1、本科毕业论文系列开题报告生物工程鱼类嗅觉上皮细胞免疫荧光标记研究一、选题的背景与意义自然界中存在大量的气味成分，为什么动物能感受到这些气味呢为了揭示这个秘密，很多研究者已经开对嗅觉系统进行系统地研究，包括从哺乳动物到鱼类，都做了大量的研究。由于嗅觉受体是G蛋白耦合受体，目前已经有人用哺乳动物的G蛋白制备的抗体可以在鲶鱼与金鱼的嗅觉神经元细胞中检测到。大黄鱼是我国特有的经济鱼类，属于海洋性鱼类，本研究通过免疫荧光的方法对大黄鱼的嗅觉神经元进行G蛋白检测，观察三类G蛋白在大黄鱼嗅觉神经元细胞中的分布情况。了解大黄鱼嗅觉神经元细胞的内部结构与特点，从而对大黄鱼摄食生理学提供理论基础。二、研究的基本内
2、容与拟解决的主要问题（一）基本内容本实验通过对鱼类嗅觉器官尤其是大黄鱼嗅觉器官的解剖及观察，并通过免疫荧光标记法检测大黄鱼的嗅觉神经元中是否含有与以下三类嗅觉神经元纤毛嗅觉神经元、微绒毛嗅觉神经元、隐窝嗅觉神经，有关的气味受体及G蛋白。（二）拟解决的主要问题1、细胞组织的冷冻包埋方法2、冷冻切片的技术应用3、免疫荧光反应的实际操作4、嗅觉神经元G蛋白的研究5、观察实验结果后，与鲶鱼嗅觉组织进行比对，总结异同三、研究的方法与技术路线研究方法本实验应用4的多聚甲醛（PFA）对已经采集到的嗅觉器官固定后，用冷冻包埋剂（OCT）低温中包埋。然后应用冷冻切片技术将处理好的嗅觉组织切成1020微米的片状。
3、最后通过免疫或发反应，利用一抗与二抗的孵育并通过DAPI4,6联脒2苯基吲哚细胞核负染。最后在荧光显微镜下拍照观察。技术路线四、研究的总体安排与进度2010年9月10月查阅文献，收集相关资料2010年10月11月设计实验的宏观设计路线，制定大体实验步骤2010年11月2011年2月进行试验，收集实验数据2011年2月4月数据整理，总结实验，论文写作五、主要参考文献1ADRIAN,ED,1951THESENSEOFSMELLMEDJAUST2,1702BUCK,L,AXEL,R,1991ANOVELMULTIGENEFAMILYMAYENCODEODORANTRECEPTORSAMOLECULA
4、RBASISFORODORRECOGNITIONCELL65,1751874ZOU,Z,HOROWITZ,LF,MONTMAYEUR,JP,SNAPPER,S,BUCK,LB,2001GENETICTRACINGREVEALSASTEREOTYPEDSENSORYMAPINTHEOLFACTORYCORTEXNATURE414,1731793RESSLER,KJ,SULLIVAN,SL,BUCK,LB,1994INFORMATIONCODINGINTHEOLFACTORYSYSTEMEVIDENCEFORASTEREOTYPEDANDHIGHLYORGANIZEDEPITOPEMAPINTHE
5、1、样品的采集2、嗅觉器管解剖分离3、采集嗅觉器官固定、包埋4、冰冻切片5、免疫组化反应6、荧光显微镜拍照OLFACTORYBULBCELL79,124512555HAMDANI,EH,KASUMYAN,A,DVING,KB,2001BISFEEDINGBEHAVIOURINCRUCIANCARPMEDIATEDBYTHELATERALOLFACTORYTRACTCHEMSENSES26,113311386KYLE,AL,SORENSEN,PW,STACEY,NE,DULKA,JG,1987MEDIALOLFACTORYTRACTPATHWAYSCONTROLLINGSEXUALREFLEXE
6、SANDBEHAVIORINTELEOSTSANNNYACADSCI519,971077SORENSEN,PW,FINE,JM,DVORNIKOVS,V,JEFFREY,CS,SHAO,F,WANG,JZ,VRIEZE,LA,ANDERSON,KR,HOYE,TR,2005MIXTUREOFNEWSULFATEDSTEROIDSFUNCTIONSASAMIGRATORYPHEROMONEINTHESEALAMPREYNATCHEMBIOL1,3243288STACEY,NE,KYLE,AL,1983EFFECTSOFOLFACTORYTRACTLESIONSONSEXUALANDFEEDING
