1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全塘养三疣梭子蟹弧菌的群落结构分析一、选题的背景与意义1三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）养殖规模的日益扩大、集约化程度的逐步提高和养殖环境的污染等导致了三疣梭子蟹免疫防御系统抗病力下降，对病害的易感性增加，越来越多的养殖环境遭到了严重破环。2弧菌病（VIBRIOSIS）作为弧菌所引起一种细菌性疾病，是最早发现的鱼类细菌性疾病之一，现已成为海水养殖动物主要细菌性病害之一，对养殖业的危害严重，常常造成极大的经济损失。因此，该类疾病的弧菌也一直备受国内外研究工作者的关注，是海水养殖动物病害的主要研究领域之一。3分子生物学技术和基因组学的
2、不断成熟和广泛应用，为微生物生态学的发展提供了新的研究方法。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1从弧菌的菌落计数出发，通过菌落特征的观察和16SRDNA基因序列比对，对三疣梭子蟹养殖塘健康蟹和病害蟹中弧菌群落结构变化进行比较研究，并进行了系统发育学分析，以期揭示其种群组成与弧菌病的关系。2找出三疣梭子蟹的发病与养殖塘水体中弧菌数量的关系，以及与蟹体内的弧菌菌落结构的相关性。3了解塘养三疣梭子蟹中弧菌的多样性，对发展健康养殖业具有重要的意义。三、研究的方法与技术路线1基于传统的微生物培养方法与现代分子生物学（PCRDGGE）、生物信息学的结合，对养殖塘三疣梭子蟹弧菌群落结构进行研究。2技术路线
3、四、总体的安排与进度12009年7月10月三疣梭子蟹样品采集，查询与论文有关的资料、撰写试验计划熟悉基本的实验操作；22009年7月2010年6月蟹体中弧菌的分离培养，弧菌菌落计数，根据菌落、菌体形态将弧菌进行初步归类，弧菌的保存，弧菌基因组DNA的提取；32010年9月PCRDGGE筛选出不同发育型，测序并进行系统发育学分析和对养殖塘三疣梭子蟹中弧菌群落结构进行初步分析，获得初步结果；42010年10月实验数据的整理分析以及对整个试验的补充、完善阶段；5预期于2010年12月底完成毕业论文的撰写。五、主要参考文献1RASMUSSENLD,EKELUNDF,HANSENLH,ETALGROUP
4、SPECIFICPCRPRIMERSTOAMPLIFY24SASUBUNITRRNAGENESFROMKINETOPLASTIDAPROTOZOAUSEDINDENATURINGGRADIENTGELELECTROPHORESISJMICROBECO2001,421091152常建波,常向红,孙逢贤,等养殖牙鲆弧菌病病原菌初步研究J海洋水产研三疣梭子蟹样品采集弧菌的分离培养弧菌菌落计数依据菌落、菌体形态进行初步归类弧菌基因组DNA的提取PCRDGGE筛选出不同发育型测序对养殖塘三疣梭子蟹中弧菌群落结构进行分析论文撰写究,2001,22137413张朝霞,王军,张蕉南,等东山九孔鲍细菌性疾病研究
5、J台湾海峡2001,2021932004沈亚林,于业绍副溶血弧菌对文蛤致病性及其防治J水产学报1993,1732494525HOLTJGBERGEYSMANUALOFDETEMINATIVEBACTERIOLOGYJ9THED,WILLIAMSVIBRIOCOMMUNITYSTRUCTUREVIBRIOSIS0引言三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）是我国海产经济蟹类，其肉质鲜美、营养丰富、经济价值高，在国内外享有盛名。近年来，由于养殖规模的不断扩大、养殖密度不断提高、养殖环境的污染等导致了三疣梭子蟹免疫防御系统抗病力下降，对病害的易感性增加，疾病频繁发生，对水产养殖动
