1、本科毕业论文系列开题报告生物工程雨生红球藻色素分析一、选题的背景与意义虾青素是发现于某些水生动物体内的一种酮式类胡萝卜素，又名虾黄素，是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，超强的抗氧化活性赋予了虾青素突出的生理功能，如提高动物免疫力、抑制肿瘤、清除自由基和活性氧等。虾青素具有广泛的应用价值，不仅可以用作水产养殖的饵料添加剂、人的食品添加剂，在药品、化妆品和高级营养保健品等领域也有非常大的应用潜力。雨生红球藻是一种单细胞淡水绿藻，其在多种不适宜生长的外界环境条件下都会在细胞核周围的细胞质基质中加速积累次生类胡萝卜素，其中80以上为虾青素及其酯类。雨生红球藻中虾青素的积累量可高达细胞干质量的4，是
2、其他生物虾青素合成积累量的一到几个数量级，是目前首选的天然虾青素合成生物。目前虾青素作为天然色素和生物活性物质受到了极大的重视，具有广阔的应用前景和巨大的市场潜力。随着人们对雨生红球藻虾青素认识的逐步清晰以及对虾青素在雨生红球藻中积累的分子机制研究如虾青素合成酶基因应答环境胁迫的表达调控机制将会是新一轮研究的热点，也将是根本性地改变雨生红球藻虾青素生产限制问题的唯一途径。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的内容利用UPLCQTOFMS分析系统，建立雨生红球藻色素的分析方法；利用建立的方法对雨生红球藻生活周期不同阶段进行色素组成及结构分析。主要解决问题1、确立雨生红球藻色素提取方法；2、建
3、立雨生红球藻色素分析方法；3、利用建立的方法对雨生红球藻生活周期不同阶段进行色素组成及结构分析，特别是虾青素及其酯类化合物的结构分析与定量。三、研究的方法与技术路线研究的方法本研究首先收集雨生红球藻生长周期不同阶段的藻样，即对数期（绿色或游动孢子期）、绿色向红色转化时期（即刚开始积累虾青素时）、不动细胞时期（全部转红），然后提取色素，最后用高效液相色谱质谱技术对叶绿素、虾青素及其它类胡萝卜素进行结构鉴定及定量分析。技术路线四、研究的总体安排与进度2010年11月2012月15日更多地收集并阅读与该课题相关的中英文资料，对实验进行设计并制订出详细的研究方案，撰写开题报告与文献综述。2010年12
4、月15日2月28日充分阅读相关的文献，翻译2篇英文文献。开始雨生红球藻的培养和收集实验。2011年3月1日4月15日建立色素提取方法及色素分析方法，上样分析，统计分析相关的数据，开始撰写论文初稿交导师评阅。2011年4月16日21日在导师指导下修改论文，完成二稿，交指导师再次修改。2011年4月21日5月2日查找论文中的不足，完善论文并定稿，参加论文答辩。五、主要参考文献收集雨生红球藻生长周期不同阶段的藻样提取雨生红球藻色素建立雨生红球藻色素UPLCQTOFMS分析方法分析被测微藻中色素的组成和结构培养雨生红球藻1SANTOSMF,MESQUITAJFULTRASTRUCTURALSTUDYO
5、FHAEMATOCOCCUSLACUSTRISGIROD，ROSTAFINSKIVOLVOCALESSOMEASPECTSOFCAROTENOGENESISJCYTOLOGIA,1984,492152282LEEYK,SOHCWACCUMULATIONOFASTAXANTHININHAEMATOCOCCUSLACUSTRISCHLOROPHYTAJJPHYCOL,1991,275755773LEEYK,DINGSYEFFECTOFDISSOLVEDOXYGENPARTIALPRESSUREONTHEACCUMULATIONOFASTAXANTHININCHEMOSTATCULTURESOFHA
6、EMATOCOCCUSLACUSTRISCHLOROPHYTAJJPHYCOL,1995,319229244BOUSSIBAS,VONSHAKAASTAXANTHINACCUMULATIONINTHEGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJPLANTCELLPHYSIO,1991,32107710825KOBAYASHIM,KAKIZONOTGROWTHANDASTAXANTHINFORMATIONOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISINHETEROTROPHICANDMIXOTROPHICCONDITIONSJJFERMENTBIOENG,1992,741
