1、本科毕业论文系列开题报告生物技术两株弧菌的分子鉴定一、选题的背景与意义弧菌在自然环境中分布广泛，生境多样。从淡水到混水，再到海水，尤其是有机质丰富的海淡水汇合的港湾。温度、盐度、有机营养等受潮汐、暴雨的影响波动很大，对弧菌的冲击也很大。同时弧菌既能游离生活，又能与其他生物附生或共生，有些还是人类和/或养殖动物的条件致病菌。弧菌的水生生态学研究表明，水生环境对弧菌的时空分布及相关疾病的爆发都起着非常重要的作用。核糖体是细菌唯一的细胞器，其16SRRNA在进化中高度保守，被称为细菌的“分子化石”，常用于细菌的鉴定与分类研究。1977年，CWEOSE等在分析原核生物16SRRNA和真核生物18SRR
2、NA序列的基础上，提出了可将自然界的生命分为细菌、古菌和真核生物三域（DOMAIN），揭示了各生物之间的系统发育关系，为弧菌分类与鉴定提供了理论和实践基础。16SRRNA基因序列包含10个可变区VARIABLEREGION和11个恒定区CONSTANTREGION，可变区因细菌而异，变异程度与细菌的系统发育密切相关。在生物进化的漫长过程中，其基因序列的变化非常缓慢，因此可以用来标记生物的进化距离和亲缘关系。迄今为止已有许多弧菌的的全序列16SRRNA基因得以破译并免费公布，十分方便进行类似序列的比较分析。随着研究的深入，逐渐建立了以16SRRNA基因为分类标准的各大数据库例如GENEBENK、
3、EMBL等。这些数据库为广大的分类及分子研究的科研院所以及学者提供了强大的数据支持。本研究采用一对弧菌16SRRNA基因引物通用PCR扩增两株未知弧菌的部分16SRRNA基因，对基因扩增片段做进一步的序列测定，通过序列同源性分析显示，从而确定该弧菌的分类学地位。该方法是一种十分方便有效的弧菌鉴定方法，可在实践中加以推广应用。通过此项课题为进一步探究16SRRNA基因在弧菌鉴定上发挥的作用和寻找防治致病弧菌的新方法提供理论依据。同时为研究弧菌群落演替提供技术支撑，为揭示弧菌的生态学和流行病学规律具有重要意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容本实验主要是对采样获取的两株弧菌中提取
4、其总DNA，获得该两株菌的16SRRNA基因，并进行分子鉴定与序列分析及进化树构建。拟解决的问题16SRRNA基因与其他高分辨基因如RECA基因等相结合进行对弧菌进行鉴定和系统发育树分析。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1实验材料本实验材料为从环境样品中提取出的两株弧菌，进分离纯化后接种到培养皿培养备用。2形态学特征和生理生化鉴定菌落大小、表面形态、边缘、质地和光泽等特征进行初步鉴定。3总DNA提取1、大试管液体扩繁，收集10ML培养液，离心；2、加入2MLTE悬浮菌体，溶菌酶100UL（50MG/ML）、RNASEA10UL10MG/ML，摇匀；水浴30MIN3、加入120UL10SD
5、S和蛋白酶K20MG/ML10UL60水浴30MIN1H4、加入500UL5MOL/LNACL，320ULCTAB/NACL，65水浴10MIN5、3ML酚氯仿25241抽提一次（一定要混匀）6、转移上清后用等体积氯仿异戊醇241抽提1次7、加入1/10体积的3MOL/LNAAC，06体积异丙醇沉淀DNA8、用70的酒精洗少量多次，三次以上。第一次不用弄起DNA沉淀，第二次洗涤弄起DNA沉淀，混匀充分后洗涤。第三次重新洗涤，尽量减少DNA里面的盐分和其他杂质。9、所得的沉淀DNA用50UL水溶解，加入50UL的5MOL/L的NACL溶液，充分混匀。加入06倍体积的异丙醇沉淀后重新70酒精洗涤。
6、风干后，用25UL水溶解样品。10、风干后，用50UL水溶解样品，20保藏。4PCR方法测定获取目的基因序列16SRRNA基因PCR扩增设计两个引物。在20TA反应体系中含有无菌蒸馏水144L，1PCR缓冲液2L，15MMOL/LMGCL216L，4DNTP混合物04L，引物各02L，25U/L的TAQDNA聚合酶02L，模板DNA1L。PCR反应条件为95预变性3MIN、接94变性LMIN、55复性1MIN和72延伸2MIN，30个循环后72温育6MIN。5随机测序及序列分析琼脂糖凝胶检测PCR产物，预期大小的扩增条带回收后克隆至PMD19T载体，对序列进行序列测定。序列测定和分析采用ABI