6、物规模化养殖和发展造成了巨大的威胁，尤其以弧菌病最为严重。弧菌病（VIBRIOSIS）作为弧菌所引起一种细菌性疾病，是最早发现的鱼类细菌性疾病之一，现已成为海水养殖动物主要细菌性病害之一14，对养殖业的危害严重，常常造成极大的经济损失。因此，该类疾病的弧菌也一直备受国内外研究工作者的关注，是海水养殖动物病害的主要研究领域之一。弧菌（VIBRIO）属于弧菌科VIBRIONACEAE弧菌属，是一群具极生鞭毛、能运动、无芽胞、氧化酶阳性、发酵型的，革兰氏阴性杆状或弯曲状细菌。弧菌属比较庞杂，最近出版的伯杰氏细菌鉴定手册第9版（1994年）5共收入了34个种，6个生化变种，其中至少有12个种与人类感染
7、有关。弧菌广泛存在于海水、淡水和水生动物中，是海洋环境中常见的细菌类群之一，该类细菌具很强的适应性和抗逆性，因此成为海水环境的优势种群，尤以溶藻弧菌（VALGINOLYTICUS）、副溶血弧菌（VPRARHAEMOLYTICUS）、鳗弧菌（VANGUILLARIUM）等占优势6。例如早在1909年，BERGMAN7就从患病的欧洲鳗鲡ANGUILLAANGUILLA中分离得到致病性弧菌并将其鉴定为鳗弧菌VANGUILLARUM，从此对病原性弧菌的研究成为研究水生动物病原菌的热点，随后，倪纯治等8研究了弧菌数量与虾病的关系。在2004年，GABRIELAGUIRREGUZMAN9等人也提出了弧菌在
8、虾养殖系统中为主要致病性菌的最新认识。近几年由弧菌引起的三疣梭子蟹“乳化病”也有研究10。但对于三友梭子蟹疾病爆发与其自身环境微生物群落的关系研究较少。目前对弧菌的研究多见于对一些致病弧菌的生物学特性及其致病性的研究1113。弧菌VIBRIO是海洋环境中最常见一类条件致病菌，由于其广泛存在于自然海区，因而弧菌与疾病爆发的关系一般认为是由于水体中某特定种类的弧菌大量繁殖而引发疾病，水产品的弧菌检测也多是针对某特定弧菌而建立的，因而，蟹体的弧菌数量和种类常常被看做疾病爆发的重要征兆之一，但是，弧菌种类繁多，致病性菌株只占一小部分，大部分是非致病菌，这些非致病菌在水体净化中还起着非常重要的作用，因此
9、，相较于弧菌数量，弧菌群落的结构组成可能与疾病爆发更为相关。我们选取两个代表性的三疣梭子蟹养殖塘的蟹样，其中一个塘中梭子蟹发生类似“牛奶病”的疾病，其典型症状为三疣梭子蟹沿岸爬上，活动力差呼吸困难、行动迟缓，打开蟹盖，盖内可见大量乳白色液体，发病蟹死亡率为100，造成梭子蟹连续不断死亡，称为病害塘，另一个塘，没有明显的梭子蟹死亡迹象，称为健康塘。我们基于细菌计数、菌落特征和16SRDNA基因序列比对，即传统的微生物培养方法与现代分子生物学、生物信息学的结合，对鄞州区三疣梭子蟹养殖场蟹体体液中的弧菌群落组成进行了比较研究，以期进一步揭示弧菌群落结构变化与三疣梭子蟹疾病发生的关系。可为今后开发、利
10、用、鉴定弧菌资源，以及海水水产养殖病害防治等工作提供参考。1材料与方法11材料111样品在鄞州区瞻岐镇三疣梭子蟹养殖场的健康塘和病害塘养殖蟹样各4只，编号分别为HX和DX。112试剂1培养基TCBS琼脂的成分（G/L）酵母浸出粉50G，蔗糖200G，蛋白胨200G，枸橼酸铁10G，枸橼酸钠100G，BTB004G，硫代硫酸钠100G，琼脂粉130G，牛胆粉80G。PH86042细菌DNA提取试剂溶菌酶；无菌双蒸水（纯水）；SDS溶液；酚/氯仿/异戊醇溶液（25241，V/V）；氯仿/异戊醇溶液（241，V/V）；异丙醇；无水乙醇；70乙醇。3PCR试剂超纯水；10PCRBUFFER；DNTP；
11、TAQ酶（TAKARA）；模板DNA；引物。113仪器设备（1）培养皿、普通玻璃试管、15MLEP管、PCR管、移液枪、枪头、酒精灯、试剂瓶、锥形瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、镊子、记号笔、废物缸等。（2）EPPENDORF离心机；BIORADPCR仪；变性凝胶电泳仪；RXZ智能型人工气候箱，SPDJ系列水平净化工作台；DHG9123AS型干燥箱；HVE50型高压灭菌锅；微波炉；DK8D型电热恒温水槽；FR复日紫外/可见光分析生物凝胶成像系统；电泳槽；SL202N电子分析天平；梅特勒托利多（AL104）电子天平。12方法121样品采集2009年7月24日9301200，宁波鄞州区三疣梭子蟹养殖场，我
