1、本科毕业论文系列开题报告水产养殖曼氏无针乌贼HSP70克隆及序列分析一、选题的背景与意义热休克蛋白是生物体内与抗逆相关的一类十分重要的蛋白。除高温诱导外，许多损伤因素、应激刺激（如缺血、缺氧、重金属离子、氨基酸类似物、病毒感染、DNA损伤、自由基等）作用后，都可以导致细胞发生热休克反应（谷文萍,1999），诱导热休克蛋白的合成。在不同条件引起的热休克反应中，热休克蛋白发挥着多方面的作用（MARTIN,1999）。热休克蛋白超家族HEATSHOCKPROTEINSUPERFAMILY是一类进化上高度保守的蛋白。这个家族包括至少6个亚家族HSP110家族，HSP90家族，HSP70家族，HSP60
2、家族，HSP20家族（小热休克蛋白家族），泛素（UBIQUITIN）等。热休克蛋白70（HSP70）家族是热休克蛋白超家族的重要成员，分子量约为68KD74KD。热休克蛋白70除了具有分子伴侣的功能以外，在消除重金属污染对机体造成的损伤（URANI,2001WARD,2001），调节受体数量（HELEN,2001），调理细胞凋亡（CHEN,2001）等方面都具有重要的作用。近年的研究表明HSP70还能促进抗原提呈，参与机体的免疫反应。在胚胎发育初期，HSP70对胚胎也有一定的保护作用。随着分子生物学技术和生物信息学技术的不断发展和完善，HSP70基因不断从不同种类的生物中被克隆出来，从而为深入
3、研究HSP70基因的功能及其表达调控规律奠定了基础。通过对大量生物的热休克蛋白70氨基酸序列进行研究表明，热休克蛋白70家族成员无论在一级结构上，还是在高级结构上都是高度保守的。因此本课题拟通过曼氏无针乌贼HSP70基因5端的克隆研究，然后合并分析已知的核苷酸序列，进一步进行多序列比对和等电点进化分化。为曼氏无针乌贼HSP70基因提供分子生物学方面的参考数据和理论依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1以CDNA为模板，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶纯化，连接转化提取质粒鉴定后送去生物公司测序。2测序的序列与已知序列合并，对该核苷酸序列进行分析。3对已知的核苷酸序列进行多序列比对
4、和糖基化位点分析。4对已知的核苷酸序列进行进化分析，并构建进化树。拟解决的问题克隆出曼氏无针乌贼HSP705端的基因，并对其进行分析，为曼氏无针乌贼HSP70基因研究提供科学数据与理论依据。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1RNA提取TRIZOL法提取RNA取肌肉组织，液氮冷冻后保存于80冰箱中备用。采用TRIZOL一步法提取RNA，在紫外分光光度计上测定纯度和浓度，并用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳/EB染色检测所提RNA的质量。具体步骤如下（1）在15MLRNASEFREE离心管中加入1MLTRIZOL，同时将其中少许TRIZOL留在离心管盖内；取50MG左右动物组织置于离心管盖内，用烘烤过
5、的手术剪将组织彻底剪碎；（2）冰上放置5MIN，以使核蛋白质裂解彻底；（3）每1MLTRIZOL加入02ML氯仿，剧烈振荡混匀30S，冰上放置3MIN；（4）台式高速冷冻离心机上，12000RPM4离心15MIN（离心后，混合物分为淡红色的酚仿相、中间相和无色的上层水相，RNA就存在于水相中，水相大约占60）；（5）将上清液小心转移到RNASEFREE15ML离心管里，加入05ML的异丙醇，冰上放置10MIN；（6）台式高速冷冻离心机上，12000RPM4离心10MIN（离心后，管底看见胶状RNA沉淀）；（7）弃上清，用1ML75酒精洗涤RNA沉淀，7500RPM4离心5MIN；（8）弃上清，
6、室温下放置510MIN，使酒精挥发；（9）加20LDEPCH2O溶解，80保存。2CDNA合成CDNA第一链的合成使用MMLV逆转录酶，操作步骤如下（1）在MICROTUBE中配制下列混合液反应液成分体积LCD2LRNA051LRNAFREEDH2O至8L（2）将MICROTUBE置于PCR仪或水浴锅中，72变性2MIN，迅速冰浴退火2MIN；（3）在上述MICROTUBE管中配制下列反转录反应液反应液成分体积LRRI（RNA酶抑制剂）1L5MMLVBUFFER4L10MMDNTP2LMMLV（逆转录酶）2LRNAFREEDH2O1LTOTALVOLUME10L将上述MICROTUBE管置于P