7、PRISMTM3770DNA自动测序仪双向测序，由上海华大公司测定。序列分析采用BLASTP分析软件HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/，多重序列比对采用DDBJ软件CLUSTALW程序HTTP/CLUSTALWDDBJNIGACJP/，等电点分析采用EXPASY软件HTTP/WWWEXPASYCH/，系统进化分析由MEGA40版程序完成TAMURAETAL，2007。6菌种分类位置确定根据细菌形态、培养基理化特性测定的结果，依据相关资料，并结合细菌发育学分析的结果，进行分离菌的种属分类位置判定（二）技术路线弧菌分离纯化菌株形态特征确定这两株菌的分类学地位菌株生长曲线测定弧
8、菌总DNA的提取序列分析多重序列比对系统进化分析随机测序与序列分析16SRDNA序列的PCR扩增环境样品四、研究的总体安排与进度20109201010毕业论文选题201010201011进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和试验方案。20101120111获得弧菌的16SRRNA基因，对其进行BLAST分析，比对分析和16SRRNA基因进化树构建，确定其分类学地位。2011120112数据和材料整理、分析。2011220113开题答辩与综述。2011320115完成2篇外文翻译，论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1东秀珠,蔡妙英常见细菌系统鉴定手册M北京科学出版社
9、20011061282CRISTIANECTHOMPSON,ANACAROLINAPVICENTE,RANGELCSOUZAGENOMICTAXONOMYOFVIBRIOSJBMCEVOLUTIONARYBIOLOGY2009,9258213121483WOESECR,FOXGEPHYLOGENETICSTRUCTUREOFTHEPROKARYOTICDOMAINTHEPRIMARYKINGDOMSJPROCNATLACADSCIUSA1977,7411508850904WILLIAMS,WILLKINS,BALTIMOREBERGEYSMANUALOFSYSTEMAICBACTERIOLOG
10、YM19862842965THOMPSONFL,KLOSEKEVIBRIOTHEFIRSTINTERNATIONALCONFERENCEONTHEBIOLOGYOFVIBRIOSJBACTERIOL2005,18813459245966WOESECRBACTERIALEVOLUTIONJMICROBIOLREVL987,512212717DUBNAUD,SMITHI,MORELLP,ETALGENECONSERVATIONINBACILLUSSPECIESCONSERVEDGENETICANDNUCLEICACIDBASESEQUENCEHOMOLOGIESJPMCNAILACADSCIUSA
11、1965,5424914988HUNTDE,DAVIDLA,GEVERSDRESOURCEPARTITIONINGANDSYMPATRICDIFFERENTIATIONAMONGCLOSELYRELATEDBACTERIOPLANKTONJSCIENCE2008,32058108110859YAMAMOTOS,HARAYAMASPCRAMPLIFICATIONANDDIRECTSEQUENCINGOFGYRBGENESWITHUNIVERSALPRIMERSANDTHEIRAPPLICATIONTOTHEDETECTIONANDTAXONOMICANALYSISOFPSEUDOMONASPUT
12、DASTRAINSJAPPLENVIRONMICROBIOL1995,6131104110910杨鸢劫,俞菊华,陈辉等暗纹东方鲢非O1群霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测J水产学报2006,30452553011BIOSCAEG,OLIVERJD,AMAROCPHENOTYPICCHARACTERIZATIONOFVIBRIOVULNIFICUSBIOTYPE2,ALIPPOLYSACCHARIDEBASEDHOMOGENEOUSOSERIGRAPHWITHINVIBRIOVULNIFICUSJAPPLENVIMICROBIOL1996,66391892712FOUZB,AMAROCISOLATIO