7、7206KOBAYASHIM,KAKIZONOT,NAGAISENHANCEDCAROTENOIDBIOSYNTHESISBYOXIDATIVESTRESSINACETATEINDUCEDCYSTCELLSOFAGREENUNICELLULARALGA,HAEMATOCOCCUSPLUVIALISJAPPLENVIRONMICROBIOL,1993,598678737BOROWITZKAMA,HUISMANJM,OSBORNACULTUREOFTHEASTAXANTHINPRODUCINGGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJ,JAPPLPHYCOL,1991,329
8、53048TJAHJONOAE,HAYAMAYHYPERACCUMULATIONOFASTAXANTHININAGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISATELEVATEDTEMPERATURESJBIOTECHNOLLETT,1994,161331389OROSAM,FRANQUEIRAD,CIDA,ETALANALYSISANDENHANCEMENTOFASTAXANTHINACCUMULATIONINHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJBIORESOURTECHNOL,2005,96337337810KOBAYASHIM,HIRAINABSCISICACI
9、DDEPENDENTALGALMORPHOGENESISINTHEUNICELLULARGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJPLANTGROWTHREGUL,1997,22798511LUF,VONSHAKA,BOUSSIBASEFFECTOFTEMPERATUREANDIRRADIANCEONGROWTHOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISCHLOROPHEAEJJPHYCOL,1994,3082983312KOBAYASHIM,KURIMURAYLIGHTINDEPENDENTASTAXANTHINPRODUCTIONBYTHEGREENMICROA
10、LGAEHAEMATOCOCCUSPLUVIALISUNDERSALTSTRESSJBIOTECHNOLLETT,1997,1950750913KOBAYASHIM,SAKAMOTOYSINGLETOXYGENQUENCHINGABILITYOFASTAXANTHINESTERSFROMTHEGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJBIOTECHNOLLETT,1999,2126526914GUDINC,CHAUMONTDCELLFRAGILITYTHEKEYPROBLEMOFMICROALGAEMASSPRODUCTIONINCLOSEDPHOTOBIOREACTOR
11、SJBIORESOURCETECHNOLOGY,1991,3814515115SUNZ,CUNNINGHAMFX,GANTTEDIFFERENTIALEXPRESSIONOFTWOISOPENTENYLPYROPHOSPHATEISOMERASESANDENHANCEDCAROTENOIDACCUMULATIONINAUNICELLULARCHLOROPHYTEJPROCNATLACADSCI,1998,95114821148816STEINBRENNERJ,LINDENHREGULATIONOFTWOCAROTENOIDBIOSYNTHESISGENESCODINGFORPHYTOENESY
12、NTHASEANDCAROTENOIDHYDROXYLASEDURINGSTRESSINDUCEASTAXANTHINFORMATIONINTHEALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJ,PLANTPHYSIOL,2001,12581081717GRUNEWALDK,ECKERTM,HIRSCHBERGJ,ETALPHYTOENEDESATURASEISLOCALIZEDEXCLUSIVELYINTHECHLOROPLASTANDUPREGULATEDATTHEMRNALEVELDURINGACCUMULATIONOFSECONDARYCAROTENOIDSINHAEMATOCO
