1、1本科毕业论文系列开题报告生物技术自制鳗弧菌卵黄抗体抑菌效果研究一、选题的背景与意义鳗弧菌（VABRIOANGUALLANIM）是一种对水产鱼类危害严重的细菌病原，其流行区域广泛，能引起世界范围内的淡、海水鱼类及其它养殖动物发生弧菌病，常给水产养殖业造成巨大的经济损失。它还可通过食物链感染人类，使人发生较严重的疾病。因此对该病原进行深入的研究，寻找防止和减少该病爆发的方法，对于为人类提供高质量的水产品具有重要的意义。卵黄抗体（EGGYOLKIMMUNOGLOBULIN,IGY）是从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是一种具有较强免疫功能的蛋白质，多为IGG。禽类免疫后在其卵黄中产生的大量高
2、纯度免疫球蛋白G（IGG），其对疫病具有明显治疗和紧急预防作用。用于人、畜、禽类疫病防治方面的有很多成功的研究报道，且已有产品应用于生产中，如用于紧急预防和治疗传染性法氏囊病（IBD）、新城疫（ND）等疫病的IGY,效果很好。在水产动物方面，只对鳖有少量研究，在对其他细菌病方面则未见研究报道。本研究的目的是借鉴陆生畜禽相关研究的成功经验，以纯培养的鳗弧菌作为抗原,探讨鳗弧菌IGY的制备技术,并研究其抑菌效果，以期为鳗弧菌引起的疾病的生物防治工作奠定基础，创造社会、经济及生态效益。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题本研究通过自制的抗鳗弧菌卵黄抗体进行体外抑菌试验和体内抑菌（即动物保护试验），研
3、究其抑菌效果。拟解决的主要问题抑菌效果的研究方法。三、研究的方法与技术路线1体外抑菌效果的研究根据实验设计的浓度比，将卵黄抗体与鲜鳗弧菌菌悬2液的混合，并在不同时间下培养后，涂布在培养基上培养。然后进行菌落计数，对比、分析各组结果。2体内抑菌效果（即动物保护试验）对将一定浓度的鳗弧菌菌悬液注射入克氏原螯虾体内进行攻毒，观察死亡情况。中和试验将卵黄抗体与鳗弧菌等比例混合并中和一段时间后，注射入试验动物体内，观察试验动物的发病以及死亡情况。技术流程四、研究的总体安排与进度201011201012查阅文献，外文翻译，任务书和开题报告的撰写，熟悉实验操作。201012201102鳗弧菌卵黄抗体的体内、
4、体外抑菌效果试验。201102201103鳗弧菌卵黄抗体的抑菌效果分析。201103201104实验数据的整理分析以及对整个试验的补充、完善。201104201105撰写论文，结题、答辩。五、主要参考文献1EGIDIUSEVIBRIOSIS,PATHOGENICITYANDPATHOLOGY,ARENEWJAQUACULTURE,1987,6715182TORANZOAB,SANTOSY,BARJAJIIMMUNIZATIONWITHBACTERIALANTIGENSVIBRIOINFECTIONSJ体外抑菌效果体内抑菌效果卵黄抗体对照组与实验组的制备鳗弧菌菌悬液制备制备混合培养液涂布、观察、
5、分析注射攻毒卵黄抗体对照组与实验组与鳗弧菌菌悬液的混合自制卵黄抗体抑菌效果试验观察克氏原螯虾的发病以及死亡情况克氏原螯虾的预感染实验培养液的孵育3DEVBIOLSTAND,1997,90931053布坎南RE，吉本斯NE中国科学院微生物研究所伯杰细菌鉴定手册编译组译伯杰细菌鉴定手册M第八版北京科学出版社,1984PP4754814MILTONDL,NORQVISTA,WOLFWATZHJOURNALOFBACTERIOLOGYM,1992,17422723572445BOESENHT,PEDERSENK,LARSENJL,ETALBOESENHT,PEDERSENK,LARSENJL,ETAL
6、INFECTIMMUNJINFECTIMMUN,1999,672943016KUSUDAR,KAWAIKGYOBYOKENKYUM,1998,332217孟思妤，孟长明，陈昌福鳗弧菌（VIBRIOANGUILLARUM）的病原生物学研究现状（上）J渔业致富指南，FISHERYGUIDETOBERICH，2010，（01）63648莫照兰，茅云翔，陈师勇，张培军一株牙鲆皮肤溃烂症病原菌的鉴定J微生物学报，2002，（03）9高冬梅，李健，王群鳗弧菌灭活疫苗对牙鲆免疫效果的研究J海洋水产研究，2004，25（1）48649210肖慧，李军，徐怀恕等鲈鱼苗烂鳃、烂尾病病原的研究J青岛海洋大学报，19