7、BEHAVIORINTHEGOLDFISHPHYSIOLBEHAV30,6216289WELTZIEN,F,HOGLUND,E,HAMDANI,EH,DVING,KB,2003DOESTHELATERALBUNDLEOFTHEMEDIALOLFACTORYTRACTMEDIATEREPRODUCTIVEBEHAVIORINMALECRUCIANCARPCHEMSENSES28,29330010DVING,KB,1986FUNCTIONALPROPERTIESOFTHEFISHOLFACTORYSYSTEMINOTTOSON,DED,PROGRESSINSENSORYPHYSIOLOGY,VOL
8、6SPRINGERVERLAG,BERLIN,PP3910411THOMMESEN,G,1983MORPHOLOGY,DISTRIBUTION,ANDSPECIFICITYOFOLFACTORYRECEPTORCELLSINSALMONIDFISHESACTAPHYSIOLSCAND117,24124912YAMAMOTO,M,UEDA,K,1979COMPARATIVEMORPHOLOGYOFFISHOLFACTORYEPITHELIUMXPERSIFORMES,BERYCIFORMES,SCORPAENIFORMES,ANDPLEURONECTIFORMESJFACSCITOKYOUNIV
9、SECIVZOOL14,27329713HANSEN,A,ELLER,P,FINGER,TE,ZEISKE,E,1997THECRYPTCELLAMICROVILLOUSCILIATEDOLFACTORYRECEPTORCELLINTELEOSTFISHESCHEMSENSES22,69469514HANSEN,A,FINGER,TE,2000PHYLETICDISTRIBUTIONOFCRYPTTYPEOLFACTORYRECEPTORNEURONSINFISHESBRAINBEHAVEVOL55,10011015HAMDANI,EH,ALEXANDER,G,DVING,KB,2001APR
10、OJECTIONOFSENSORYNEURONSWITHMICROVILLITOTHELATERALOLFACTORYTRACTINDICATESTHEIRPARTICIPATIONINFEEDINGBEHAVIOURINCRUCIANCARPCHEMSENSES26,1139114416MORITA,Y,FINGER,TE,1998DIFFERENTIALPROJECTIONSOFCILIATEDANDMICROVILLOUSOLFACTORYRECEPTORCELLSINTHECATFISH,ICTALURUSPUNCTATUSJCOMPNEUROL398,53955017HAMDANI,
11、EH,DVING,KB,2002THEALARMREACTIONINCRUCIANCARPISMEDIATEDBYOLFACTORYNEURONSWITHLONGDENDRITESCHEMSENSES27,39539818HAMDANI,EH,LASTEIN,S,GREGERSEN,F,DVING,KB,2006SEASONALVARIATIONSINTHEAPPEARANCEOFCRYPTCELLSINTHEOLFACTORYEPITHELIUMOFTHECRUCIANCARPIN17THCONGRESSOFTHEEUROPEANCHEMORECEPTIONRESEARCHORGANIZAT
12、ION,GRANADA,SPAIN,PPP12619STROTMANN,J,KONZELMANN,S,BREER,H,1996LAMINARSEGREGATIONOFODORANTRECEPTOREXPRESSIONINTHEOLFACTORYEPITHELIUMCELLTISSUERES284,34735420INAMURA,K,MATSUMOTO,Y,KASHIWAYANAGI,M,KURIHARA,K,1999LAMINARDISTRIBUTIONOFPHEROMONERECEPTIVENEURONSINRATVOMERONASALEPITHELIUMJPHYSIOL517PT3,731