13、CCUSPLUVIALISVOLVOLCALES,CHLOROPHYCEAEJPLANTPHYSIOL,2000,1221261126818LOTANT,HIRSCHBERGJCLONINGANDEXPRESSIONINESCHERICHIACOLIOFTHEKETOCAROTENOIDCANTHAXANTHININHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJFEBSLETT,1995,36412512819GRUNEWALDK,HIRSCHBERGJ,HAGENCKETOCAROTENOIDBIOSYNTHESISOUTSIDEOFPLASTIDSINTHEUNICELLULARGREEN
14、ALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJJBIOLCHEM,2001,27686023602920HUANGJC,CHENGF,SANDMANNBGSTRESSRELATEDDIFFERENTIALEXPRESSIONOFMULTIPLECAROTENEKETOLASEGENESINTHEUNICELLULARGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJJOURNALOFBIOTECHNOLOGY,2006,12217618521STEINBRENNERJ,LINDENHLIGHTINDUCTIONOFCAROTENOIDBIOSYNTHESISGENESIN
15、THEGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISREGULATIONBYPHOTOSYNTHETICREDOXCONTROLJPLANTMOLBIOL,2003,52234335622刘建国,孙艳妮,殷明焱等无机碳与雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS细胞调节物质J海洋与湖沼,2004,545946623庄惠如,卢海声等雨生红球藻营养细胞的虾青素累积J水生生物学报,2001,25437637824MKOBAYASHI,YKURIMURA,YSAKAMOTOETALSELECTIVEEXTRACTIONOFASTAXANTHINANDCHLOROPHYLLF
16、ROMTHEGREENALGAEHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJBIOTECHNOLOGYTECHNIQUES,1997,11965766025金传荫,宋立荣等红球藻水生748株HAEMATOCOCCUSSPHB748培养基的选择与对维生素B12的需求J应用与环境生物学报,1997,32177179毕业论文文献综述生物工程雨生红球藻虾青素分析【摘要】虾青素是一种酮式类胡萝卜素，具有很强的抗氧化能力。在特定条件下，雨生红球藻可以积累占其干重1以上的虾青素，且所含虾青素的结构与养殖对象所需一致，被公认为天然虾青素的最好生物来源。本文将从虾青素的结构与功能、在雨生红球藻体内的积累机制，
17、提取方法几方面做简要介绍。【关键词】虾青素；雨生红球藻；结构及功能；积累；提取虾青素是发现于某些水生动物体内的一种酮式类胡萝卜素，又名虾黄素，是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，超强的抗氧化活性赋予了虾青素突出的生理功能，如提高动物免疫力、抑制肿瘤、清除自由基和活性氧等。虾青素具有广泛的应用价值，不仅可以用作水产养殖的饵料添加剂、人的食品添加剂，在药品、化妆品和高级营养保健品等领域也有非常大的应用潜力。雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS是一种单细胞淡水绿藻，其在多种不适宜生长的外界环境条件下都会在细胞核周围的细胞质基质中加速积累次生类胡萝卜素1，其中80以上为虾青素及其酯
18、类2。雨生红球藻中虾青素的积累量可高达细胞干质量的4，是其他生物虾青素合成积累量的一到几个数量级，是目前首选的天然虾青素合成生物。1虾青素的结构及功能虾青素是一种酮式类胡萝卜素，又名虾黄素，化学名称为3，3二羟基4，4二酮基，胡萝卜素，分子式为C40H52O4，相对分子质量为596。11虾青素的化学结构111立体异构体虾青素有两个手性或不对称中心，他们是分子中两端环结构的C3和C3。一个手性中心可以有两种构象，虾青素的两个手性碳原子C3、C3都能以R或S存在，这样就有3种立体异构体3S、3S，、3S、3R和3R、3R（见下图1）。112几何异构体与CC双键结合的原子的排列方式是可以完全不同的，