7、99，29（1）8911夏永娟，黄威权，姜国良鳗弧菌感染牙鲆的组织学及组织化学观察J海洋科学，2000，24（10）414412陈吉祥，于德华，李绮鱼类病原鳗弧菌致病相关因子及分子生物学J海洋科学2003，（08）13LALLYET,HILLRB,KIEBAIR,ETALTHEINTERACTIONBETWEENRTXTOXINSANDTARGETCELLSJTRENDSINMICROBIOLOGY,1999,735636114BOARDMANBK,FULLERSKJJOURNALOFBACTERIOLOGYM,2004,186238137814315JARMAE,CORRADINOG,REG
8、ASSALBANAEROBIOSIS,GROWTHPHASEANDACTINOBACILLUSPLEUROPNEUMONIAERTXTOXINPRODUCTIONJMICROBPATHOG,2004,371293316CORTAJARENAAL,GONIFM,OSTOLAZAHHIS859ISANESSENTIALRESIDUEFORTHEACTIVITYANDPHDEPENDENCEOFESCHERICHIACOLIRTXTOXINALPHAHAEMOLYSINJJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY,2002,27726232232322917RODKHUMC,STORK
9、HM,LORENZOMD,ETALJOURNALOFFISHDISEASESM,2006,291576618MILTONDL,TOOLER,HORSTEDTP,ETALFLAGELLINAISESSENTIALFORTHEVIRULENCEOFVIBRIOANGUILLARUMJJOURNALOFBACTERIOLOGY,1996,178513101319419NORQVISTA,NORRMANB,IDENTIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFAZINCMETALLOPROTEASEASSOCIATEDWITHINVASIONBYTHEFISHPATHOGENVIBRI
10、OANGUILLARUMJWOLFWATZHINFECTIONANDIMMUNITY,1990,58113731373620DENKINSM,NELSONDRREGULATIONOFVIBRIOANGUILLARUMEMPAMETALLOPROTEASEEXPRESSIONANDITSROLEINVIRULENCEJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,2004,7074193420421NORQVISTA,WOLFWATZHIDENTIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFAZINCMETALLOPROTEASEASSOCIATEDWIT
11、HINVASIONBYTHEFISHPATHOGENVIBRIOANGUILLARUMJINFECTIONANDIMMUNITY,1993,6162434244422MONTEMAB,AUSTINBCHARACTERIZATIONOFEXTRACELLULARPRODUCTSFROMANISOLATEOFVIBRIOHARVEYIRECOVEREDFROMDISEASEDPOSTLARVALPENATUSINRMAMEIBORNEJJOURNALOFFISHDISEASES,1999,2237738623HOMEMT,BAXENDEATHEADHESIONOFVIBRIOONGUILLARUM
12、TOHOSTTISSUESANDITSROLESINPATHOGENESISJJFISHDISEASE,1983646147124OLSSONJC,JOBOMA,WESTERDAHLA,ETALISTHETURBOT,SCOPHTHALMUSL,INTESTINEAPARTIALOFENTRYFORTHEFISHPATHOGENVIBRIOANGUILLANUNJJFISHDISEASE,1996,1922523425ACTISLA,TOLMASKYME,CROSALM,ETALCHARACTERIZATIONANDREGULATIONOFTHEEXPRESSIONOFFATB,ANIRONT