7、CR仪或水浴锅中，经4210MIN，然后加入SMART、SMART2、SMART3各1L混合后取2L，经4290MIN及7510MIN的反应后将其置于20保存。3聚合酶链式反应PCR根据已获得的部分核心序列，应用PRIMERPREMIER50引物设计软件，设计一对跨内含子的曼氏无针乌贼HSP70基因的特异性引物SMART/A和HSP5T（）。曼氏无针乌贼CDNA扩增采用TAKARA公司的LATAQTMPCRSYSTEM，25L反应体系成分如下10LATAQTMBUFFER25LDNTPMIXTURE各25MMOL/L2LSMART/A1LHSP5T（）1LCDNA05LDDH2O1775LLA
8、TAQTMDNAPOLYMERASE025LPCR反应总体积25L检测采用TAKARA公司的RTAQTMDNA聚合酶体系，反应体系如下10RTAQTMBUFFER25LDNTPMIXTURE各25MMOL/L2LSMART/A1LHSP5T（）1LCDNA05LDDH2O1775LRTAQTMDNAPOLYMERASE025L反应总体积25LPCR流程如下94C变性2MIN后，作30个循环的扩增，每一循环包括94C变性2MIN、94C变性30S，54退火30S和72C合成052MIN。循环结束后72延伸反应10MIN以保证获得全长产物。PCR扩增产物经1W/V琼脂糖凝胶电泳分离。4DNA克隆4
9、1DNA片段切胶纯化将25LPCR产物与10LAODINGBUFFER混合，并在1W/V琼脂糖凝胶中电泳120V，EB染色后漂洗，紫外灯下观察。切下预期大小的目的片段，用EZNATMGELEXTRACTIONKITOMEGA纯化，具体方法如下（1）将目的胶条置EPPENDORF管，加300LBINDINGBUFFER后置5560水浴10MIN，每23MIN颠倒混匀一次；（2）将混合液混匀后转入蓝管，10000G离心1MIN；（3）加300LBINDINGBUFFER，10000G离心1MIN；（4）弃滤液，加700LWASHBUFFER于蓝管中，10000G离心1MIN；（5）弃滤液，另加70
10、0LWASHBUFFER于蓝管中，10000G离心1MIN；（6）弃滤液，13000G离心2MIN以彻底去除蓝管中的WASHBUFFER残留；（7）加入30LELUTIONBUFFER于蓝管，室温静置1MIN，13000G离心1MIN，收集产物30保存。42TA连接由于LATAQTMDNA，RTAQTMDNA及聚合酶进行PCR时，会在产物DNA的3末端形成一个游离的A，PMD19TSIMPLEVECTOR载体5端具有与之配对的单个T，可与PCR产物直接连接。连接体系及反应如下，连接产物可直接用于转化。2快速连接缓冲液5LPCR产物切胶纯化3LPMD19TSIMPLEVECTOR1LT4DNA连
11、接酶1L反应总体积10L16连接05H后4过夜43感受态细胞制备CACL2法（1）接种80长期保存的大肠杆菌菌株到5MLLB每升含10GTRYPTONE，5GYEASTEXTRACT，10GNACL，PH70液体培养基中，37摇床，200RPM，培养过夜12H左右；（2）按1100稀释到新鲜的LB液体培养基中，继续37摇床，200RPM，培养2H；（3）取出菌液置冰上冷却10MIN，将冰冷的菌液1ML每管分装到15ML的EPPENDORF管，8000G离心1MIN，弃上清；（4）沉淀用200L预冷的01MOL/LCACL2悬浮，冰浴30MIN后，8000G离心1MIN，弃上清；（5）沉淀再用1
12、00L01MOL/LCACL2重悬浮，冰浴放置524H备用。44转化和筛选（1）将10L连接产物加到100L感受态细胞中，冰浴放置30MIN；（2）在42水浴热激90S，立即转移到冰上冷却数分钟；（3）加入冰预冷的LB培养液890L后，37摇床低速170180RPM培养1H；（4）在预先涂布XGAL和IPTG的LB平板上液体LB培养基中添加15琼脂粉，取100L转化后的培养菌液，涂布于含氨卞青霉素50100G/ML，37培养箱过夜培养1014H；（5）筛选白色菌落置5ML含氨卞青霉素50100MG/MLLB培养液，37摇床，200RPM，培养812H。45质粒提取根据不同目的，本文采用两种方法