13、73921HANSEN,A,ANDERSON,KT,FINGER,TE,2004DIFFERENTIALDISTRIBUTIONOFOLFACTORYRECEPTORNEURONSINGOLDFISHSTRUCTURALANDMOLECULARCORRELATESJCOMPNEUROL477,34735922CAO,Y,OH,BC,STRYER,L,1998CLONINGANDLOCALIZATIONOFTWOMULTIGENERECEPTORFAMILIESINGOLDFISHOLFACTORYEPITHELIUMPROCNATLACADSCIUSA95,119871199223SPECA,
14、DJ,LIN,DM,SORENSEN,PW,ISACOFF,EY,NGAI,J,DITTMAN,AH,1999FUNCTIONALIDENTIFICATIONOFAGOLDFISHODORANTRECEPTORNEURON23,48749824SATO,Y,MIYASAKA,N,YOSHIHARA,Y,2005MUTUALLYEXCLUSIVEGLOMERULARINNERVATIONBYTWODISTINCTTYPESOFOLFACTORYSENSORYNEURONSREVEALEDINTRANSGENICZEBRAFISHJNEUROSCI25,4889489725PFISTER,P,RO
15、DRIGUEZ,I,2005OLFACTORYEXPRESSIONOFASINGLEANDHIGHLYVARIABLEV1RPHEROMONERECEPTORLIKEGENEINFISHSPECIESPROCNATLACADSCIUSA102,5489549426NIKONOV,AA,FINGER,TE,CAPRIO,J,2005BEYONDTHEOLFACTORYBULBANODOTOPICMAPINTHEFOREBRAINPROCNATLACADSCIUSA102,186881869327JEFFERIS,GSXE,HUMMEL,T,2006WIRINGSPECIFICITYINTHEOL
16、FACTORYSYSTEMSEMINCELLDEVBIOL17,5028NIKONOVAA,CAPRIOJ2001ELECTROPHYSIOLOGICALEVIDENCEFORACHEMOTOPYOFBIOLOGICALLYRELEVANTODORSINTHEOLFACTORYBULBOFTHECHANNELCATFISHJNEUROPHYSIOL8618691876毕业论文文献综述生物工程鱼类嗅觉受体和G蛋白的研究摘要最新的研究结果表明，在解剖和生理功能方面，鱼的嗅觉系统是由三个平行的经由嗅球到达端脑的神经通路组成的。这里有三种形态类型的神经元看似重叠的分布在嗅上皮上。每一种感觉神经元的轴突
17、都汇集到一个特定的嗅球区域并且与独立的中继神经元相联系。每一个中继神经元的轴突离开嗅球并且到达端脑每一个嗅球表达了不同的信息，从而引发了对于日常生活中不同气味的不同特征的反应。这三个通路分别关系到社会行为，性行为以及捕食行为。关键字嗅觉系统气味受体传单通路行为五十年代初期LORDADRIAN说明了，不同的气味能在不同的程度上引起脊椎动物的嗅觉活动1。从那以后，空间概念的气味，成为了气味辨别能力的研究主题。由于对嗅觉受体的探索2，我们对于这一问题的认识有了很大的进步，随后证明，嗅觉神经元ORNS表达了一个特定气味受体汇合于两个嗅球给并给人一种刻板的空间图3。对于特定嗅觉受体的功能以及如何将信息传
18、达到更高级的大脑中心我们也有了更加深刻的认识4。然而，我们发现在哺乳动物中关于气味及气味受体与行为之间的关系仍然是一个复杂的问题。在硬骨鱼类中，其行为模式与饲养，繁殖，以及报警是不同的，它们可以被量化并可以被适当的气味唤醒。在一些科的鱼类中还有很长的不同于端脑和神经束的嗅觉通道。这种结构上的特征可以为我们在嗅觉组织的功能研究上提供巧妙的应用1、日常生活中的气味人们普遍承认，生命活动取决于三个基本过程繁殖，喂养及逃避。在鱼类中，这些功能都可以通过不同种类的分子经由嗅觉系统进行调节，分子包括氨基酸，胆盐，信息素。然而，气味混合在它们的自然环境中，鱼怎么能区分这复杂的气味，以及鱼如何知道在不同的季节
19、进行适当的行为模式呢换句话说，是什么机制决定行为的层次在这里，我们提出的解剖和生理调查结果，即可能为我们如何看待鱼的气味环境形成一个基本的认识。2、解剖学欧洲鲫鱼的暴露大脑嗅觉系统如下（图1）。正如所有脊椎动物的初级感觉神经元位于感觉上皮，在鱼类中由于该组织像片层结构的叶，类似于一个微型月季故被称为嗅觉花环。这种有薄的感觉神经元轴突且终止于突触结构的特定突触结构称为嗅觉神经小球。在这里有总数达几千个的突触末端以及极少的一些次级神经突触。传递神经的突触经由嗅觉束到大脑中更高级的中心。这种嗅觉束在鲤科鱼类中被分为几个过程进入并终止于大脑的不同地区的神经束。在鳕鱼和鲶鱼中也发现了类似的嗅觉束。这些长