13、RANSPORTPROTEINENCODEDBYTHEPJM1VIRULENCEPLASMIDJMOLMICROBIAL,1995,17119720426余俊红，姚斐，俞勇等应用间接荧光抗体技术快速检测花鲈病原菌鳗弧菌J海洋水产研究，2002，23（2）384427GONZALEZSF,OSORIOCR,SANTOSYJOURNALOFFISHDISEASEM,2004,271161762128孟思妤，孟长明，陈昌福鳗弧菌（VIBRIOANGUILLARUM）的病原生物学研究现状（下）J渔业致富指南，FISHERYGUIDETOBERICH，2010，（01）636429黄琪淡主编，水产动物疾
14、病学J上海科学技术出版社，1996，1261285毕业论文文献综述生物技术鳗弧菌研究概况摘要鳗弧菌VABRIOANGUALLANIM是一种对水产鱼类危害严重的细菌病原，常给水产养殖业造成巨大的经济损失。本文从鳗弧菌的分类地位、生物学特性、致病性研究等方面对该菌的性状进行了系统的分析；并讨论了目前一些检测鳗弧菌方法，以及对发展和现状情况进行了简单的介绍。从而为对鳗弧菌进行更深入研究提供一些依据。关键词鳗弧菌；分类地位；致病机理；感染；防治鳗弧菌（VABRIOANGUALLANIM）是一种对水产鱼类危害严重的细菌病原，其流行区域广泛，能引起世界范围内的淡、海水鱼类及其它养殖动物发生弧菌病，常给水产
15、养殖业造成巨大的经济损失1。它还可通过食物链感染人类，使人发生较严重的疾病2。因此对该病原进行深入的研究，寻找防止和减少该病爆发的方法，对于为人类提供高质量的水产品具有重要的意义。同时，使人们广泛重视对于鳗弧菌的研究。为了全面了解鳗弧菌并有效地检验该菌及预防与控制相应的感染，现对该菌做如下简要介绍。一、鳗弧菌的分类地位和主要生物学特征11鳗弧菌的分类地位鳗弧菌隶属于弧菌科（VIBRIONACEAE）弧菌属（VIBRIO）3，是引起多种海水鱼类出血性败血症的病原菌4，是一种可导致多种海洋鱼类弧菌病（VIBRIOSIS）的高致病性病原体5,6。它是水环境的正常菌群，在夏天数量最多，在冬天最少，在海
16、水微生态环境中该菌存活期超过50个月。12鳗弧菌的主要特征鳗弧菌为有鞭毛的革兰氏阴性细菌，无荚膜，不形成芽孢，能运动，氧化酶阳性，对O/129敏感。葡萄糖氧化反应呈阳性，具有典型的弧菌属细菌特征7。莫照兰等报道的导致牙鲆出血症的鳗弧菌呈短杆状，有1根很长的极生单鞭毛，可运动；在2216E培养基上培养24H的菌落呈圆形、半透明，直径约15MM；在TCBS培养基上培养24H的菌落呈黄色，直径约3MM，菌体大小为（0810）（1517）M8。13鳗弧菌的生化特性鳗弧菌能产氧化酶和过氧化氢酶，发酵葡萄糖。菌株能在435范围内生长，适宜温6度是1337；在含36的NACL的培养基上能生长，但在无盐的培养
17、集上生长不良；能利用柠檬酸盐。VP反应呈阳性，能产生吲哚，不产硫化氢；能发酵蔗糖、肌醇、山梨醇产气，能利用D葡萄糖、L阿拉伯糖、甘露醇（CW3除外）、D半乳糖、果糖、甘露糖为唯一碳源8。二、鳗弧菌致病性的研究21致病性与症状鳗弧菌是危害鱼类的主要的条件性病原菌之一，能引起的水产养殖动物疾病在世界范围内流行，可感染鲑鱼、虹鳟、鳗鲡、香鱼、鲈鱼、鳕鱼、大菱鲆、牙鲆、黄鱼等9。鳗弧菌是条件致病菌当水温较高、营养较丰富时数量急剧增加。因此在夏季，特别是养殖密度、盐度和有机物含量较高的条件下，水产养殖动物在不良的环境条件下，遭遇不利刺激或是受伤时，会诱发疾病的产生。鳗弧菌的感染会引起全身性的组织病变。不
18、同的鱼感染鳗弧菌后会有不同的症状，但主要症状是体表出血，症状逐步加深的。有研究学者报道，部分感染鳗弧菌的鱼体表最初出现局部褪色，鳍条、鳍基部及鳃骨下部充血发红，肛门红肿，继而肌肉组织有弥撒性或点状出血，体表发黑，鳍部出现溃烂；解剖检验时有明显的黄色粘稠腹水，肠粘膜组织腐烂脱落，部分鱼肝脏坏死10。感染鳗弧菌的养殖牙鲆最明显的症状是鳍部严重出血以及体表溃烂感染了鳗弧菌的大菱鲆，出现全身性的出血性败血症，鳍基部出血，眼球突出，角膜混浊，肝脏苍白，有时伴有腹水症状11。22致病因素鳗弧菌的致病过程包括黏附、侵袭、体内增殖及产生毒素等系列过程，而这些过程又与细菌产生的各种致病因子有关。目前已经发现的致