13、提取质粒，其中粗提采用碱裂法小量制备质粒，用于检测。采用EZNAPLASMIDMINIKITI试剂盒OMEGA，用于双酶切。A裂解法粗提质粒（1）取1ML菌液于15ML的EPPENDORF管中，离心8000G，1MIN，弃去上清；（2）加入溶液I50MMOL/L葡萄糖，10MMOL/LEDTA，25MMOL/LTRISCLPH80100L，剧烈震荡使细胞悬浮；（3）加新鲜配制溶液II02MOL/LNAOH，1SDS200L，轻柔颠倒数次，待菌悬浮液澄清；（4）加入150L溶液III3MOL/LKAC，2MOL/LHAC，混匀后离心13000G，10MIN；（5）将380L上清转移至新EPPEN
14、DORF管中，加异丙醇720L，颠倒数次后离心13000G，10MIN；（6）弃上清，沉淀自然干燥后加50L无菌水溶解SAMBROOKETAL，1989。BEZNAPLASMIDMINIKITI试剂盒OMEGA法（1）取3050ML的菌液，于室温下5000G，离心10MIN，沉淀菌种；（2）倒出或吸掉培养基，往沉淀中加入25ML的SOLUTION/RNASEA混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮；（3）转移细胞悬溶液到3050ML的离心管中，往重悬混和液中加入25MLSOLUTION，盖上盖子，轻轻的但要彻底混匀，颠倒1015次以获得澄清裂解物。如有必要，可把裂解液置于室温静置2MIN；（4）往
15、上述混和液中加入35MLSOLUTION，盖好盖子，并温和地上下颠倒离心管数次，直至形成白色絮狀沉淀，于室温最好4下12000G，离心10MIN；（5）小心吸取37ML上清液到中量结合柱，结合柱套上15ML的收集管，确保转至柱內的上清中没有细胞杂质沉淀。于室温下5000G离心35MIN，使裂解液完全流过柱子。弃去收集管中滤液并把柱子重新装在15ML收集管中。重复这一步，直至将全部样品通过柱子，弃去流出液（收集管重复使用）。（6）加入3MLBUFFERHB到中量柱子中，室温下5000G离心35MIN，弃去收集管中的滤液，在下一步中重复使用收集试管；（7）加入35MLDNAWASHBUFFER用无
16、水乙醇稀释的洗涤柱子，室温下5000G离心35MIN，弃去洗涤液；（8）重复步骤8，再用35ML的DNAWASHBUFFER洗涤柱子一次；（9）室温下5000G离心空柱1015MIN以甩干柱子基质。（10）进一步干燥柱子，在65烘箱中处理10MIN，移走柱子；（11）把柱子置于一干净的15ML小离心管上，直接加入051MLELUTIONBUFFER到柱子基质上，室温下静置2MIN，5000G离心5MIN，洗脱出DNA，纯化的质粒于30保存。5检测51重组质粒的鉴定将碱裂法抽提的质粒与10上样缓冲液混匀后，1琼脂糖凝胶电泳，选择大小合适的重组质粒进行PCR检测，PCR检测体系如前。PCR产物经1
17、琼脂糖凝胶电泳分离。鉴定为目的重组质粒后，将目的菌株的菌液加10甘油混匀后置于80保存。52序列测定和分析取一部分菌液用封口膜封好后寄出测序，测序由上海华大公司测定,采用ABIPRISMTM3770DNA自动测序仪双向测序。序列分析采用BLASTP分析软件HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/，多重序列比对采用DDBJ软件CLUSTALW程序HTTP/CLUSTALWDDBJNIGACJP/，系统进化分析由MEGA30版程序完成。（二）技术路线四、研究的总体安排与进度201001201002毕业论文选题。201002201003进行文献查阅和资料收集，制定具体研究计划和试验方
18、案。201003201004材料整理、分析，开始进行综述撰写。201004201005开题答辩与综述。201004201007进行曼氏无针乌贼HSP70基因5端的克隆实验。资料查询HSP705端基因克隆序列分析PCR扩增数据整理，论文撰写切胶回收连接转化分析序列送去测序多序列比对糖基化分析进化分析提取质粒201008201011数据和材料整理、分析。201012201102完成2篇外文翻译。201102201105论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1陈劲松,夏双印,杨大平HSP70在鼠背轴型皮管IPC后的保护作用的实验研究J中国急救医学,2001,2131391412谷文萍热休克蛋白70研
