。FM（最大荧光值）暗适应状态下当PSLI的所有反应中心处于完全关闭状态即不进行任何光化学反应并且所有的非光化学过程处于最小时的荧光。FV/FMPSII的最大光化学量子产量用于PS光化学反应的光能占PSLI吸收的总光能的最大比例。是指当所有的PS反应中心
33、均处于开放状态时的量子产量。FV/FMPSII光化学的有效量子产量由于在光适应状态下非光化学过程得到活化，因此FV/FM往往小于FV/FM。1441实验微藻东海原甲藻（PROROCENTRUMDONGHAIENSEPDH）、颗石藻（PLEUROCHRYSISSPCOCCO2）、青岛大扁藻（PLATYMONASHELGOLANDICAPLT）、双尾藻（DITYLUMSPSW）。实验前藻种在F/2培养液中连续继代预培养3代，获取细胞生长周期基本一致的微藻样本进行研究。91442实验设置直接添加油标准。微藻在250ML三角瓶中培养，均采用F/2培养基，油胁迫浓度分别为0MG/L、1MG/L、3MG/
34、L、5MG/L，每个浓度梯度下设三组平行，全光照培养，每日随机调换三角瓶并摇动23次，培养时间为72小时。定时5小时、24小时、48小时、72小时、96小时取样2ML，进行叶绿素荧光各项参数测定。1443实验条件温度20；光照2900LX；全光照培养。1444参数测定光合作用参数采用浮游植物荧光仪（APFP100，PHOTONSYSTEMSINSTRUMENTS）进行测定。145油污染对混养体系微藻种群变化的影响1451实验微藻东海原甲藻（PROROCENTRUMDONGHAIENSEPDH）、颗石藻（PLEUROCHRYSISSPCOCCO2）、青岛大扁藻（PLATYMONASHELGOLA
35、NDICAPLT）、双尾藻（DITYLUMSPSW）。实验前藻种在F/2培养液中连续继代预培养3代，获取细胞生长周期基本一致的微藻样本进行研究。1452实验设置微藻在500ML三角瓶中培养，均采用F/2培养基，油胁迫浓度分别为0MG/L、1MG/L、5MG/L，每个浓度梯度下设三组平行。PDH、COCCOLITH、PLT、SW添加初始密度分别为27X103CELL/ML、341X103CELL/ML、295X103CELL/ML、296X103CELL/ML，添加体积比为16ML5ML2ML150ML，用F/2培养液定容到200ML。，每日随机调换三角瓶并摇动23次。1453实验条件温度25；
36、光照2900LX；全光照培养。1454参数测定细胞密度采用血球计数板和浮游植物计数框进行计数，每个样品计数3次。计数时间间隔为24小时，连续计数5天。1455数据分析数据采用EXCEL2010进行绘图，并采用SPSS170进行数据统计分析。102结果21油污染对微藻活体吸光的影响本实验利用藻类色素的活体吸光来表征相对生物量。利用24孔板小体积样品、结合酶标仪高通量检测技术，可以对大量样品进行快速检测。图1显示了32种微型浮游藻类在实验设置的油污状态下的相对生物量变化情况。从图中可以看出，实验设置的石油标准品污染水平下，受污染后的5小时内，检测不到微藻活体吸光的显著变化。连续检测3天后（72H）
37、，一些微藻在种群水平上出现了差异。对其中CH、ST、PSENDN、ATOC、SCXMB2、HGNJ1、GUN、NF、820、GM2、PDH、3011、COCCO2进行浓度和时间双因素方差分析分析发现ST、PSENDN、SCXMB2和ATOC4种藻的吸光值在浓度分布上呈现了显著差异（见表29），而CH、HGNJ1、GUN、NF、820、PDH、3011、COCCO2和GM2的差异性主要体现在时间分布上，没有浓度差异性。1112131415161718图1不同浓度石油标准污染胁迫下32种微藻活体吸光值（A680）随时间变化情况对其中4种有与浓度相关的显著性差异的微藻的分析如下从图2可以看出不同油污
38、染浓度，不同培养时间和浓度梯度共同的作用对冠盘藻（ST）680NM下吸光值有显著差异性（P005），因此用LSDT检验分析可知3组浓度实验组与对照组之间都存在005水平上显著差异；最高浓度组（03MG/L）与其他浓度组之间也存在显著差异；但0003MG/L浓度组和003MG/L浓度组之间不存在显著差异（表5）。这说明不同浓度的油标准污染都对ST在680NM下的吸光值产生了显著的抑制作用，其中，最高浓度组的抑制较为明显。但0003MG/L浓度组和003MG/L浓度组对ST的A680产生的影响作用没有浓度梯度上的区别。19图2冠盘藻（STEPHANODISCUSSPST）在不同浓度油污染下活体吸光