20、的嗅觉束是通往中枢神经的通路，由于它们的长度使他们适合解剖56789和生理记录10图13、感觉神经元在鱼类中建立的细胞集合并关系着气味的神经元够成三个不同形状的类型。第一种感觉神经元有着较长的树突和一些纤毛；第二种感觉神经元的顶面微绒毛神经元的树突较纤毛细胞短且在其表面有波状的的延伸1112；第三种类型称为隐窝细胞1314。这些细胞呈球形或梨形，接近上皮细胞表面还附着了一些纤毛。由于不同长度，不同类型的树突、位于不同深度范围的体细胞和感觉上皮伪分层现象的形成，这些可以在在嗅球组织中通过亲脂碳菁染料示踪法（DII）的应用显示出来1516图二。隐窝细胞的形态不同，通常存在于第一层神经元和胞体层，在
21、图二中表示为2和3。2属于微绒毛神经元的类型。4和5属于的感觉神经元和神经元胞体中的纤毛。图二4、嗅觉系统中的通路嗅觉神经元与不同的神经束之间的关系是什么在每一个嗅觉通路中三个神经束的存在和三形态学不同的感觉神经元可能是单纯的巧合，但它也反映了功能的区分。我们试图通过DII荧光在嗅球组织中的应用来得出这个问题的答案。如果应用得当，染色会都从突触沿初级神经元和次级神经元的突触扩散到周边上皮。这两种神经元的轴突组成嗅觉通道。做一个理想的假设，这两种神经元在相同的准备条件下，应当一直联系到次级神经。在这些研究中这是一个必要的基本条件。DII荧光染色实验结果揭示了一个在上表皮神经元细胞中体细胞的位置和
22、轴突对嗅球的反映的变数。纤毛神经元IMOT终止于轴突建立于中间嗅觉束的中间位置的次级神经元17，隐窝细胞（LOT）终止于构成了侧面中心嗅觉通路的次级神经元18，同时微绒毛神经元（MMOT）终止于构成外侧嗅束的次级神经元15。图3说明了这些研究。图4说明了研究结果总结。图三图四由于不同神经通路束介导不同的行为，它意味着，在生物界，几种不同的重要气味应该对应几种不同的神经元。纤毛感觉神经元响应胆盐，这是重要的迁移过程并在皮肤的报警物质中发现；隐窝细胞响应了性行为，微绒毛感觉神经元响应食物的气味。因此，鱼的嗅觉系统被看作是三个平行的通路从感觉上皮经由嗅球到达端脑。我们发现在嗅觉神经受体神经体细胞的片
23、层位置与小鼠嗅觉上皮的嗅觉神经体细胞表达出了相同的受体基因，并且这些基因在嗅觉上皮被分为不同的片层19。此外，INAMURA等20表明，在鼠犁鼻神经上皮细胞，感觉神经元体细胞对不同的泌尿信息素敏感，并且被局限在分开的片层中。5、嗅觉受体神经元中的分子实体每个感觉神经元只表达一个特定气味受体，似乎随机分布在神经上皮。然而，他们有组织的以一种固定的方法将轴突发送到嗅球。由于感觉神经元在形态和延髓反映上的不同，这是合理的假设，它们不同还在于G蛋白的表达和气味受体分子。这一概念已被许多研究证实了的，揭露出了感觉神经元形态学的相互关系，例如气味受体分子的类型和G蛋白表达。因此，纤毛神经元表达OR类型的味
24、觉受体和GOLF/S21。转导途径是环核苷酸途径2223。微绒毛神经元表达V2R类型的气味受体和GAO,GAQ以及GAI321以及瞬时受体可能是C2途径（TRPC2）24。隐窝细胞表达GO和GQ转导蛋白21。最近，众所周知，V1R受体类型在啮齿类动物的犁鼻器官中被表达出并且可以调节信息素信息，这一现象同样也被证实在鱼类中23。一个明显的现象是大部分表达VIR受体的神经元位于上皮细胞的顶层，最有可能是隐窝细胞。不同类型感觉神经元之间的关系，味觉受体以及G蛋白列于表1。6、结论和观点综上所述，这个研究阐明了一个鱼类嗅觉系统中的显著区别。有三种类型的感觉神经元，每一种都有着与其相匹配的受体以及G蛋白
25、，并表明了不同的传导机制。这些感觉神经元在上皮看似随意的分布，但每一类感觉神经元都可以产生对突触和神经嗅球的刺激。有趣的是，到端脑的部分又分为三束并且联系到日常生活的调节信息，即饲养，繁殖和报警。在这样的系统中传递信息是与繁殖行为相关的，在雌性鲫鱼中有一种传递神经只与其四种性行为中的一种相关。这种现象不会在雄性的嗅觉系统中出现。这是一个关于在端脑中信息是如何被处理并且如何开始与嗅束上的嗅球进行神经联系的研究。端脑的神经生理记录表明了在端脑中不同气味的空间反射26。进一步的研究将解释不同的有关于发展与繁殖循环的气味信息是如何进行改变的。具不同形态类型的感觉神经元似乎是利用了不同的气味受体和传导机