19、究进展J国外医学神经病学神经外科学分册,1999,26257593郑磊,颜晓慧,邹飞,等热应激时热休克蛋白70及其细胞保护作用J国外医学卫生学分册,1999,2642092124BOSTONRS,VIITANENPV,VIERLINGEMOLECULARCHAPERONESANDPROTEINFOLDINGINPLANTJPLANTMOLBIOL,1996,32121912225BURDONRHHEATSHOCKPROTEINSINRELATIONTOMEDICINEJMOLASPECTSMED,1993,142831656CAOY,MATSUMOTOT,MOTOMURAK,ETALIMPAI
20、REDINDUCTIONOFHEATSHOCKPROTEINIMPLICATEDINDECREASEDTHERMOTOLERANCEINATEMPERATURESENSITIVEMULTINUCLEATEDCELLLINEJJCELLBIOCHEM,1998,7119147CONROYSE,LATCHMANDSDOHEATSHOCKPROTEINSHAVEAROLEINBREASTCANCERJBRJCANCER,1996,7457177218CURANIETALCOPPERANDZINCUPTAKEANDHSP70EXPRESSIONINHEPG2CELLSJTOXICOLOGYINVITR
21、O,2001,154975029DICHENHEATSHOCKPROTEIN70MODERATELYENHANCESPEPTIDEBLINDINGANDTRANSPORTBYTHETRANSPORTERASSOCIATEDWITHANTIGENPROCESSINGJIMMUNOLOGYLETTERS,2001,7514314810DEBORAHAR,MICHAELWG,ROCHELLEB,ETALINCREASEDEXPRESSIONOFTHEHSP70COCHAPERONEHSPBP1INTUMORSJTUMORBIOLOGY,2003,24628111GROSSC,HANSCHD,GAST
22、PARR,ETALINTERACTIONOFHEATSHOCKPROTEIN70PEPTIDEWITHNKCELLSINVOLVESTHENKRECEPTORCD94JBIOLCHEM,2003,38426712GETTINGMJ,SAMBROOKJPROTEINFOLDINGINTHECELLJNATURE,1992,355334513GEORGOPOULOSC,WELCHWJROLEOFTHEMAJORHEATSHOCKPROTEINSASMOLECULARCHAPERONESJANNUREVCELLBIOL,1993,960163414GABAIVL,MERIINAB,MOSSERDD,
23、ETALHSP70PREVENTSACTIVATIONOFSTRESSKINASESANOVELPATHWAYOFCELLULARTHERMOTOLERANCEJBIOLCHEM,1997,272291803318037715GARCIABL,ETALTHESIGNIFICANCEOFLIPIDSATEARLYSTAGESOFMARINEFISHAREVIEWJAQUACULTURE,1997,1551410311516HELENMBSTRESSMANAGEMENTHEATSHOCKPROTEIN70ANDTHEREGULATIONOFAPOPTOSISJTRENDSINCELLBIOLOGY
24、,2001,11161017HUGHRBPELHAM,ETALAREGULATORYUPSTREAMPROMOTERELEMENTINTHEDROSOPHILAHSP70HEATSHOCKGENEJCELL,1982,3051752818HENDRICKJP,HARTLFUMOLECULARCHAPERONEFUNCTIONOFHEATSHOCKPROTEINSJANNUREVBIOCHEM,1993,6234938419JULIANNGK,GEORGECTHEATSHOCKPROTEIN70KDAMOLECULARBIOLOGY,BIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGYJPHARM
25、ACOLTHER,1998,80218418520LINDQUISTSTHEHEATSHOCKRESPONSEJANNUREVBIOCHEM,1986,551151119121MACIEJZ,FRANKWK,ALICJAWHSP70INTERACTIONSWITHTHEP53TUMORSUPPRESSORPROTEINJTHEEMBOJOURNAL,2001,20174634463822MARBERMS,WALKERJM,LATOMANDS,ETALMYOCARDALPROTEINAFTERWHOLEBODYHEATSTRESSINTHERATITISDEPENDENTONMETABOLICS
26、UBSTRATEANDISRELATEDTOTHEAMOUNTOFINDUCIBLE70KDHEATSTRESSPROTEINJJCLININVEST,1994,933108723MARTINEFHEATSHOCKPROTEINS,MOLECULARCHAPERONES,ANDTHESTRESSRESPONSEEVOLUTIONARYANDECOLOGICALPHYSIOLOGYJANNUREVPHYSIOL,1999,6124328224RITOSSAFEXPERIENTIAJ1962,1857125ROYH,BURDONHEATSHOCKANDTHEHEATSHOCKPROTEINSJBI
27、OCHEMJ,1986,24031332426RAKONCZAYZJ,MANDIY,KASZAKIJ,ETALINDUCTIONOFHSP72BYSODIUMARSENITEFAILETOPROTECTAGAINSTCHOLECYSTOKINOCTAPEPTIDEINDUCEDACUTEPANCREATITISINRATSJDIGDISSCI,2002,4771594160327SLINDGUIST,EACRAIGTHEHEATSHOCKPROTEINSJANNUREVGENET,1988,2263167728SHINBK,WANGH,YIMAM,ETALGLOBALPROFILINGOFTH
28、ECELLSURFACEPROTEOMEOFCANCERCELLSUNCOVERSANABUNDANCEOFPROTEINSWITHCHAPERONEFUNCTIONJJBIOLCHEM,2003,278760729SREEDHARAS,PARDHASARADHIBV,BEGUMZ,ETALLACKOFHEATSHOCKRESPONSETRIGGERSPROGRAMMEDCELLDEATHINARATHISTIOCYTICCELLLINEJFEBSLETT,1999,456233934230TISSIERESA,ETALJMOLECBIOLJ1974,3438931TODRYKSM,GOUGH
29、MJ,POCKLEYAGFACETSOFHEATSHOCKPROTEIN70SHOWIMMUNOTHERAPEUTICPOTENTIALJIMMUNOLOGY,2003,11011432WARDLTHEROLEOFHEATSHOCKPROTEIN70INVITAMINDRECEPTORFUNCTIONJBIOCHEMICALANDBIOPHYSICALRESEARCHCOMMUNICATIONS,2001,2821211121933WANGTT,CHIANGAS,CHUJJ,ETALCONCOMITANTALTERATIONSINDISTRIBURIONOF70KDHEATSHOCKPROTE
30、INS,CYTOSKELETONANDORGANELLESINHEATSHOCKED9LCELLSJINTJBIOCHEMCELLBIOL,1998,30674575934YAMAGISHIN,SAITOY,ISHIHARA,ETALENHANCEMENTEMBRYONALF9CELLSJEURBIOCHEM,2002,26941434151毕业论文文献综述水产养殖HSP70的研究概论摘要热休克蛋白（HSP）是生物细胞在受热、生物应激、理化因素等应激原刺激后所产生的一类在生物进化中最保守的蛋白。HSP70具有多种生物学功能，包括分子伴侣功能，抗热性功能，参与细胞免疫调节，抗细胞凋亡功能等等，随
31、着研究的深入，在生物学的功能不断被发现的同时，HSP70的应用前景也变得越来越广泛。关键词HSP70；分子伴侣；抗热性；免疫调节应激蛋白也被称为热休克蛋白（HEATSHOCKPROTEIN，HSP），是生物细胞在应激原刺激后，发生热休克反应时所产生的在生物进化中最保守并由热休克基因所编码的伴随细胞的一类蛋白。HSPS又称为“看家蛋白”（GETTINGMJETAL,1992），因为它是一种保护机体的蛋白，还发现HSPS可使细胞非特异性抗损伤能力增加。CONROY等人（1996）根据其分子量大小分为HSP27、HSP60、HSP70、HSP90和HSP110家族。热休克家族（HSPS）是到现在为止