19、因为原子不能绕双键扭曲或旋转，除非双键断裂重排。如果两个基团位于双键的同一侧称为Z结构，过去称为顺式CIS结构；如果两个基团位于双键的对应面称为E结构，过去称为反式TRAN结构。虾青素在其分子的线型部分有多个双键，每个双键都可以是Z式或E式，全E结构是最稳定的结构。现已发现，天然虾青素中9、13和15位有Z式结构，因此虾青素可能的几何异构体有全E、9Z、13Z、15Z、9Z、13Z、9Z、15Z、13Z、15Z和9Z、13Z、15Z等。12虾青素的功能121抗氧化作用虾青素是一类断链抗氧化剂，具有强的抗氧化性能、清除体内自由基、延缓衰老的作用。虾青素可清除NO2、硫化物、二硫化物，也可通过AM
20、VN降低脂质过氧化作用，保护蛋黄中磷脂酰胆碱脂质免受过氧化基团氧化，整合进膜系统的虾青素也表现出对脂质体的保护作用。虾青素比胡萝卜素抑制光敏氧化作用的能力强。122抗癌作用天然类胡萝卜素具有抗癌作用，虾青素具有很强的抗癌作用。虾青素可保护皮肤免受紫外线的损害，作为潜在的光保护剂，用于阻止皮肤的光老化和防止诱发皮肤癌。123预防动脉硬化和相关疾病临床医学研究表明，低密度脂蛋白的氧化是导致动脉硬化的重要原因。虾青素在体内具有显著升高高密度脂蛋白和降低低密度脂蛋白的功效，而胡萝卜素和角黄素则无此作用，因此推测虾青素能减轻载脂蛋白的氧化，可用做预防动脉硬化、冠心病和缺血性脑损伤的制剂。124维护眼睛和
21、中枢神经系统的健康最近的研究表明，虾青素能通过血脑屏障，有效防止视网膜的氧化和感光器细胞的损伤，说明虾青素在预防和治疗“年龄相关性黄斑变性”、改善视网膜功能方面具有良好效果。虾青素具有保护中枢神经系统的能力，尤其是大脑和脊柱，能有效治疗缺血性的重复灌注损伤、脊髓损伤、PARKINSON氏综合症、ALZHEIMER氏综合症等中枢神经系统损伤。125其他应用虾青素具有最佳诱导细胞分裂的活性和重要的免疫调节作用，可以作为免疫增强剂，提高免疫力。使用虾青素作为水生动物必需的维生素，对其正常生长和健康养殖，提高存活率和繁殖率，具有极为重要的作用。虾青素作为蛋禽和家畜工业的饲料添加剂，可使禽及家畜的成活率
22、提高，染病率下降，他还可提高禽类卵子的受精率、产蛋率。2虾青素在雨生红球藻内的积累机制近年来，国内外从与虾青素合成有关的诱导条件、红球藻细胞的光合变化、以及合成酶表达的分子调控等方面进行了分析研究，目前已经有大量相关的实验报道。下面分别从几个方面对目前所取得的进展做一综述。211光照光照是红球藻诱导虾青素大量积累最重要的因子，高强度光照下虾青素的合成会得到促进。许多研究者认为，红球藻中虾青素大量合成的诱发因子可能是光合反应引起的氧胁迫，而不是光本身3，4。尽管高光照强度是虾青素合成的重要因子，但光照并不是虾青素合成的必要条件，在异养条件下没有光照条件它也能以较慢的速度合成虾青素5。212温度红
23、球藻适宜的生长温度为20左右，提高温度有利于红球藻中虾青素的积累6。BOROWITZKA等7观察到红球藻在15时基本上全部表现为绿色的游动细胞；培养温度高到25时，有部分细胞转化成积累大量虾青素的红色厚壁孢子；而在28培养20D，细胞全部转化成了厚壁孢子。TJAHJONO等8认为高温促进了活性氧的产生，而活性氧最终有利于虾青素的高积累。另外也可能是较高的培养温度抑制了红球藻细胞的正常分裂生长，从而使虾青素的相对含量提高。213营养盐在雨生红球藻的培养中，氮缺乏会引起红球藻中虾青素的大量积累。如在OROSA等9的实验中，在0、015、025、05G/L等不同NANO3浓度下每个细胞中的虾青素合成
24、量分别为245、55、06和0PG。合成类胡萝卜素的前体化合物如甲羟戊酸盐、丙酮酸盐对虾青素的合成起促进作用。当向红球藻生长相中加入或多或少的醋酸盐时，会很快诱导运动细胞向厚壁孢子转变并加速积累虾青素，但醋酸盐的浓度对虾青素的合成量影响不大10，11，虾青素的合成可能受到碳氮比的影响7。二价铁离子能够加强醋酸盐对虾青素合成的促进作用，这种促进作用不要求蛋白质的从头合成，推测其机理可能是由于FE2的加入引起虾青素合成酶系活化，但这种促进作用受到自由基HO的猝灭剂KI的抑制。高磷促进虾青素的合成，高磷对虾青素积累的促进作用与细胞分裂速度无关。但其他实验结果却表明磷缺乏时会引起虾青素的积累，尽管在此
25、胁迫条件下细胞分裂停止，但这种积累可以一直持续到细胞停止分裂后21D，说明在此条件下虾青素的积累可能不仅与细胞的停止分裂有关。对这两种相互矛盾的实验结果目前还没有可信的解释。一定浓度081的NACL有利于虾青素的合成3，8。但在虾青素的合成同时，伴随着细胞分裂的停止，因而，NACL可能是通过阻止细胞的分裂来间接影响虾青素的含量的。214活性氧很多实验表明红球藻中虾青素的合成与体内的活性氧基团有关。活性氧能促进红球藻中虾青素的合成，但这一促进作用是直接导致虾青素的积累还是一种间接效果目前还没有足够证据。也有大量的实验可以作为活性氧与虾青素合成有关的间接证据，即诱导虾青素积累的多种环境胁迫可以同时