19、病因子有外毒素、粘附因子、侵袭因子、细胞表面成分、铁吸收系统等。221外毒素EXOTOXIN目前研究的外毒素主要有两种，溶血素HEMOLYSIN和重复序列毒素REPEATINTOXIN，RTX。已经被发现鳗弧菌胞外产物中的溶血素具有溶血活性。溶血素为单一的多肽分子，具有溶血性细胞毒性，使动物致死性。据报道鳗弧菌的溶血素毒性可能与被注射鱼的贫血症状有关，这些溶血素被认为是一种热不稳定酶，50加热10MIN可灭活，最适PH7274，可以被神经节昔脂失活。12鳗弧菌的溶血素，可使鳗鲡致死，其溶解红细胞的活性依赖温7度，低于10时溶解活性下降，最适作用温度2022，红细胞溶解后释放的血红蛋白为细菌提供
20、营养需要。RTX毒素是部分革兰氏阴性菌产生的重要毒力因子，属于I型分泌系统的孔形成毒素家族，该家族还包括溶胞素、金属蛋白酶和脂肪酶，都有共同的基因组分和显著不同于其它的结构13。RTX毒素的结构组成通常是在蛋白的C末端附近富含重复序列LIFGGXGNDDX14。RTX毒素在多种病原菌中都有论述,如霍乱弧菌、胸膜肺炎放线杆菌和大肠杆菌O157H714、15、16，RODKHUM（2006）首次报道了鳗弧菌的RTX毒素基因RTXA、RTX毒素转运基因RTXB、RTX毒素激活蛋白基因RTXC和RTX毒素转运基因RTXD17。222粘附因子（ADHERENCECLONIZATIONFACTOR）鳗弧菌
21、主要是在皮肤和消化道经粘附感染的。在该阶段，细菌鞭毛（FLAGELLUM）及菌毛PILUS有重要的作用。鳗弧菌的鞭毛是感染鱼类的毒力细胞器,MILTON等认为由鳗弧菌FLAA基因编码的40KU的鞭毛蛋白是细菌毒力所必需，而且FLAA还和另外3个分子量为41KU、42KU和45KU的鞭毛蛋白有关18。实验证明FLAA必须越过鱼类体表这一屏障,在对宿主的侵袭中起重要作用18。而另外3个分子量鞭毛蛋白与鳗弧菌的毒力有关13。鳗弧菌的菌毛毒力机制的影响目前还尚不清楚。RODKHUM鉴别出鳗弧菌与霍乱弧菌和创伤弧菌具有很高相似性的菌毛基因IV型菌毛亚单位生物合成蛋白基因PILC、IV型菌毛装配蛋白基因P
22、ILB和IV型菌毛装配蛋白PILQ17。223侵袭因子（INVASIONFACTOR）NORQVIST分离到一个有侵袭缺陷的鳗弧菌突变株，并从胞外产物中分离鉴别了一个与侵袭力有关的锌金属蛋白酶（EMPA），分子量为36KD，它需要ZN2的激活，稳定性与CA2有关19。遗传研究资料表明锌金属蛋白酶与鳗弧菌NB10的侵袭机制有关，是鳗弧菌感染过程中很重要的毒力因子，它的表达需要S、群体感应分子和鱼类胃肠粘液的存在20。224细胞表面成分（CELLSURFACECOMPONENTS）主要表面抗原在鱼类感染过程中被表达,鞭毛鞘结构在侵袭的最初阶段是不起作用的,而是在鱼类爆发性系统感染时起协同作用21。
23、研究发现鳗弧菌表面抗原脂多糖与血细胞凝集活性有关，在细菌的粘附过程中发挥作用。脂多糖是革兰氏阴性细菌的外膜主要组份，O特异性多糖链具有亲水性，带负电荷，可保护细菌抵抗吞噬细胞的吞噬作用，O抗原的多样化，使细菌免遭机体内已存在的抗体和消化酶的作用，对细菌本身有保护作用。脂多糖也是细菌主要的致病因子。脂多糖的类脂A8可引起宿主产生非特异性的病理生理反应（内毒素反应）。MONTERO和AUSTIN等的研究表明脂多糖是哈维氏弧菌E2对对虾的致死性毒素的组成部分22。225铁吸收系统（IRONUPTAKESYSTEM）铁摄取能力是病原菌在宿主体内生存能力的一个重要方面。鳗弧菌存在一条特殊的铁摄取途径通过
24、质粒编码的的铁摄取系统进行。质粒编码的铁离子吸收系统由铁载体ANGUIBACTIN和特殊的铁离子转运蛋白组成。含有毒力质粒的鳗弧菌能够利用氯高铁血红素和血红蛋白作为自身新陈代谢的离子源23,从载铁蛋白螯合物的周质中形成铁ANGUIBACTIN复合物从而摄取铁离子。质粒编码的铁吸收系统在缺铁的环境中能得到高效表达，而铁调节基因的表达与调控非常复杂，它涉及到细菌细胞的信号转导、转录控制及转录后调节等过程。铁转运系统在铁离子有限的条件下被最大量的表达,ANGR蛋白和TAF区域产物协同正向调节这一系统的表达在二价铁离子存在条件下,FUR蛋白和反义RNARNA介导铁离子转运基因的反向调节,高浓度的铁本身
25、也会关闭这一系统许多基因的表达,这个过程与FUR蛋白一起行使抑制功能23。23鳗弧菌的验证方法目前,鳗弧菌的检测方法报道有很多，免疫学检测如间接荧光抗体技术24、核酸杂交25,26及PCR检测27等，它们的灵敏度一般可达到每克鱼组织106个细菌，核酸杂交灵敏度可以达到150PG，但是免疫检测需要制备抗血清。近年来,不少学者以毒力基因设计引物进行PCR检测，RODKHUM针对鳗弧菌的五个溶血素基因设计引物进行多重PCR检测，这种方法不仅成功的在含有100FG染色体模板DNA中检测出溶血素基因，甚至能直接检测出仅含有10个鳗弧菌的临床样品。三、鳗弧菌的防治在预防方面，在保持良好环境和优良饵料的基础