26、制。这些最近的研究证实，每一个不同形态类型的感觉神经元表达了一类特定的的气味受体。因为这些感觉神经元随机分布在嗅上皮，人们可以期待一个在外围非空间的化学拓扑结构。当它们进入感觉神经元的的嗅球轴突表达了特定的受体并以“一个受体一个嗅球的方式”结合了单一的嗅球。这样的组织与在昆虫嗅觉系统中发现的相同27。这种的隐窝细胞外观的变化18会引发许多问题，例如，每个个体荷尔蒙状态对感觉神经元的表达以及气味受体的影响，包括对不同气味的敏感度，从而对行为反应和物种生态造成一定的影响。7、鲶鱼的嗅觉受体类型与功能之间的关系鱼的嗅觉受体的神经细胞上皮包含三个混合类型的嗅觉神经元即微绒毛嗅觉神经元、隐窝嗅觉神经元、
27、纤毛嗅觉神经元。本实验验证了不同的嗅觉神经元是否经由不同类别的受体分子和相应形态的G蛋白回应了不同类别的气味。在鲶鱼中，纤毛嗅觉神经元受体表达了OR类型的受体和GOLF。微绒毛嗅觉神经元是异构的，有许多GQ/11的表达。然而隐窝嗅觉神经元表达了G0，逆行试验追踪表明纤毛嗅觉神经元的主要任务是回应胆碱（内测的）和氨基酸（侧面的28。与此相反，微绒毛嗅觉神经元的任务几乎完全是作用于核苷酸和氨基酸占主导地位的嗅球的背面，这些解剖结果符合我们的药理结果，展示了福司可林对于胆碱回应的阻碍并且显著地降低了氨基酸的回应。相反，U73122和U73343减少氨基酸反应，但是对胆碱和核苷酸的反映基本保持不变。总
28、之，我们的结果表明，胆碱的主要检测是通过纤毛嗅觉神经元并依托GOLF/CAMP的信号传递链。核苷酸被微绒毛嗅觉神经元检测，既不需要利用GOLF/CAMP也不需要利用GQ/11/PLC的传递链。最后，氨基酸气味激活了纤毛和微绒毛嗅觉神经元但是经由两个不同类型细胞的传导通路。参考文献1ADRIAN,ED,1951THESENSEOFSMELLMEDJAUST2,1702BUCK,L,AXEL,R,1991ANOVELMULTIGENEFAMILYMAYENCODEODORANTRECEPTORSAMOLECULARBASISFORODORRECOGNITIONCELL65,1751874ZOU,Z
29、,HOROWITZ,LF,MONTMAYEUR,JP,SNAPPER,S,BUCK,LB,2001GENETICTRACINGREVEALSASTEREOTYPEDSENSORYMAPINTHEOLFACTORYCORTEXNATURE414,1731793RESSLER,KJ,SULLIVAN,SL,BUCK,LB,1994INFORMATIONCODINGINTHEOLFACTORYSYSTEMEVIDENCEFORASTEREOTYPEDANDHIGHLYORGANIZEDEPITOPEMAPINTHEOLFACTORYBULBCELL79,124512555HAMDANI,EH,KAS
30、UMYAN,A,DVING,KB,2001BISFEEDINGBEHAVIOURINCRUCIANCARPMEDIATEDBYTHELATERALOLFACTORYTRACTCHEMSENSES26,113311386KYLE,AL,SORENSEN,PW,STACEY,NE,DULKA,JG,1987MEDIALOLFACTORYTRACTPATHWAYSCONTROLLINGSEXUALREFLEXESANDBEHAVIORINTELEOSTSANNNYACADSCI519,971077SORENSEN,PW,FINE,JM,DVORNIKOVS,V,JEFFREY,CS,SHAO,F,W
31、ANG,JZ,VRIEZE,LA,ANDERSON,KR,HOYE,TR,2005MIXTUREOFNEWSULFATEDSTEROIDSFUNCTIONSASAMIGRATORYPHEROMONEINTHESEALAMPREYNATCHEMBIOL1,3243288STACEY,NE,KYLE,AL,1983EFFECTSOFOLFACTORYTRACTLESIONSONSEXUALANDFEEDINGBEHAVIORINTHEGOLDFISHPHYSIOLBEHAV30,6216289WELTZIEN,F,HOGLUND,E,HAMDANI,EH,DVING,KB,2003DOESTHEL