32、发现最为保守的家族（HUGHRBPELHAMETAL,1982）。HSPS中最保守和最重要的一族是HSP70，生物中含量也是最多的，在应激反应中最为敏感以及在临床实践中的各种作用，因此成为现在研究领域中最受关注、研究最深入的一种。1HSP70的发现历史早在50多年以前，病理生理学家SELYE就提出了全身适应性和应激学说，适应综合症（ADAPTATIONSYNDROME）就是当机体在紧急情况下，为了适应突然的刺激而产生的一系列的非特异性的改变。19世纪70年代，研究发现将培养温度提高至30时，果蝇幼虫的唾液腺染色体上某一部位会出现“蓬松”现象，而温度恢复到正常时，其他部位才会出现类似的蓬松，说明
33、热休克蛋白是热诱导基因蓬松的活化产物（RITOSSAETAL,1962）。19世纪80年代，发现热休克反应中转录合成的一组特殊蛋白，而伴随着这类蛋白的合成，细胞的其他蛋白合成受到抑制，因为这类蛋白的合成与热休克反应有关，故称为热休克蛋白（TISSIERESETAL,1974）。HSP70家族是最重要和最保守的家族，大多数生物中HSP70的含量是最多的，在细胞应激反应后合成的也是最多的，家族成员共有20多种蛋白质。其中HSP70是最为重要的一种蛋白质，其相关研究也最多、最深入。根据其功能和分布分型包括应激诱导型、结构型、线粒体型以及内质网型等（SHINBKETAL,2003）。2HSP70的生物
34、学特性21HSP的概念热休克蛋白也称应激蛋白，是生物细胞在热刺激、缺血、缺氧、过氧化、低血糖、紫外线、外伤、病原微生物的感染、乙醇、亚砷酸钠、砒霜和重金属（TODRYKSMETAL,2003GROSSCETAL,2003）等应激源刺激下，发生热休克反应所产生的、由热休克基因编码、在进化上高度保守的伴随细胞蛋白。生物体在各种应激状态下所表现出来的以基因表达变化为特征的防御性适应反应称为热休克反应。22HSP70的功能域以氨基酸的一级结构为依据，可将HSP70分为三个功能域近N端为45KD大小在结构上高度保守的氨基酸序列，有ATPASE活性区，紧接着为分子量18KD大小相对保守的氨基酸序列，是多肽
35、的结合部位；近C端有约为10KD结构多变的氨基酸序列，其功能尚不明确，可能与某种特定的蛋白底物相互作用有关（陈劲松,2001）。热应答元件是指HSP70基因5上游中多个NGAAN同时存在时，高水平活化转录，热应激应答中必不可少的功能区，具有增强子的一些特性。当把这类HSE接在其它基因5上游时，该基因同样可以获得热应激蛋白的诱导性（HUGHRBPELHAMETAL,1982ROYHETAL,1986）。23HSP70的同源性HSP70基因没有内含子，这使得开始启动转录就可产生成熟的MRNA以适应HSP70大量快速表达的需要，阻止应激源对其MRNA前体的影响。进化过程中HSP70基因具有高度相似性
36、，大鼠的HSP70氨基酸序列与人类的相似性约为95，与小鼠的相似性约为98；人类HSP70氨基酸序列与果蝇的相似性为73，与大肠杆菌诱导型HSP70的相似性为47，果蝇的HSP70基因与大肠杆菌的DNAK基因的核苷酸序列相似性在50以上（SLINDGUISTETAL,1988）。24HSP70的生化特性HSP70都有较弱的ATPASE活性和较高的ATP亲和性，结合ATP后促使靶蛋白与之解离，ATPHSP70对靶蛋白具有很高的亲和力，形成稳定的HSP70蛋白复合体；选择性结合各种特殊蛋白或多肽参与蛋白稳定构象的形成、跨膜运输或降解；其它HSP或细胞因子的辅助才能形成HSP70复合体；HSP70家
37、族可以保护各种酶免受热损伤，使聚合的蛋白质解聚（BURDONRH,1993）。3HSP70的生物学功能HSP70具有多种生物学功能，包括分子伴侣功能，参与免疫反应，抗细胞凋亡功能，抗热性功能，促进细胞增殖等等，广泛的生物学功能使其成为当今生命科学研究领域中的热点（JULIANNGKETAL,1998）。31HSP70的分子伴侣功能分子伴侣是能够稳定和结合其它蛋白质的不稳定构象，通过控制有效的结合和释放，促进新生多肽链折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输等的一类蛋白质（HENDRICKJPETAL,1993）。蛋白质家族中分子伴侣是在进化上是非常保守，存在于各种生物体内，分子伴侣能够防