39、值（A680）随时间变化图表4主体间效应的检验表对冠盘藻的吸光值A680进行多因素方差分析，分析浓度与时间对于吸光值的交互影响。源III型平方和DF均方FSIG浓度006300211072000时间1245025137806000浓度时间0091500110543000表5LSDT检验两两比较结果对不同浓度之间对冠盘藻的A680影响作了两两比较，分析不同浓度间的影响差异。I浓度J浓度95置信区间均值差值IJ标准误差SIG下限上限LSD120136290044801003004676022582300911000448010460001580180634025355004480100001640
40、203430721013629004480100302258200467630045190044801317013472004434401172600448010110027730206783100911000448010460180630001582004519004480131700443401347240162450044801001007292025197410253550044801000034307016402201172600448010110206780027733016245004480100102519700729220注浓度1、2、3、4分别代表对照组、0003MG/L浓
41、度组、003MG/L浓度组、03MG/L浓度组。在对尖刺拟菱形藻（PSENDN）的数据分析中可知，不同浓度组对680NM吸光值的偏差均方是0002，显著水平是0013，即P005），因此，经过DUCNAN分析可知最高浓度组（03MG/L）与其他浓度组之间都存在显著差异；但对照组与0003MG/L浓度组和003MG/L浓度组之间不存在显著差异。（表8）。由此说明，石油标准污染物，在本实验最高浓度（03MG/L）作用下，显著地抑制了直链藻在680NM下的活体吸光值。低浓度0003MG/L浓度组和003MG/L浓度组没有对直链藻在680NM下的活体吸光值产生明显影响（图4）。图4直链藻（MELOSI
42、RASPATOC）在不同浓度油污染下活体吸光值（A680）随时间变化图表7主效应分析源III型平方和DF均方FSIG浓度00043000173200000时间06050012687750000浓度时间000015142E500811000表8DUNCAN分析表子集浓度N12418012650631801424302221801434151180144090SIG10000726在对中肋骨条藻（SCXMB2）的分析中可知，不同浓度组时间分布都对吸光值有显著差异（P005）。由于方差齐性显著，因此可利用DUNCANT检验来进行不同浓度间的多重比较。结果显示003MG/L浓度组和03MG/L与对照组
43、有显著差异；0003MG/L浓度组与对照组没有显著差异（005）（表9）。由此说明003MG/L浓度组和03MG/L都显著地促进了SCXMB2的A680值，且高浓度的促进作用较低浓度组的促进作用大。中间浓度的油污染没有对中肋骨条藻的A680值产生显著的作用（图5）。图5中肋骨条藻（SKELETONEMACOSTATUMSCXMB2）在不同浓度油污染下活性吸光值（A680）随时间变化图表9DUNCAN分析表浓度子集N123DUNCANA,B118174279318175214218188572418201350SIG77010001000注浓度1、2、3、4分别代表对照组、0003MG/L浓度组
44、、003MG/L浓度组、03MG/L浓度组。均值差值在005级别上较显著。上述的实验和分析结果显示，利用24孔板的优势以及微型藻类种群生长过程中活体吸光的相对变化，可以方便地进行对油污染作用于微藻种群生长过程特性的小体积高通量筛23查，并且能反映微藻种群生长过程对污染物的响应特征。本方法要求微藻悬浮液均匀度好，且检出灵敏度不高。22油污染对微藻色素延迟荧光的影响图7显示了6种微藻色素二甲基亚砜丙酮萃取物在激发波长430NM，发射荧光67110NM的延迟荧光值随时间变化情况。通过方差分析可以知道，在25MG/L油标准污染作用下，颗石藻COCCO2和等边金藻3011与对照组间没有产生荧光值上的显著