26、上，可以根据具体情况对一些养殖种类进行接种疫苗或免疫增强剂，这是防治水产养殖动物疾病的安全有效的方法。虹鳟注射生长激素（GH）、左旋咪唑、壳多糖或口服转铁蛋白等都能增强对鳗弧菌的抵抗力。大西洋鲑腹腔注射酵母葡聚糖后，对鳗弧菌、杀鲑弧菌的抵抗力增强。据报道，使用壳多糖、肽聚糖、生长激素、转铁蛋白等免疫增强剂可以提高虹鳟的非特异性免疫功能，从而提高鱼体对鳗弧菌的抵抗能力；使用酵母葡聚糖可以明显提高大西洋鲑抗鳗弧菌的能力28。在治疗方面，由于使用方便、见效快和疗效好等优点，在相当长的时间内，使用抗生素仍是控制水产动物疾病的主要手段。张昕等测定了4种海洋致病弧菌对8种常用抗生素药物的敏感性，结果表明鳗
27、弧菌对庆大霉素敏感28。9四、展望目前对此种菌的诊断主要通过临诊病理观察及细菌学鉴定，防治方面也仅限于利用抗生素或减活、灭活疫苗29。在国内，海水鱼类的养殖过程中，频繁使用抗生素使致病菌产生耐药性，耐药质粒在细菌之间的水平传播给鱼病防治工作带来了新的挑战。近年来，随着分子生物学技术的发展，许多研究毒力基因的缺失和突变对菌株致病力的影响结果发现很多毒力基因和鳗弧菌的致病性直接相关。因此可以根据其基因的特性研制其防治方法。不过，到现在为止，还没有彻底阐明鳗弧菌的致病机理，所以对于毒力基因功能的研究还应该继续开展，在此基础上，制备具有强大检测功能的基因芯片，快速高通量的检测会缩短诊断时间，加快研制口
28、服和浸浴疫苗也是一种极具生产应用价值的防治途径。参考文献30EGIDIUSEVIBRIOSIS,PATHOGENICITYANDPATHOLOGY,ARENEWJAQUACULTURE,1987,67151831TORANZOAB,SANTOSY,BARJAJIIMMUNIZATIONWITHBACTERIALANTIGENSVIBRIOINFECTIONSJDEVBIOLSTAND,1997,909310532布坎南RE，吉本斯NE中国科学院微生物研究所伯杰细菌鉴定手册编译组译伯杰细菌鉴定手册M第八版北京科学出版社,1984PP47548133MILTONDL,NORQVISTA,WOLFW
29、ATZHJOURNALOFBACTERIOLOGYM,1992,174227235724434BOESENHT,PEDERSENK,LARSENJL,ETALBOESENHT,PEDERSENK,LARSENJL,ETALINFECTIMMUNJINFECTIMMUN,1999,6729430135KUSUDAR,KAWAIKGYOBYOKENKYUM,1998,3322136孟思妤，孟长明，陈昌福鳗弧菌（VIBRIOANGUILLARUM）的病原生物学研究现状（上）J渔业致富指南，FISHERYGUIDETOBERICH，2010，（01）636437莫照兰，茅云翔，陈师勇，张培军一株牙鲆皮
30、肤溃烂症病原菌的鉴定J微生物学报，2002，（03）38高冬梅，李健，王群鳗弧菌灭活疫苗对牙鲆免疫效果的研究J海洋水产研究，2004，25（1）48649239肖慧，李军，徐怀恕等鲈鱼苗烂鳃、烂尾病病原的研究J青岛海洋大学报，1999，29（1）8940夏永娟，黄威权，姜国良鳗弧菌感染牙鲆的组织学及组织化学观察J海洋科学，2000，24（10）414441陈吉祥，于德华，李绮鱼类病原鳗弧菌致病相关因子及分子生物学J海洋科学2003，10（08）42LALLYET,HILLRB,KIEBAIR,ETALTHEINTERACTIONBETWEENRTXTOXINSANDTARGETCELLSJTR
31、ENDSINMICROBIOLOGY,1999,735636143BOARDMANBK,FULLERSKJJOURNALOFBACTERIOLOGYM,2004,186238137814344JARMAE,CORRADINOG,REGASSALBANAEROBIOSIS,GROWTHPHASEANDACTINOBACILLUSPLEUROPNEUMONIAERTXTOXINPRODUCTIONJMICROBPATHOG,2004,371293345CORTAJARENAAL,GONIFM,OSTOLAZAHHIS859ISANESSENTIALRESIDUEFORTHEACTIVITYANDP