26、诱导产生活性氧，如高光强3，干燥10，高盐12，高温9等。众多研究者认为虾青素的合成是红球藻细胞对逆境产生的氧胁迫的适应反应。KOBAYASHI等13的实验中富含虾青素的厚壁细胞比虾青素含量较低的游动细胞更能忍耐过量的活性氧，这从另一方面提示了虾青素可能是应氧胁迫而产生的。215细胞分裂抑制剂BOUSSIBA和VONSHAK3为了分析红球藻的细胞分裂与虾青素积累之间的关系，研究了细胞分裂抑制剂长春碱对虾青素积累的影响。结果表明，在2MG/L和5MG/L的浓度处理下细胞分裂完全被抑制，随后12D单个细胞中虾青素的含量也随即开始上升。216其它因素除以上各影响因素外，干燥10、机械胁迫14等也会促
27、进虾青素的积累。22虾青素积累的分子机制目前已有人从虾青素合成酶系基因的表达水平上分析影响虾青素合成的调控机制1521。STEINBRENNER和LINDEN16用NORTHERN杂交的方法研究了虾青素合成酶基因PSY和从CRTZ在不同环境胁迫下的表达情况。在最有效的虾青素诱导条件同时施加醋酸钠、硫酸亚铁和强光照射时，48H内PSY和从CRTZ的MRNA水平都有一个稳定的大幅度上升，而虾青素在诱导72H后达到最高水平135MG/G。这说明环境胁迫下虾青素的合成调控至少是部分发生在合成酶基因的转录水平上。只施加强光照射或只添加醋酸钠时，该两酶的MRNA水平也都有一定程度的上升，但转录量低且转录较
28、晚，虾青素的最终积累量也较低，说明高强度光照有利于虾青素的积累但不是诱导虾青素积累的唯一和必要条件。在同样的诱导条件下，光合电子传递链抑制剂的加入抑制了该两酶基因的转录，说明虾青素的合成还是需要一定的光合量支持。二价铁离子的添加与否，不影响这两个酶的MRNA水平，但虾青素的积累量却有很大差别，说明FE2对虾青素合成的影响不发生在转录水平上，这印证了KOBAYASHI等的研究结果。同样，在GRUNEWALD等17的实验中也观察到，在胁迫条件下虾青素合成酶基因PDS和CRTO的基因转录水平均上调。在施加强光和氮缺失的诱导条件后15D，CRTOMRNA的含量在单个细胞中持续上升，4D后达到最高水平与
29、此同时，细胞内类胡萝卜素的含量也在同步上升。在诱导条件下，PDS的MRNA转录量也呈线性上升，4D后达到最大值，随后缓慢下降。在此期间，作者也检测到细胞内该两酶酶量的增加。这说明，胁迫条件下，虾青素的合成也是受PDS和CRTO酶基因的转录调控的。HUANG等20也通过实验证实了在光照或醋酸盐胁迫下，雨生红球藻中虾青素的快速积累伴随着三个2胡萝卜素酮化酶基因表达量的急剧增加。SUN等15的实验中发现，在强光诱导下，IPP异构酶的MRNA和325KU蛋白的水平都有一个明显的提高。由此可见，红球藻中虾青素的积累与合成酶基因MRNA转录水平上的调控有关。但高强度光照、醋酸盐等诱导条件是如何刺激次生类胡
30、萝卜素合成酶基因的转录刘建国等22发现在细胞培养液中会积累一种脂溶性的信号物质，诱导了富含虾青素的不动细胞的生成。STEINBRENNER和LINDEN通过不同的电子传递链抑制剂的作用发现番茄红素环化酶基因LCYB以及PSY、PDS和CRTZ在环境胁迫下的上调表达受细胞光合氧化还原状态控制，信号物质为电子传递链中的质体醌。3虾青素的提取根据雨生红球藻的生活周期，主要分为营养细胞和厚壁孢子。一般认为当环境有利时，主要以绿色、能运动的藻体形式存在；当环境不利时，形成厚壁孢子并大量累积虾青素23。雨生红球藻的厚壁孢子具有坚韧的细胞壁，若直接利用，则其生物有效利用率低，且坚韧的细胞壁也可阻碍有机溶剂进
31、入细胞内提取虾青素24。因此在虾青素提取前必须对孢子态细胞进行破壁处理，以破坏雨生红球藻的细胞结构。31高压均质最佳工艺条件根据高压均质原理，通过选定均质压力、均质次数、均质温度和空列四因素三水平的L934正交设计表，研究均质条件对细胞破壁率和虾青素提取率的影响，以选取最佳均质工艺条件。分析结果表明，均质压力和次数对破壁率及虾青素提取率均有较显著的影响，而均质温度影响不大，可在室温条件下操作。破壁率和虾青素提取率均随均质压力和次数的增大而增大。经过40MPA、3次均质后，雨生红球藻破壁率可达914。32超声波的破壁条件超声波破壁常用频率为1525KHZ。根据文献25报道，在固定超声波频率作用下