38、止未折叠的蛋白质变性和促进聚集的蛋白质溶解复性，所以在细胞受到不利环境胁迫时特别重要，因而许多分子伴侣在生物体内首次以HSP形式被鉴定出来（GEORGOPOULOSCETAL,1993BOSTONRSETAL,1996）。HSP70的ATP酶结构域或与肽链结合过程中起重要作用的C2末端的EEVD序列决定其分子伴侣作用。HSP家族可以帮助其他蛋白在细胞内折叠、成熟，值得关注的是不是所用的HSPS都是分子伴侣，分子伴侣也并不全是HSPS（MACIEJZETAL,2001）。HSP的分子伴侣功能是十分复杂的。32HSP70的抗热性功能细胞或生物体在预先受到亚致死温度时，对后来的热胁迫产生抗性的能力称
39、之为生物的耐热性。生存能力随着热耐力提高而提高，HSP介导应激耐受力的产生，且耐受力的高低与HSP的表达水平呈正相关关系（MARBERMSETAL,1994）。但不同条件下的HSP70对机体的保护作用是不一样的（RAKONCZAYZJETAL,2002）研究表明，虽然热休克处理和亚砷酸盐诱导都产生了大量的HSP70，但是热休克处理诱导的HSP70具有保护作用，而亚砷酸盐诱导的没有，说明热休克处理后HSP70对机体的应激能力增加不只是HSP70的作用。热耐力提高后，可以提高机体在致死高温下的生存能力（LINDQUISTS,1986）。实验表明（WANGTTETAL,1998），预先处理的生物体细
40、胞，当再次置于更高的甚至是致死温度的环境下时，生物体细胞的生存能力得到明显提高。细胞如果一直暴露于高温环境中，将使细胞分化功能丧失；而这些细胞间歇性的暴露于热环境中时，将会产生耐热性（CAOYETAL,1998）。生物对热环境的抵抗能力可以通过温度驯化得到。如蝾螈经过一段时间的温度驯化，能明显提高抗热性。现在有许多研究结果表明细胞的HSP可以通过热驯化诱导，以减轻高温对细胞的损害。HSP有提高微生物耐热能力的作用已得到很多学者的证实。33HSP的免疫调节功能现在，HSP在机体免疫调节中的作用越来越重要。HSP70在免疫调节方面发挥着许多令人瞩目的功效。病原体侵入宿主后会合成HSP，而宿主细胞通
41、过改变基因表达方式，诱导其HSP的产生。这时宿主其他基因表达受抑制，相应蛋白质合成减少。病原体和宿主细胞产生的HSP大多有抗原决定簇，可使宿主细胞发生体液和细胞免疫反应。长久以来，癌症一直是医学界乃至与生物界无法攻克的难题，但HSPS具有激活抗原的作用，如果用病人自己肿瘤的多肽加工制备成HSPS肽复合物疫苗，再注射回病人就能产生免疫反应。研究发现由于HSPBP1在肿瘤中的高表达使其可能成为一个新的癌症标志（DEBORAHETAL,2003）。UDONO等的研究表明，从肿瘤组织中获得的HSP70和小分子肽复合物具有肿瘤特异性免疫原性，产生特异性抗肿瘤免疫效应。一旦分离，单独的HSP70无此作用，
42、而小分子肽大部降解，含量甚微。因此，利用HSP70结合肽链这一特性获得特异性免疫原性和免疫抗性，可能为肿瘤的治疗提供一条新的途径。34HSP的抗细胞凋亡功能细胞的程序性死亡即凋亡指各种各样有害的应激因素如热暴露、缺血、缺氧氧化应激等可以引起细胞损伤。细胞收缩、膜排空、核破裂和DNA破碎是凋亡的主要特征。在应激情况下HSP70基因表达增加，可抑制应激激酶激活及凋亡激活基因的表达，防止细胞凋亡。当细胞与氨基酸类似物一起孵育时，细胞内出现异常蛋白积聚，导致P38、JNK等应激激酶的激活，此现象可能被HSP72的过量表达所阻断。因此，在应激状态下，细胞内HSP70家族基因表达水平的增加，可抑制应激激酶
43、激活，防止细胞凋亡（郑磊等,1999）。这种现象的机理到现在为止还不清楚，但在小鼠的胚胎F9细胞里，同种蛋白的过度表达加强过氧化介导的凋亡（YAMAGISHINETAL,2002）。研究表明，细胞内HSP72水平的增加会阻断信号通路，抑制JNK激活，从而减少细胞的凋亡（GABAIVLETAL,1997）。还发现，在温度为42情况下对克隆的小鼠BC8细胞进行30MIN的热应激后，BC8细胞不能产生应激反应，不产生HSP70，却可在细胞内观察到细胞凋亡小体和DNA碎片（SREEDHARASETAL,1999）。33展望现在，尽管HSP70的分子生物学研究仍然处在初级阶段，但大量的研究数据正在被收集