12、们按照海洋调查规范第6部分海洋生物调查（GB/T1276362007）的要求选取健康不发病的养殖塘和发病严重的养殖塘各两个，从中挑选健康蟹和病害蟹各4只，分别装于无菌培养皿中并包好。样品采集后均放在装有冰袋的密封泡沫箱中，并于6H内进行实验。122菌落计数14塘养三疣梭子蟹弧菌计数、分离和纯化均采用TCBS培养基。打开蟹盖，用灭菌枪头轻轻吸取蟹盖上的汁液于灭菌离心管内，即为蟹样。1稀释在无菌条件下用移液枪吸取100L已充分混匀的菌液（蟹样），精确的注入盛有900L无菌生理盐水的试管中，此即为10倍稀释。充分振荡101试管，使菌液充分混匀。更换枪头，插入101试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌
13、液分散，混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时枪头伸入管底，吹时离开液面。用此枪头吸取101菌液100L，精确的注入102试管中，此即为100倍稀释。其余依次类推，将采集的蟹体体液均用无菌生理盐水稀释成3个梯度（101、102、103）。2涂布如上所述，编号为100的平板直接采用原液涂布，其余的则按照101、102、103三个梯度，从对应编号的试管中取样。取已混匀的100L菌悬液滴在平板培养基表面中央位置（要求100L菌液要全部滴在培养基上）。用无菌棒平放在TCBS培养基平板表面来回涂布，使菌悬液均匀分布于平板上。每个稀释度设3个平行。3培养涂布完成后，将平板倒置放于30恒温培养箱中连续培养162
14、4H。4计数培养1624H后取出，计算出同一稀释梯度上三个平板上所生长的菌落平均数。通常情况下，选取菌落数在30300之间的平板（SN标准要求为25250个菌落），若有二个稀释度均在30300之间时，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字；如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告；如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在30300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。123划线分离选取单个弧菌菌落，在无菌条件下用接种环随机挑取挑取
15、单个菌落，接种到TCBS弧菌培养基中。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于30恒温培养箱中培养1624H。在得到单个菌落后，观察并记录弧菌的菌落形态。划线分离纯化3次，记录其形态特征，如颜色、质地、表面形态等，根据菌落形态特征将弧菌大概分群，共计60株。124斜面保种弧菌菌种斜面保种一般使用TCBS、LB或2216E斜面培养基。菌种移接后，放在30恒温培养箱中培养，当弧菌健壮地长满试管时，及时挑选无污染的培养斜面，用报纸包扎后置于4的冰箱中保藏。一般1530天转管一次。125弧菌总DNA提取1251传统的酚氯仿抽提法15115MLEP管收集菌体，8,000RPM离心5MIN，收集好的菌体可置于20保存