32、HDEPENDENCEOFESCHERICHIACOLIRTXTOXINALPHAHAEMOLYSINJJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY,2002,27726232232322946RODKHUMC,STORKHM,LORENZOMD,ETALJOURNALOFFISHDISEASESM,2006,291576647MILTONDL,TOOLER,HORSTEDTP,ETALFLAGELLINAISESSENTIALFORTHEVIRULENCEOFVIBRIOANGUILLARUMJJOURNALOFBACTERIOLOGY,1996,17851310131948NO
33、RQVISTA,NORRMANB,IDENTIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFAZINCMETALLOPROTEASEASSOCIATEDWITHINVASIONBYTHEFISHPATHOGENVIBRIOANGUILLARUMJWOLFWATZHINFECTIONANDIMMUNITY,1990,58113731373649DENKINSM,NELSONDRREGULATIONOFVIBRIOANGUILLARUMEMPAMETALLOPROTEASEEXPRESSIONANDITSROLEINVIRULENCEJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMI
34、CROBIOLOGY,2004,7074193420450NORQVISTA,WOLFWATZHIDENTIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFAZINCMETALLOPROTEASEASSOCIATEDWITHINVASIONBYTHEFISHPATHOGENVIBRIOANGUILLARUMJINFECTIONANDIMMUNITY,1993,6162434244451MONTEMAB,AUSTINBCHARACTERIZATIONOFEXTRACELLULARPRODUCTSFROMANISOLATEOFVIBRIOHARVEYIRECOVEREDFROMDISEA
35、SEDPOSTLARVALPENATUSINRMAMEIBORNEJJOURNALOFFISHDISEASES,1999,2237738652HOMEMT,BAXENDEATHEADHESIONOFVIBRIOONGUILLARUMTOHOSTTISSUESANDITSROLESINPATHOGENESISJJFISHDISEASE,1983646147153OLSSONJC,JOBOMA,WESTERDAHLA,ETALISTHETURBOT,SCOPHTHALMUSL,INTESTINEAPARTIALOFENTRYFORTHEFISHPATHOGENVIBRIOANGUILLANUNJJ
36、FISHDISEASE,1996,1922523454ACTISLA,TOLMASKYME,CROSALM,ETALCHARACTERIZATIONANDREGULATIONOFTHEEXPRESSIONOFFATB,ANIRONTRANSPORTPROTEINENCODEDBYTHEPJM1VIRULENCEPLASMIDJMOLMICROBIAL,111995,17119720455余俊红，姚斐，俞勇等应用间接荧光抗体技术快速检测花鲈病原菌鳗弧菌J海洋水产研究，2002，23（2）384456GONZALEZSF,OSORIOCR,SANTOSYJOURNALOFFISHDISEASEM,
37、2004,271161762157孟思妤，孟长明，陈昌福鳗弧菌（VIBRIOANGUILLARUM）的病原生物学研究现状（下）J渔业致富指南，FISHERYGUIDETOBERICH，2010，（01）636458黄琪淡主编，水产动物疾病学J上海科学技术出版社，1996，12612812本科毕业设计（20_届）自制鳗弧菌卵黄抗体抑菌效果研究目录1引言152试验材料及仪器1521试验材料1522试验仪器163试验方法1631菌株处理1632体外抑菌实验1633体内抑菌实验174实验结果与讨论1841特异卵黄抗体对鳗弧菌的体外抑菌效果1842特异卵黄抗体对感染鳗弧菌的克氏原螯虾的保护作用1943讨