44、，正在逐步尝试功能基因的研究。不同的受试物种和研究组织，不同的应激源，HSP70的合成规律明显有不同程度差异。而对HSP70在应激反应过程中的合成原理仍然不清楚，这主要是因为，对HSP70合成机制研究数量到目前为止还很少，另外，在有限的实验研究中，受试物种的不一样，实验方案的设计以及HSP70的检测方法不同，造成数据之间缺乏可比性。所以，还需要得到更多HSP70基因信息，来更深层次的研究表明HSP70诱导因素、生物适应原理及合成表达的调控机制。另外，虽然现在有多种肿瘤免疫治疗方法应用于临床，但有些因为抗原呈递效果差，有些因为毒副作用大，效果不是很理想。HSP具有抗原的载体和佐剂的双重作用，可大
45、大提高肿瘤抗原多肽的呈递效率，并且广泛参与肿瘤免疫。随着HSP的免疫学和生物学机制研究的不断加深，其在肿瘤治疗方面的作用被越来越多的人所关注，应用前景无疑是非常诱人的。参考文献1陈劲松,夏双印,杨大平HSP70在鼠背轴型皮管IPC后的保护作用的实验研究J中国急救医学,2001,2131391412郑磊,颜晓慧,邹飞,等热应激时热休克蛋白70及其细胞保护作用J国外医学卫生学分册,1999,2642092123BOSTONRS,VIITANENPV,VIERLINGEMOLECULARCHAPERONESANDPROTEINFOLDINGINPLANTJPLANTMOLBIOL,1996,3212
46、1912224BURDONRHHEATSHOCKPROTEINSINRELATIONTOMEDICINEJMOLASPECTSMED,1993,142831655CAOY,MATSUMOTOT,MOTOMURAK,ETALIMPAIREDINDUCTIONOFHEATSHOCKPROTEINIMPLICATEDINDECREASEDTHERMOTOLERANCEINATEMPERATURESENSITIVEMULTINUCLEATEDCELLLINEJJCELLBIOCHEM,1998,7119146CONROYSE,LATCHMANDSDOHEATSHOCKPROTEINSHAVEAROLE
47、INBREASTCANCERJBRJCANCER,1996,7457177217DEBORAHAR,MICHAELWG,ROCHELLEB,ETALINCREASEDEXPRESSIONOFTHEHSP70COCHAPERONEHSPBP1INTUMORSJTUMORBIOLOGY,2003,2462818GROSSC,HANSCHD,GASTPARR,ETALINTERACTIONOFHEATSHOCKPROTEIN70PEPTIDEWITHNKCELLSINVOLVESTHENKRECEPTORCD94JBIOLCHEM,2003,3842679GETTINGMJ,SAMBROOKJPRO
48、TEINFOLDINGINTHECELLJNATURE,1992,355334510GEORGOPOULOSC,WELCHWJROLEOFTHEMAJORHEATSHOCKPROTEINSASMOLECULARCHAPERONESJANNUREVCELLBIOL,1993,960163411GABAIVL,MERIINAB,MOSSERDD,ETALHSP70PREVENTSACTIVATIONOFSTRESSKINASESANOVELPATHWAYOFCELLULARTHERMOTOLERANCEJBIOLCHEM,1997,272291803318037712GARCIABL,ETALTH
49、ESIGNIFICANCEOFLIPIDSATEARLYSTAGESOFMARINEFISHAREVIEWJAQUACULTURE,1997,1551410311513HUGHRBPELHAM,ETALAREGULATORYUPSTREAMPROMOTERELEMENTINTHEDROSOPHILAHSP70HEATSHOCKGENEJCELL,1982,3051752814HENDRICKJP,HARTLFUMOLECULARCHAPERONEFUNCTIONOFHEATSHOCKPROTEINSJANNUREVBIOCHEM,1993,6234938415JULIANNGK,GEORGECTHEATSHOCKPROTEIN70KDAMOLECULARBIOLOGY,BIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGYJPHARMACOLTHER,1998,80218418516LINDQUISTSTHEHEATSHOCKRESPONSEJANNUREVBIOCHEM,1986,551151119117MACIEJZ,FRANKWK,ALICJAWHSP70INTERA