16、。2加500L1TE（PH80）悬浮菌体细胞，充分混匀；3加入20L溶菌酶（50MG/ML）至终浓度为2MG/ML，上下轻轻摇匀（细胞破壁），置于37水浴1520MIN；4加入578L20的SDS溶液至终浓度为2，混匀，60水浴30MIN，每510分钟要一次，观察液体粘稠度及细胞破壁情况，若气泡较多则说明粘稠度较高，细胞破壁效果较好；5加入等体积（578L）的酚/氯仿/异戊醇溶液（25241，V/V），混匀萃取，上下颠倒至乳浊状，4，12,000RPM离心10MIN；6收集上清液，并重复此步骤23次，直至水相澄清为止；7用剪去尖端的枪头吸取上清液至另一EP管中（DNA溶于上层水相），加入与上清
17、液等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液（25241，V/V），混匀，4下12,000RPM离心10MIN；8重复5、6步至蛋白质去除较完全；9取上清液，加等体积的氯仿/异戊醇溶液（241，V/V），混匀至乳浊状，4，12,000RPM离心10MIN；10取上清液，加1/10倍体积的3MOL/LNAAC溶液，混匀，然后加入冰预冷06倍体积的异丙醇（或2倍体积的无水乙醇），混匀，4，12,000RPM离心10MIN；11离心后轻轻倒掉溶液，DNA粘附于管壁，倒扣于纸上吸干，加70乙醇洗脱一次，12,000RPM离心8MIN；12倒去溶液，待管内酒精完全风干时，加相应体积的纯水或1TE溶液溶解DNA（约20
18、MIN），待完全溶解后使用或置于20冰箱保存备用。1252细菌基因组DNA快速提取法将收集的菌体细胞用50L无菌双蒸水悬浮，用漩涡混合器充分混匀，在沸水浴中煮1015MIN，10,000RPM离心2MIN，取上清液直接作为PCR扩增的DNA模板即可12616SRDNA的测序将菌株的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，采用细菌通用引物27F和1541R扩增16SRDNA的全序列，用于测序。引物序列见表1。表116SRDNA全序列扩增特殊引物TAB1SPECIFICPRIMERSFOR16SRDNAAMPLIFICATION引物名称引物序列（53）扩增片段片段大小27FAGAPTTTGATCCTG
19、GCTCAG16SRDNA全序列约1500BP1541RACGGCTACCTTGTTACGACT采用细菌的通用引物27F和1541R扩增细菌16SRDNA约1500BP的片段用于测序。50LPCR反应体系为021G基因组DNA，4MOLL1引物，200MOLL1DNTPS，5L10BUFFER，1UDNA聚合酶，补双蒸水到50L。PCR扩增采用降落PCR94预变性5MIN；前10个循环为941MIN，6560LMIN，7230S其中每个循环后复性温度下降05；后18个循环为941MIN，601MIN，7230S；最后72延伸5MIN。PCR产物采用15W/V琼脂糖凝胶（含有05G/ML溴化乙锭
20、）电泳进行检测，点样量为45L。采用通用引物对27F1512RPCR扩增的16SRDNA产物全序列切胶回收PCR产物，用UNIQ10柱式通用DNA纯化试剂盒（上海生工）纯化PCR产物，送送上海生物工程技术服务有限公司进行序列测定。127变性梯度凝胶电泳（DGGE）变性梯度凝胶电泳（DGGE）在DCORDSYSTEM（BIORAD）上进行，采用8聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为4070，每个点样孔点68LPCR产物，使电泳仪保持电压为180V，温度为55，电泳6H；结束后进行银染或EB染色。DGGE相关试剂如下（1）30丙烯酰胺/双丙烯酰胺（291）（2）50TAE试剂含量TRIS碱2M05MEDTA
21、（PH80）50MM乙酸1M（3）上样缓冲液（LOADINGDYE）试剂含量2溴芬蓝025ML2二甲苯箐蓝025ML100甘油70MLDH2O25ML128基因序列比对以及系统发育树构建所得序列用NCBI的BLAST程序进行同源性比对，找出相近的种属，通过RDP数据库下载菌株标准序列，并用EBI程序进行所得序列与标准菌株的相似性分析，同时下载相关序列用MEGA40软件构建系统发育树（NEIGHBORJOINING法）。2结果与讨论21弧菌总菌数测定结果对三疣梭子蟹养殖健康塘和病害塘的养殖水体及蟹体的弧菌进行菌落计数（表2），从表中可知，健康塘水体弧菌数量为185235102CFU/ML，病害塘