32、ATERALBUNDLEOFTHEMEDIALOLFACTORYTRACTMEDIATEREPRODUCTIVEBEHAVIORINMALECRUCIANCARPCHEMSENSES28,29330010DVING,KB,1986FUNCTIONALPROPERTIESOFTHEFISHOLFACTORYSYSTEMINOTTOSON,DED,PROGRESSINSENSORYPHYSIOLOGY,VOL6SPRINGERVERLAG,BERLIN,PP3910411THOMMESEN,G,1983MORPHOLOGY,DISTRIBUTION,ANDSPECIFICITYOFOLFACTOR
33、YRECEPTORCELLSINSALMONIDFISHESACTAPHYSIOLSCAND117,24124912YAMAMOTO,M,UEDA,K,1979COMPARATIVEMORPHOLOGYOFFISHOLFACTORYEPITHELIUMXPERSIFORMES,BERYCIFORMES,SCORPAENIFORMES,ANDPLEURONECTIFORMESJFACSCITOKYOUNIVSECIVZOOL14,27329713HANSEN,A,ELLER,P,FINGER,TE,ZEISKE,E,1997THECRYPTCELLAMICROVILLOUSCILIATEDOLF
34、ACTORYRECEPTORCELLINTELEOSTFISHESCHEMSENSES22,69469514HANSEN,A,FINGER,TE,2000PHYLETICDISTRIBUTIONOFCRYPTTYPEOLFACTORYRECEPTORNEURONSINFISHESBRAINBEHAVEVOL55,10011015HAMDANI,EH,ALEXANDER,G,DVING,KB,2001APROJECTIONOFSENSORYNEURONSWITHMICROVILLITOTHELATERALOLFACTORYTRACTINDICATESTHEIRPARTICIPATIONINFEE
35、DINGBEHAVIOURINCRUCIANCARPCHEMSENSES26,1139114416MORITA,Y,FINGER,TE,1998DIFFERENTIALPROJECTIONSOFCILIATEDANDMICROVILLOUSOLFACTORYRECEPTORCELLSINTHECATFISH,ICTALURUSPUNCTATUSJCOMPNEUROL398,53955017HAMDANI,EH,DVING,KB,2002THEALARMREACTIONINCRUCIANCARPISMEDIATEDBYOLFACTORYNEURONSWITHLONGDENDRITESCHEMSE
36、NSES27,39539818HAMDANI,EH,LASTEIN,S,GREGERSEN,F,DVING,KB,2006SEASONALVARIATIONSINTHEAPPEARANCEOFCRYPTCELLSINTHEOLFACTORYEPITHELIUMOFTHECRUCIANCARPIN17THCONGRESSOFTHEEUROPEANCHEMORECEPTIONRESEARCHORGANIZATION,GRANADA,SPAIN,PPP12619STROTMANN,J,KONZELMANN,S,BREER,H,1996LAMINARSEGREGATIONOFODORANTRECEPT
37、OREXPRESSIONINTHEOLFACTORYEPITHELIUMCELLTISSUERES284,34735420INAMURA,K,MATSUMOTO,Y,KASHIWAYANAGI,M,KURIHARA,K,1999LAMINARDISTRIBUTIONOFPHEROMONERECEPTIVENEURONSINRATVOMERONASALEPITHELIUMJPHYSIOL517PT3,73173921HANSEN,A,ANDERSON,KT,FINGER,TE,2004DIFFERENTIALDISTRIBUTIONOFOLFACTORYRECEPTORNEURONSINGOLD