32、，超声波作用强度和时间是超声波破壁的主要影响因素。超声波作用强度和时间对细胞破壁率的影响呈线性关系，即超声波强度越大，作用时间越长，破壁率越高。但虾青素的提取率却不随作用强度和时间的增大而增大。在25W最大强度下超声波作用1530MIN，虾青素的提取率达到最大值。当作用强度超过25W、作用时间超过30MIN，虾青素的提取率反而降低。33冷冻温度和时间对虾青素提取率的影响冻融法也常用于细胞破壁。根据冻融破壁的主要影响因素，研究结果表明，冷冻时间和冷冻温度对虾青素提取率无明显影响。4展望目前虾青素作为天然色素和生物活性物质受到了极大的重视，具有广阔的应用前景和巨大的市场潜力。随着人们对雨生红球藻虾
33、青素认识的逐步清晰以及对虾青素在雨生红球藻中积累的分子机制研究如虾青素合成酶基因应答环境胁迫的表达调控机制将会是新一轮研究的热点，也将是根本性地改变雨生红球藻虾青素生产限制问题的唯一途径。参考文献1SANTOSMF,MESQUITAJFULTRASTRUCTURALSTUDYOFHAEMATOCOCCUSLACUSTRISGIROD，ROSTAFINSKIVOLVOCALESSOMEASPECTSOFCAROTENOGENESISJCYTOLOGIA,1984,492152282LEEYK,SOHCWACCUMULATIONOFASTAXANTHININHAEMATOCOCCUSLACUSTR
34、ISCHLOROPHYTAJJPHYCOL,1991,275755773LEEYK,DINGSYEFFECTOFDISSOLVEDOXYGENPARTIALPRESSUREONTHEACCUMULATIONOFASTAXANTHININCHEMOSTATCULTURESOFHAEMATOCOCCUSLACUSTRISCHLOROPHYTAJJPHYCOL,1995,319229244BOUSSIBAS,VONSHAKAASTAXANTHINACCUMULATIONINTHEGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJPLANTCELLPHYSIO,1991,32107710
35、825KOBAYASHIM,KAKIZONOTGROWTHANDASTAXANTHINFORMATIONOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISINHETEROTROPHICANDMIXOTROPHICCONDITIONSJJFERMENTBIOENG,1992,7417206KOBAYASHIM,KAKIZONOT,NAGAISENHANCEDCAROTENOIDBIOSYNTHESISBYOXIDATIVESTRESSINACETATEINDUCEDCYSTCELLSOFAGREENUNICELLULARALGA,HAEMATOCOCCUSPLUVIALISJAPPLENVIRON
36、MICROBIOL,1993,598678737BOROWITZKAMA,HUISMANJM,OSBORNACULTUREOFTHEASTAXANTHINPRODUCINGGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJ,JAPPLPHYCOL,1991,32953048TJAHJONOAE,HAYAMAYHYPERACCUMULATIONOFASTAXANTHININAGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISATELEVATEDTEMPERATURESJBIOTECHNOLLETT,1994,161331389OROSAM,FRANQUEIRAD,CID
37、A,ETALANALYSISANDENHANCEMENTOFASTAXANTHINACCUMULATIONINHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJBIORESOURTECHNOL,2005,96337337810KOBAYASHIM,HIRAINABSCISICACIDDEPENDENTALGALMORPHOGENESISINTHEUNICELLULARGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJPLANTGROWTHREGUL,1997,22798511LUF,VONSHAKA,BOUSSIBASEFFECTOFTEMPERATUREANDIRRADIANCEO