22、水体弧菌数量为065190102CFU/ML，两者都在102CFU/ML数量级，差别不大；健康蟹弧菌数量为02826104CFU/ML，病害蟹弧菌数量为1367106CFU/ML，两者相差两个数量级。表2三疣梭子蟹养殖水体及蟹体中的弧菌数量（CFU/ML）TAB2THENUMBEROFVIBRIOINTHECULTURINGWATERANDITSBODYLIQUID（CFU/ML）样本SAMPLES水体WATER蟹体CRABSBODY健康塘HEATHYPOND病害塘DISEASEDPOND健康蟹HEATHYCRAB病害蟹DISEASEDCRAB样本1SAMPLE1235102190102279
23、103666106样本2SAMPLE2185102650101263104128106平均值AVERAGE2110213102151044010622弧菌菌落结构特点分析从三疣梭子蟹养殖健康蟹和病害蟹中共分离弧菌60株，其中健康蟹样与病害蟹样试剂含量丙烯酰胺290G双丙烯酰胺10GDH2O定容至100ML各30株，根据弧菌菌落特征（表面形态、质地、颜色等）将其初步划分为4个类群，即C1C4，见表3。其中C1类群占了总数的一半多,C3类群也有较多菌株数，其余2个类群得菌株数都少于5个。由表3可知，无论是健康蟹还是病害蟹弧菌菌落主要集中在C1和C3类群，但健康蟹比病害蟹多出C2、C4两个菌落类群，
24、且两者C3类群的数量相差较大。可知梭子蟹养殖塘发病与蟹体内的弧菌类群有一定的相关性，弧菌类群的多样性减少。表3塘养三疣梭子蟹中弧菌的菌落类群分布TAB3THECOLONYCATEGORYOFTHEVIBRIOINTHECULTURINGCRAB菌落类群COLONYCATEGORY菌落特征COLONYCHARACTERISTICS菌株数量STRAINNUMBER株表面形态SURFACESHAPE质地TEXTURE颜色CULOUR蟹体CRABSBODY合计TOTAL健康蟹HEATHYCRAB病害蟹DISEASEDCRABC1凸起CONVEX奶油CREAMING橙黄191433C2凸起CONVEX奶
25、油CREAMING墨绿303C3平展FLAT奶油CREAMING橙黄71623C4平展FLAT奶油CREAMING绿色101我们对分离的弧菌进行DGGE16SRDNA鉴定，养殖塘蟹体弧菌共60株菌，在转接过程中死亡22株，实际鉴定38株，16SRDNA序列BLAST比对表明38株弧菌归属于4个种，8个发育型（97的序列相似性作为种的划分标准）（图1，表4），取8个代表性菌株和对应种的典型菌株的序列构建系统发育树（图,2），比较弧菌种属在各样品中的分布（图3）。图1塘养三疣梭子蟹中弧菌的DGGE图谱FIG1THEDGGEOFTHEVIBRIOINTHECULTURINGCRAB图2塘养三疣梭子蟹
26、中弧菌系统发育学分析FIG2THEPHYLOGENETICANALYSISOFTHEVIBRIOINTHECULTURINGCRAB表4塘养三疣梭子蟹中的弧菌种属分布TAB4THESPECIESDISTRIBUTIONOFTHEVIBRIOINTHECULTURINGCRAB相近种属名称SIMILARSPECIES代表菌株REPRESENTATIVESTRAINS相近种16SRDNA序列16SRDNASEQUENCESOFSIMILARSPECIES16SRDNA相似性16SRDNASIMILARITY菌株数量NUMBEROFSTRAINS蟹体CRABSBODY总数TOTAL健康蟹HEATHY