38、FISHSTRUCTURALANDMOLECULARCORRELATESJCOMPNEUROL477,34735922CAO,Y,OH,BC,STRYER,L,1998CLONINGANDLOCALIZATIONOFTWOMULTIGENERECEPTORFAMILIESINGOLDFISHOLFACTORYEPITHELIUMPROCNATLACADSCIUSA95,119871199223SPECA,DJ,LIN,DM,SORENSEN,PW,ISACOFF,EY,NGAI,J,DITTMAN,AH,1999FUNCTIONALIDENTIFICATIONOFAGOLDFISHODORAN
39、TRECEPTORNEURON23,48749824SATO,Y,MIYASAKA,N,YOSHIHARA,Y,2005MUTUALLYEXCLUSIVEGLOMERULARINNERVATIONBYTWODISTINCTTYPESOFOLFACTORYSENSORYNEURONSREVEALEDINTRANSGENICZEBRAFISHJNEUROSCI25,4889489725PFISTER,P,RODRIGUEZ,I,2005OLFACTORYEXPRESSIONOFASINGLEANDHIGHLYVARIABLEV1RPHEROMONERECEPTORLIKEGENEINFISHSPE
40、CIESPROCNATLACADSCIUSA102,5489549426NIKONOV,AA,FINGER,TE,CAPRIO,J,2005BEYONDTHEOLFACTORYBULBANODOTOPICMAPINTHEFOREBRAINPROCNATLACADSCIUSA102,186881869327JEFFERIS,GSXE,HUMMEL,T,2006WIRINGSPECIFICITYINTHEOLFACTORYSYSTEMSEMINCELLDEVBIOL17,5028NIKONOVAA,CAPRIOJ2001ELECTROPHYSIOLOGICALEVIDENCEFORACHEMOTO
41、PYOFBIOLOGICALLYRELEVANTODORSINTHEOLFACTORYBULBOFTHECHANNELCATFISHJNEUROPHYSIOL8618691876本科毕业设计（20_届）大黄鱼嗅觉上皮细胞免疫荧光标记研究目录中英文摘要1引言12材料与方法221样品采集222实验试剂223实验设备324试验方法3241试剂制备3242样品的固定3243冰冻切片3244免疫组化反应4245荧光显微镜拍照43结果431GOLF/S的免疫组化反应532GO的免疫反应性633GQ/11的免疫反应性734在DAPI染色下，观察细胞核分布74讨论8致谢错误未定义书签。参考文献10附录错误未定
42、义书签。摘要鱼的嗅觉上皮包含三种不同类型的嗅觉受体神经元（ORNS）分别为纤毛嗅觉受体神经元，微绒毛嗅觉受体神经元和隐窝嗅觉受体神经元。由于嗅觉受体是G蛋白耦合受体，故本研究通过测试，以及免疫荧光的方法对大黄鱼这种我国特有的海洋经济鱼类的嗅觉神经元进行G蛋白检测，观察三类G蛋白在大黄鱼嗅觉神经元细胞中的分布情况。结果表明从浙江省宁波市象山县西沪港采样的大黄鱼的嗅觉上皮组织中存在着以下三种G蛋白分别为GOLF/S；GO；GQ/11。并且与这些ORNS的形态与细胞类型相对应。即，GOLF/S存在于纤毛ORNS的细胞膜中。GO大部分存在于隐窝ORNS细胞质中，少量存在于微绒毛ORNS中。GQ/11存
43、在于微绒毛ORNS细胞表面。并通过与鲶鱼嗅觉上皮组织中G蛋白的对比与比较分析，得出在大黄鱼嗅觉上皮中存在着与鲶鱼嗅觉上皮组织中相同的G蛋白，并发挥相似的功能。该实验所反映了大黄鱼嗅觉神经元细胞的内部结构与特点，对大黄鱼摄食生理学的深入研究提供理论基础。关键词嗅觉系统；嗅觉受体；G蛋白；免疫组化反映ABSTRACTFISHOLFACTORYEPITHELIUMCONTAINSTHREEDIFFERENTTYPESOFOLFACTORYRECEPTORNEURONSORNSARECILIATEDOLFACTORYRECEPTORNEURONS,OLFACTORYRECEPTORNEURONSOFM