38、NGROWTHOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISCHLOROPHEAEJJPHYCOL,1994,3082983312KOBAYASHIM,KURIMURAYLIGHTINDEPENDENTASTAXANTHINPRODUCTIONBYTHEGREENMICROALGAEHAEMATOCOCCUSPLUVIALISUNDERSALTSTRESSJBIOTECHNOLLETT,1997,1950750913KOBAYASHIM,SAKAMOTOYSINGLETOXYGENQUENCHINGABILITYOFASTAXANTHINESTERSFROMTHEGREENALGAHAEMA
39、TOCOCCUSPLUVIALISJBIOTECHNOLLETT,1999,2126526914GUDINC,CHAUMONTDCELLFRAGILITYTHEKEYPROBLEMOFMICROALGAEMASSPRODUCTIONINCLOSEDPHOTOBIOREACTORSJBIORESOURCETECHNOLOGY,1991,3814515115SUNZ,CUNNINGHAMFX,GANTTEDIFFERENTIALEXPRESSIONOFTWOISOPENTENYLPYROPHOSPHATEISOMERASESANDENHANCEDCAROTENOIDACCUMULATIONINAU
40、NICELLULARCHLOROPHYTEJPROCNATLACADSCI,1998,95114821148816STEINBRENNERJ,LINDENHREGULATIONOFTWOCAROTENOIDBIOSYNTHESISGENESCODINGFORPHYTOENESYNTHASEANDCAROTENOIDHYDROXYLASEDURINGSTRESSINDUCEASTAXANTHINFORMATIONINTHEALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJ,PLANTPHYSIOL,2001,12581081717GRUNEWALDK,ECKERTM,HIRSCHBERGJ,
41、ETALPHYTOENEDESATURASEISLOCALIZEDEXCLUSIVELYINTHECHLOROPLASTANDUPREGULATEDATTHEMRNALEVELDURINGACCUMULATIONOFSECONDARYCAROTENOIDSINHAEMATOCOCCUSPLUVIALISVOLVOLCALES,CHLOROPHYCEAEJPLANTPHYSIOL,2000,1221261126818LOTANT,HIRSCHBERGJCLONINGANDEXPRESSIONINESCHERICHIACOLIOFTHEKETOCAROTENOIDCANTHAXANTHININHA
42、EMATOCOCCUSPLUVIALISJFEBSLETT,1995,36412512819GRUNEWALDK,HIRSCHBERGJ,HAGENCKETOCAROTENOIDBIOSYNTHESISOUTSIDEOFPLASTIDSINTHEUNICELLULARGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJJBIOLCHEM,2001,27686023602920HUANGJC,CHENGF,SANDMANNBGSTRESSRELATEDDIFFERENTIALEXPRESSIONOFMULTIPLECAROTENEKETOLASEGENESINTHEUNICELLUL
43、ARGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJJOURNALOFBIOTECHNOLOGY,2006,12217618521STEINBRENNERJ,LINDENHLIGHTINDUCTIONOFCAROTENOIDBIOSYNTHESISGENESINTHEGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISREGULATIONBYPHOTOSYNTHETICREDOXCONTROLJPLANTMOLBIOL,2003,52234335622刘建国,孙艳妮,殷明焱等无机碳与雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS细胞调节物质J海洋与湖沼,200
44、4,545946623庄惠如,卢海声等雨生红球藻营养细胞的虾青素累积J水生生物学报,2001,25437637824MKOBAYASHI,YKURIMURA,YSAKAMOTOETALSELECTIVEEXTRACTIONOFASTAXANTHINANDCHLOROPHYLLFROMTHEGREENALGAEHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJBIOTECHNOLOGYTECHNIQUES,1997,11965766025金传荫,宋立荣等红球藻水生748株HAEMATOCOCCUSSPHB748培养基的选择与对维生素B12的需求J应用与环境生物学报,1997,32177179本科毕业