27、CRAB病害蟹DISEASEDCRABVALGINOLYTICUSH1X10X74690996707VCAMPBELLIIH1X4X56575993101VHARVEYI（）D1X6X7470699841115VHARVEYI（）H2X6996101VHARVEYI（）H1X14991707VHARVEYI（）D1X1988033VHARVEYI（）D1X5975022VNATRIEGENSH2X7X74714100202总数TOTAL221638从图表中发现，养殖三疣梭子蟹弧菌共4个种，8个发育型中，VHARVEYI为最优势种，分5个不同的发育型（I）共有28株菌，占弧菌总数的近四分之三，其
28、中VHARVEYI（I）数量最多，有15株，占该种弧菌的536，占弧菌总数的395，其余4个发育型数量分布较少；第二优势种为VALGINOLYTICUS，有7株菌，占弧菌总数的184；其余种数量分布较少，有些种仅分布在个别样品中。弧菌种属分布与弧菌菌落类群分布基本一致。从表5可知，虽然同一种弧菌的菌落特征不是完全分布于同一菌落类群，如VHARVEYI（）分布于C1，C3两个类群，VHARVEYI（）分布于C3，C4两个类群，但是每种弧菌都有各自的优势菌落类群，如VALGINOLYTICUS、VHARVEYI（）、VHARVEYI（）、VHARVEYI（）、VHARVEYI（）和VNATRIEG
29、ENS的优势菌落类群均为C1，分别占各自种属总菌株数的100、800、100、100、100和100；另外，布于C2类群的株菌只有1株为VCAMPBELLII；VHARVEYI（）的7株菌主要分布于C3类群，占该菌总数的857。以上弧菌各种属菌株数比例都已过半，由此可见，VALGINOLYTICUS，VHARVEYI（），VHARVEYI（），VHARVEYI（）和VNATRIEGENS的菌落特征基本为表面凸起，奶油质地，橙黄色，VCAMPBELLII的菌落特征基本为表面凸起，奶油质地，墨绿色，VHARVEYI（）的菌落特征基本为表面平展，奶油质地，橙黄色。表5塘养三疣梭子蟹中弧菌种属分布的群
30、落特征TAB5THECOLONYCHARACTERISTICSOFDIFFERENTVIBROSPECIESINTHECULTURINGCRAB种名SPECIES菌落类群COLONYCATEGORY总计TOTALC1C2C3C4VALGINOLYTICUS70007VCAMPBELLII01001VHARVEYI（）1203015VHARVEYI（）10001VHARVEYI（）00617VHARVEYI（）30003VHARVEYI（）20002VNATRIEGENS20002合计TOTAL27110038在三疣梭子蟹弧菌群落的组成上，健康蟹和病害蟹有明显差异。健康蟹中的22株弧菌分属于VA
31、LGINOLYTICUS、VCAMPBELLII、VNATRIEGENS和VHARVEYI等4个种，而VHARVEYI中型为健康塘蟹体和病害塘蟹体的共有发育型；但VHARVEYI（）病害塘蟹体菌株数量最多，有11株菌，占VHARVEYI（I）总数的733，占病害蟹弧菌总数的289；和型为健康蟹的特有发育型，分别有1、7株菌，而病害蟹中的16株弧菌属于VHARVEYI中的3个发育型（、和）中VHARVEYI（）型和（）型为病害蟹的特有发育型，分别有3、2株菌。另外，VALGINOLYTICUS、VCAMPBELLII和VNATRIEGENS仅在健康蟹体内出现，分别有7株，1株菌和2株。塘养三疣梭
32、子蟹中的弧菌种属分布图0102030405060健康蟹HEATHYCRAB病害蟹DISEASEDCRAB样品SAMPLE弧菌种属分布THESPECIESDISTRIBUTIONOFTHEVIBRIOVNATRIEGENSVHARVEYI（）VHARVEYI（）VHARVEYI（）VHARVEYI（）VHARVEYI（）VCAMPBELLIIVALGINOLYTICUS图3塘养三疣梭子蟹中弧菌种属分布图FIG3THESPECIESDISTRIBUTIONOFTHEVIBRIOINTHECULTURINGCRAB23弧菌数量及种属分布变化与三疣梭子蟹发病的关系从数量上，健康塘水体与病害塘水体中的弧