44、ICROVILLIANDCRYPTOLFACTORYRECEPTORNEURONSTHEOLFACTORYRECEPTORSAREGPROTEINCOUPLEDRECEPTORS,THISSTUDYTESTED,ANDTHEMETHODOFIMMUNOFLUORESCENCETHATLARGEYELLOWCROAKERFISH,MARINEECONOMYOFCHINASPECIFICNEURONSINTHEOLFACTORYGPROTEINDETECTION,OBSERVEDTHREETYPESOFGPROTEININOLFACTORYNEURONSINFISHDISTRIBUTIONTHER
45、ESULTSSHOWEDTHATXIANGSHANCOUNTY,NINGBOCITY,ZHEJIANGPROVINCE,SAMPLEDTHEOLFACTORYEPITHELIUMOFLARGEYELLOWCROAKERTHEREAREABOUTTHREETYPESOFGPROTEINS,RESPECTIVELYGOLF/SGOGQ/11ANDMORPHOLOGYOFTHESEORNSCORRESPONDINGCELLTYPESTHATIS,GOLF/SPRESENTINTHEPLASMAMEMBRANEINCILIATEDORNSGOCRYPTORNSPRESENTINMOSTOFTHECYT
46、OPLASM,ASMALLAMOUNTPRESENTINTHEMICROVILLIOFORNSGQ/11ORNSPRESENTINTHECELLSURFACEMICROVILLIANDWITHTHECATFISHOLFACTORYEPITHELIUMINCONTRASTTOGPROTEINSANDCOMPARATIVEANALYSIS,THELARGEYELLOWCROAKERINTHEEXISTENCEOFOLFACTORYEPITHELIUMANDOLFACTORYEPITHELIUMOFCATFISHINTHESAMEGPROTEINS,ANDPLAYASIMILARFUNCTIONTH
47、EEXPERIMENTREFLECTSTHELARGEYELLOWCROAKERBYOLFACTORYNEURONSINTHEINTERNALSTRUCTUREANDCHARACTERISTICSOFFISHFEEDINGONTHELARGEDEPTHSTUDYOFPHYSIOLOGYTOPROVIDEATHEORETICALBASISKEYWORDSOLFACTORYSYSTEM；OLFACTORYRECEPTOR；GPROTEIN；IMMUNOHISTOCHEMISTRY11引言自然界中存在大量的气味成分，为什么动物能感受到这些气味呢为了揭示这个秘密，很多研究者已经开对嗅觉系统进行系统地研
48、究，包括从哺乳动物到鱼类，都做了大量的研究。脊椎动物的周边嗅觉系统由通过第一脑神经到嗅球OB传递信息的双极嗅觉受体神经元（ORNS）支配。ORNS既可以是纤毛也可以是微绒毛的1。在许多陆栖脊椎动物中，其中包括蛇和啮齿类动物，嗅觉受体神经元（ORNS）被隔离成两个分开的隔间微绒毛嗅觉受体神经元在犁鼻器VNO上，而纤毛嗅觉受体神经元（ORNS）主要填充嗅觉上皮细胞OE。在解剖学水平上2分子3，及其功能的研究4表明嗅觉受体神经元（ORNS）到OB和附属OB是一种气味筹划，也就是说，不同类ORNS对潜在的味道的特定的分子特征做出最佳反应以及设计有限数目的小球。此外，在啮齿类动物中，受体细胞的类型包括纤
49、毛和微绒毛，与在感觉传递中使用的受体分子的特定类型和G蛋白有一一对应的关系。主要的OE纤毛嗅觉受体神经元（ORNS）使用OR型受体5，这种受体耦合G蛋白GOLF6和主要OB。根据所需的G蛋白（GO与GI，VNO的微绒毛受体细胞分为两个级别并包括附属OB的不同位置7。最近的一项研究报道，GQ也被表达在啮齿动物的VNO中8。在缺乏一个VNO的脊椎动物，例如，鱼、鸟、猿猴、类人猿和人类中，微绒毛和纤毛嗅觉受体神经元（ORNS）都有相同的OE，诸如鱼9；鸟，猿猴、猿10；人类11。因为这些物种也缺乏一个附属OB，两者的受体细胞类型表达主要OB。此外，鱼的OE含有不是特别丰富的嗅觉受体神经元（ORNS）的第三种类型隐窝受体细胞12。虽然嗅觉受体神经元（ORNS）的这三个类型混合在一个OE里，但是OB里气温主题的代表的概念也能从鱼中获得13。最新的研究结果表明，在解剖和生理功能方面，鱼的嗅觉系统是由三个平行的经由嗅球到达端脑的神经通路组成的。这里有三种形态类型的神经元看似重叠的分布在嗅上皮上。每一种感觉神经元的轴突都汇集到一个特定的嗅球区域并且与独立的中继神经元相联系。每一个中继神经元的轴突离开嗅球并且到达端脑每