45、差别。其余4种藻的色素荧光均在特定水平上与对照存在显著差别，详见表10。可以看出，不同的微藻受到油标准品作用后相对于对照组的变化是不同的。同属金藻类的颗石藻和金藻3011在本次处理中没有与对照组产生显著差异。而其他两种甲藻和两种硅藻受油污处理后，叶绿素延迟荧光降低具有显著统计学意义。利用检测叶绿素延迟荧光的方法，可以分析藻类在短时间内的响应变化。但是该方法需要提取色素，破坏样品，不能进行连续的检测，相对繁琐。图6不同油污染浓度下六种微藻的延迟荧光值变化图24表10油污胁迫下6种微藻荧光值与对照组的差异性比较表中表示在005水平上显著差异；表示在001水平上特别显著差异；表示没有差异。微藻种类1
46、H（F值）显著水平5H（F值）显著水平GM285338965929PDH11099265SW00233863COS1924427COCCOLITH26623403011076104023油污染对微藻细胞分裂及其粒径的影响3种微藻的生长情况见图7，因素方差分析（P005）显示，1MG/L浓度油污染下，油污染对微藻的生长整体上不存在显著差异（P005），但在特定的生长阶段造成了一定的影响。微小卡罗藻GM2在培养01天、35天两个生长点的细胞密度显著低于对照组（P005）。等边金藻3011在培养01天、57天两个生长点细胞密度显著低于对照组（P005）。颗石藻COCCOLITH在第12天的生长速率要
47、显著低于对照组（P005）。通过颗粒技术仪的细胞径粒大小分布对比，油污组合实验组在细胞径粒大小上没有显著差异。结合细胞分裂速率（图8），25图71MG/L油污染浓度下3种微藻的生长曲线26图81MG/L油污染浓度下3种微藻细胞分裂速率变化24油污染影响微藻光合参数变化研究241油污染对双尾藻SW光合参数的影响不同浓度油标准污染物对双尾藻叶绿素荧光参数的影响见图9，单因子方差分析显示，在整个培养过程中，石油标准浓度对PSII光化学的有效量子产量（FV/FM）、PSII光化学最大量子产量（FV/FM）和PSII的潜在活性（FV/F0）均有显著的影响（P005）。从图中可以看出，添加了石油标准污染物
48、各培养组藻液FV/FM比值随着培养时间的增加而不断下降，而对照组的FV/FM比值在5小时达到最高值，之后随着培养时间的增加而呈下降趋势。油污染处理组的PSII有效光化学电子产量都比对照组要低，油污染浓度最高组，FV/FM比值最小。多重比较结果表明，从5小时开始，各浓度组的FV/FM、FV/FM、FV/F0值均与对照组存在显著差异（P005），其中最高污染浓度下FV/FM比值相对另外两组组低浓度FV/FM比值存在显著差异（P005），最高浓度组的油污染对双尾藻FV/FM比值造成了最显著的抑制作用。FV/FM、FV/F0的比值在浓度梯度上不存在显著差异，说明各浓度组的油污染对双尾藻的PSII光化学
49、最大量子产量（FV/FM）和PSII的潜在活性（FV/F0）都造成了一定的抑制作用，但是这种抑制作用在污染浓度梯度上不存在区别。27图9油污染浓度对双尾藻（DITYLUMSPSW）叶绿素荧光参数的影响242油污染对颗石藻COCCOLITH光合参数的影响不同浓度油标准污染物对颗石藻叶绿素荧光参数的影响见图10，单因子方差分析显示，在整个培养过程中，石油标准浓度对PSII光化学的有效量子产量（FV/FM）、PSII光化学最大量子产量（FV/FM）和PSII的潜在活性（FV/F0）均有显著的影响（P005）。从图中可以看出最高浓度污染组FV/FM比值随着时间下降，在48小时后显著有上升趋势外，其余的培养组FV/FM比值均在5小时处到最高峰，随后随时间下降，在24小时培养后随时间上升。FV/FM、FV/F0比值均随着时间呈下将趋势。且FV/FM、FV/FM、FV/F0的比值与油污染浓度成正比，污染浓度越高，比值越大。多重比较结果表明，从5小时开始，各浓度组的FV/FM、FV/FM、FV/F0值均与对照组存在显著差异（P005），并且不同浓度组之间也存在显著差异。说明不同浓度的油标准污染物对颗石藻