33、菌没有明显变化，而健康蟹与病害蟹体液中的弧菌，无论从数量上，还是种类组成上都变化明显（表2、图3）。健康塘水体与病害塘水体中的弧菌数量都在102CFU/ML数量级，差别不大。而病害蟹体液的弧菌平均数量较健康蟹增加了2个数量级，两者在弧菌种属分布上亦有明显差别，健康蟹体液中的弧菌包含4个种，6个发育型，除VHARVEYI（）和（III）为健康蟹体液的特有发育型外，其余4个发育型为健康塘和病害塘水体共有，且数量变化不大；而病害蟹体液中的弧菌群落结构变化较大，只包含VHARVEYI1个种，VALGINOLYTICUS、VHARVEYI（III）和其他一些种类的弧菌消失了，而VHARVEYI（）却大大
34、增加，且有不同于健康蟹的VHARVEYI（IV）和VHARVEYI（V）出现。由上可知，三疣梭子蟹发病与蟹体体液中的弧菌群落结构变化关系较为密切。弧菌是海水环境中的常在菌群，广泛分布在自然海区，是一种条件致病菌，但当养殖动物受伤、体弱、抗病力降低和环境条件恶化时，弧菌会乘虚而入，引起蟹、虾等各种水产动物的严重疾病，甚至死亡16。谢文阳等17认为VHARVEYI是某些虾种主要病原细菌，养殖池中鱼类和甲壳类在早期幼苗阶段，极易因突然感染此种细菌而死亡。而在2007年RIKARDDRYSELIUS18等也肯定了弧菌基因的进化具有多样性。研究证明，大部分病原体在致病前都是处在一种不活跃或十分不活跃状态
35、，疾病的进展，是因为病原体数量急剧增加、病原体的致病力大大加强的缘故19。本文也证实了这一情况，VHARVEYI（）在塘养三疣梭子蟹健康蟹体和病害蟹体中都存在，但在病蟹体中数量却大大增加，成为优势发育型，可能是引发三疣梭子蟹疾病的主要原因，另外，VHARVEYI（IV）和VHARVEYI（V）的突然出现也可能进一步加重了三疣梭子蟹病害的严重程度。另外，本文中VALGINOLYTICUS只在健康蟹体液中有发现，病害蟹体液中却没有出现，这与刘淇20和王国良21认为的VALGINOLYTICUS是引起三疣梭子蟹肌肉乳化病的病原菌的结论不一致，究竟是该种在群落竞争中被VHARVEYI所取代，没能取得优
36、势地位，还是由其它因素引起，有待进一步研究。另外，VNATRIEGENS和VCAMPBELLII也仅在健康蟹中有出现，表明它们不会对三疣梭子蟹蟹体造成病害，相反，可能由于其能分泌几丁质降解酶而具有较重要的生态功能。3小结本文从弧菌的菌落计数出发，通过菌落特征的观察和16SRDNA基因序列比对，对三疣梭子蟹养殖塘健康蟹和病害蟹体的弧菌群落结构进行了比较研究，发现从数量上，健康塘水体与病害塘水体中弧菌的总菌数没有明显变化，而健康蟹与病害蟹中弧菌的数量有明显变化。在三疣梭子蟹中弧菌群落的结构上，虽然弧菌种属分布与弧菌菌落类群分布基本一致，但是健康蟹和病害蟹中弧菌群的落结构变化有明显差异，同一种弧菌的
37、菌落特征不是完全分布于同一菌落类群，而每种弧菌都有各自的优势菌落类群。由此可知，三疣梭子蟹发病与蟹体中的弧菌群落结构变化关系较为密切。三疣梭子蟹发病不仅与弧菌的数量有关，还与弧菌的多样性、弧菌的个别种甚至同个种的个别发育型有关。参考文献1RASMUSSENLD，EKELUNDF,HANSENLH，ETALGROUPSPECIFICPCRPRIMERSTOAMPLIFY24SASUBUNITRRNAGENESFROMKINETOPLASTIDAPROTOZOAUSEDINDENATURINGGRADIENTGELELECTROPHORESISJMICROBECOL，2001，421091152常
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