38、论205小结2251结论2252展望22致谢错误未定义书签。参考文献24摘要目的研究抗鳗弧菌（VIBRIOANGUILLARUM）鸡卵黄抗体IGY的体内、外抑菌效果。方法分别将鳗弧菌高免卵黄抗体、普通卵黄抗体与2103CFU/ML的鳗弧菌悬液等体积混合0、1小时后，对混合液中的活菌总数进行计数、比较，以测定IGY在体外的抑菌效果；分别将鳗弧菌高免卵黄抗体、普通卵黄抗体、生理盐水与1108CFU/ML的鳗弧菌悬液等体积混合均匀后，注射入克氏原螯虾体内，观察其死亡情况，以测定其体内抑菌效果。结果实验表明与普通卵黄抗体相比，鳗弧菌高免卵黄抗体与新鲜培养的活鳗弧菌菌液混合中和后，表现出了明显的抑菌活性
39、；注射特异性鳗弧菌卵黄抗体对感染鳗弧菌的小龙虾具有明显的保护作用，具体表现为延缓小龙虾的死亡，以及降低死亡率，而普通卵黄抗体对其没有作用。关键词鳗弧菌卵黄抗体体内抑菌；体外抑菌ABSTRACTPURPOSERESEARCHTHEBACTERIOSTATICEFFECTOFANTIVIBRIOANGUILLARUMIGYINVITROANDINVIVOMETHODSTODETERMINETHEBACTERIOSTASISEFFECTINVITRO,SPECIFICANTIVIBRIOANGUILLARUMIGYANDNONSPECIFICIGYWERERESPECTIVELYMIXEDWITH2
40、103CFU/MLBACTERIALSUSPENSIONINEQUALVOLUME0AND1HOURLATER,THETOTALNUMBEROFLIVINGBACTERIUMINTHEMIXTUREWERECOUNTEDANDCOMPAREDTODETERMINETHEBACTERIOSTASISEFFECTINVIVO,SPECIFICANTIVIBRIOANGUILLARUMIGY,NONSPECIFICIGYANDNORMALSALINEWERERESPECTIVELYMIXEDWITH1108CFU/MLBACTERIALSUSPENSION,THENINJECTEDINTOCRAYF
41、ISHPROCAMBARUSCLARKIIDEATHSITUATIONWASOBSERVEDANDRECORDRESULTSCOMPAREDWITHNONSPECIFICIGY,SPECIFICANTIVIBRIOANGUILLARUMIGYSHOWEDOBVIOUSBACTERIOSTATICACTIVITYINVITROCOMPAREDWITHNONSPECIFICIGYANDNORMALSALINE,SPECIFICANTIVIBRIOANGUILLARUMIGYPROTECTEDCRAYFISHESBYDELAYINGDEATHANDREDUCEMORTALITYKEYWORDSVIB
42、RIOANGUILLARUMIGYBACTERIOSTATICINVITROINVIVO151引言鳗弧菌（VIRIOANGUALLANIM）是一种对水产鱼类危害严重的细菌性病原，其传播区域广泛，能引起世界范围内的淡、海水鱼类及其它养殖动物发生弧菌病，常给水产养殖业造成巨大的经济损失1。它还可通过食物链感染人类，使人发生较严重的疾病2。鳗弧菌的致病性与许多毒力因子有关，包括由质粒编码的铁吸收系统、细胞外溶血毒素、细菌鞭毛蛋白、胞外蛋白酶等3。随着我国养殖业的不断发展，由于水体生态环境恶化和水产养殖动物的高密度人工养殖，使鳗弧菌引起的养殖鱼、虾类疾病发生状况日趋严重，它能引起虾类黄鳃病4；感染大菱
43、鲆，使其出现全身性的出血及败血症5引起牙鲆鳍部严重出血以及体表溃烂6等病症，发病严重时往往造成鱼、虾类的大批死亡，给水产养殖业造成巨大的冲击。目前，养殖基层对鱼、虾类鳗弧菌病的防治主要是使用抗生素。然而，抗生素虽有使用方便、见效快和疗效好等优点，但在实际生产中存在盲目使用和滥用药物的现象，不仅破坏了生态环境的平衡，导致生物产生耐药性，而且其残留的药物也会危及人类健康7。因此，探讨其它的治疗途径是一种必然的研究趋势。卵黄抗体EGGYOLKANTIBODIES,IGY是存在于鸡、鸭、鹅等蛋禽卵黄中的一种抗体，也称卵黄免疫球蛋白EGGYOLKIMMUNOGLOBULINS,IGY8，是从特定抗原免疫