45、设计（20届）雨生红球藻色素分析目录中英文摘要（ABSTRACT）1引言12实验部分221雨生红球藻的培养和处理222仪器与试剂223实验方法3231色谱和质谱条件3232标准溶液的配制3233样品处理33结果与讨论331类胡萝素及虾青素酯的分离332雨生红球藻色素鉴定3321游离类胡萝卜素3322虾青素酯4323叶绿素633雨生红球藻色素的定量6331定量标准曲线、方法检测限及回收率测定6332样品测定64结论7致谢7参考文献8摘要雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS是一种单细胞淡水绿藻，其在多种不适宜生长的外界环境条件下都会在细胞核周围的细胞质基质中加速积累次生类胡萝卜素
46、。本研究旨在建立一种分析鉴定雨生红球藻色素的方法。液相色谱能够将色素各组分在进入APCIMS/MS前进行有效的分离，一共鉴定得到5种游离类胡萝素，15种虾青素单酯以及2种叶绿素。同时，对提取物中虾青素各组分进行定量，定量曲线在010G/ML浓度范围内线性相关系数为09986，该方法的检测限为002G/ML，雨生红球藻虾青素回收率达9247985。通过建立的方法对培养的雨生红球藻色素提取物进行测定，得到虾青素各组分的相对含量。该方法灵敏、准确，能够满足国内外的限量要求，可用于虾青素含量检验，对研究雨生红球藻虾青素积累机理等意义重大。关键词雨生红球藻；色素；种类组成；定量分析ABSTRACTHAE
47、MATOCOCCUSPLUVIALISISAKINDOFSINGLECELLEDFRESHWATERALGAE,WHOSEGROWTHWILLACCELERATETHEACCUMULATIONOFSECONDARYCAROTENOIDSAROUNDTHENUCLEUSOFTHECELLMATRIXUNDERAVARIETYOFINAPPROPRIATEEXTERNALENVIRONMENTALCONDITIONSTHEAIMOFTHISSTUDYWASTOESTABLISHAMETHODFORANALYZINGANDIDENTIFYINGPIGMENTINHAEMATOCOCCUSPLUVIA
48、LISAFTERFIRSTBEINGANALYZEDBYHPLC,5FREECAROTENOIDS,15ASTAXANTHINMONOESTERSAND2CHLOROPHYLLINHAEMATOCOCCUSPLUVIALISWEREIDENTIFIEDBYLIQUIDCHROMATOGRAPHYATMOSPHERICPRESSURECHEMICALIONIZATIONMASSSPECTROMETRYLCAPCIMSLINEARITYOFTHEMETHODWASGOODWITHCORRELATIONCOEFFICIENTSR2OF09986INTHERANGEOF0TO10G/MLMORETHE
49、LOWDETECTIONLIMITWAS002G/MLTHEOBTAINEDRECOVERIESVARIEDBETWEEN9247TO985USINGTHISMETHOD,ASTAXANTHININEXTRAVTSOFHPLUVIALSWEREDETERMINEDITWASDEMONSTRATEDTOBEAPOWERFULTOOLFORANALYSISOFTHESTRUCTUREANDCOMPOSITIONOFASTAXANTHINESTERSINHPLUVIALISWHATSMORE,ITWASHELPFULTOSTUDYTHEMECHANISMOFASTAXANTHINACCUMULATIONINHPLUVIALISKEYWORDSHAEMATOCOCCUSPLUVIALISPIGMENTSPECIFICCOMPOSITIONQUANTITATIVEANALYSIS161引言雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS是一种单细胞淡水绿藻，其在多种不适宜生长的外界环境条件下都会在细胞核周围的细胞质基质中加速积累次生类胡萝卜素，其中80以上为虾青素及其脂类1。虾青素是发现于某些水生动物体内的一种酮式类胡萝卜素，又名虾黄素，是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，超强的抗氧化活性赋予了虾青素突出的生理功能，如提高动物免