44、禽类的禽蛋黄中提取、制备的具有高效价的抗体，具有均一性好，对热、酸和碱稳定性好等优点9。自1893年KLEMPERER首次报道鸡蛋中存在抗体以来，卵黄抗体的研究不断深入，目前在卵黄抗体的形成、生物学特性等方面已研究的比较清楚，并且卵黄抗体作为诊断试剂和防治药物的研究愈来愈受到关注10。许多研究结果证实，特异性卵黄抗体用于预防和治疗动物和人类的某些疾病有很好的效果1117。如18张英等的研究发现小鹅瘟卵黄抗体对小鹅瘟的预防保护率为988，治疗有效率为952；范文明等1993应用鸭肝炎DH高免IGY治疗DH，疗效达90以上；范文明等1993应用混合抗原制备了鸡传染性法氏囊病（IBD）高免IGY，对
45、IBD的疗效达90以上。卵黄抗体用于人、畜、禽类疫病防治方面已有许多应用于生产中，如用于紧急预防和治疗传染性法氏囊病（IBD）、新城疫（ND）等疫病的IGY，效果很好11。鉴于此，抗鳗弧菌卵黄抗体的对鳗弧菌的抑制效果以及对动物的保护效果十分值得研究。本研究的目的是借鉴陆生畜禽相关研究的成功经验，以纯培养的鳗弧菌作为抗原，探讨鳗弧菌IGY的抑菌效果，以期为鳗弧菌引起的疾病的生物防治工作奠定基础，创造社会、经济及生态效益。2试验材料及仪器21试验材料211鳗弧菌（VANGUALLANIM）鳗弧菌菌种为实验室中由香鱼中分离、纯化、鉴定后低温保存的菌种（史雨红老师提供）。菌种经活化后，28下、振荡培养
46、过夜后即得实验所用菌悬液。16212抗鳗弧菌卵黄抗体实验室自制（由慈溪益大养殖厂购得200D的龄产蛋鸡，于第三次免疫后10天收集的鸡蛋经过卵黄分离、卵黄液稀释、抗体沉淀、抗体透析等步骤，并经过相关的效价检测后得到实验所需的卵黄抗体，低温存放）。其效价为110240，浓度为80MG/L。213普通卵黄抗体实验室自制（未经鳗弧菌免疫的鸡蛋的鸡蛋经过卵黄分离、卵黄液稀释、抗体沉淀、抗体透析等步骤，提取得到）。214克氏原螯虾于菜市场购得的健康克氏原螯虾，实验室暂养。215培养基LB培养基配制，酵母膏5G，蛋白胨10G，NACL10G琼脂17G，加双重水至1000ML，调PH至72。固体培养基每升加琼
47、脂17G。22试验仪器试管、烧杯、培养皿、磁力搅拌器、电子天平、PH计、高压灭菌锅、针式滤器（022UM）、移液器、漩涡振荡器、注射器（1ML）、培养箱、离心机等。3试验方法31菌株处理将低温保存的菌种接种于LB液体培养基，于28，160R/MIN振荡培养过夜，进行活化。将活化后的菌悬液按1100比例稀释后在28、振荡培养7H。取培养的菌悬液100UL，加入装有900UL的LB液体培养基EP管中充分混匀此为101稀释液，以次类推制成102、103、104、105、106、107、108几种稀释度的菌悬液，取106、107、108三个稀释度，分别取100UL涂布在LB固体培养基上，涂匀，置需氧条
48、件下，28倒置培养24H后，菌落计数得到菌悬液的浓度19。期间菌悬液存放入4冰箱备用。32体外抑菌实验321卵黄抗体的处理将实验室自制的低温保存的高免蛋黄抗体和普通卵黄抗体充分溶化，然后经022UM无菌针式滤头过滤后备用。322菌悬液的处理取存于冰箱的菌悬液，根据其计数情况用LB液体培养基调整浓度至2103CFU/ML，备用。323体外抑菌实验本实验方案借鉴谢献胜等人描述的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的体外抑菌试验20方法，进行相应简化而来。其具体操作步骤如下。17表1体外抑菌实验处理TAB1TREATMENTINVITROANTIBACTERIALEXPERIMENT处理组别高免卵黄抗体（ML）普
49、通卵黄抗体（ML）2103CFU/ML菌悬液（ML）菌计数前抗体、菌液混合时间（H）阳性1110阳性2111阴性1110阴性2111取上述混合液各100UL培养液滴加到LB固体培养基上，涂匀，置需氧条件下，28培养24H后，菌落计数，并换算为活菌浓度（CFU/ML）。对比、分析各组结果。计算公式每毫升样品中活菌数同一稀释度3次重复的平均菌落数1033体内抑菌实验331克氏原螯虾的预感染实验取2108CFU/ML菌悬液在5000G离心约3MIN后，弃去上清液，以09生理盐水重悬至相同浓度，混匀，备用。参考文献21，取4只克氏原螯虾，在第3腹节肌肉处注射大约02ML/尾的鳗弧菌菌悬液，进针角度约15，深度35MM，然后观察其死亡情况21。332中和试验（1）鳗弧菌及抗体的处理取三只试管分别做以下操作（表2），然后将试管内混合液均混匀，备用。表2体内抑菌实验处理TAB2TREATMENTINVIVOANTIMICROBIALEXPERIMENTS处理组别高免卵黄抗体普通卵黄抗体液09生理盐水鳗弧菌菌悬液1108CFU/ML阳性1ML1ML阴性1ML1ML空白1ML1ML（2）实验处理取在实验室暂养1周的