13、NOFANEWSEROVAROFVIBRIOVULNIFICUSPATHOGENICFOREELSCULTUREDINFRESHWATERFARMSJAQUACULTURE2003,21767768213韩先朴,卢全章鳗鲡弧菌病病原的分离与鉴定J微生物学报1984,24438639114林天龙,许斌福,董传甫等鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定J中国人兽共患病杂志2005,211199599715王国良,金珊,薛良义等海水网箱养殖鲈鱼皮肤溃疡病及其病原菌的研究J黄渤海海洋2000,183858916郭明元,刘广锋,冯娟1株军曹鱼病原弧菌的鉴定及其系统发育树分析J中国水产科学2006,13582382817
14、朱传华,何建国,黄志坚网箱养殖石斑鱼爆发性溃疡病病原菌分离、鉴定及致病性研究J中山大学学报2000,39327828218THOMPSONC,THOMPSONK,VANDEMEULEBROECKEK,ETALUSEOFRECAASANALTERNATIVEPHYLOGENETICMARKERINTHEFAMILYVIBRIONACEAEJINTERNATIONALJOURNALOFSYSTEMATICANDEVOLUTIONARYMICROBIOLOGY2004,545,91992419塞文婴,东秀珠定向进化同源基因在细菌系统进化研究中的应用J微生物学通报2000,27537738120谢珍玉
15、,胡超群弧菌毒力基因水平转移与进化的研究进展J热带海洋学报2005,243869521LINKOUSDA,OLIVERJDPATHOGENISISOFVIBRIOVULNIFWUAMINIREVIEWJFEMSMICROBIOLLETTERS1999,1741620721322於剑,艾必燕,樵星芳等16SRRNA的高级结构分析在细菌分类鉴定上的应用J重庆中草药研究2010,61293223李献梅,王小芬,杨洪岩等促旋酶B亚单位基因GYRB在鉴别细菌近缘种中的应用J微生物学报48570170624邴旭文,阎斌伦,张晓君等泥鳅病原霍乱弧菌的表型与分子鉴定J海洋与湖沼2009,406692698毕业
16、论文文献综述生物技术弧菌的分子鉴定研究相关进展摘要弧菌分布广泛，与人类生活关系密切。由于传统的弧菌分类鉴定中仍有诸多不足，如在弧菌及近似菌鉴定和某些相近弧菌种属细致分类等方面，近年来弧菌的种类也增加迅速，传统的分类鉴定局限性越来越明显。随着分子生物学技术的应用，弧菌的分子鉴定与系统发育学分析的意义日益彰显。本文主要介绍关于弧菌的分子鉴定以及系统发育分析的最新研究进展。关键词16SRRNA基因弧菌分子鉴定系统发育学分析前言弧菌是一大群菌体短小，弯曲成弧形的革兰阴性菌，弧菌与肠杆菌科的主要不同点是氧化酶试验阳性（麦契尼可夫弧菌除外）和有一根位于菌体一端的单鞭毛1。弧菌中主要致病菌有溶藻弧菌、副溶血
17、弧菌、拟态弧菌和霍乱弧菌等。1弧菌传统分类概述11弧菌分类学简述17世纪80年代，列文虎克首次观察到微生物标志着微生物形态学发展阶段的起始点，但是直至19世纪60年代初，关于弧菌类进行的观察和记载，仍然停留在形态学的简单分类上。19世纪60年代初，巴斯德（LOUISPASTEUR）、柯赫（ROBERTKOCH）等一批杰出的科学家建立了一套独特的微生物研究方法，成为微生物生理学分类的标志。在这个时期，炭疽病、霍乱和狂犬病等传染病的致病病因等重大发现，以及固体培养基的改进，划线法的纯种分离，建立了细菌细胞的染色技术，显微摄影技术和悬滴培养法，为弧菌的生理学分类提供了重要的生物技术基础。这时的弧菌分
18、类学主要以弧菌的生理生化特征为基础而进行分类学研究。20世纪50年代初，随着电镜技术和其他高技术的出现，对弧菌的研究进入到分子生物学的水平。1953年JDWATSON和FHCRICK发现了细菌基因体脱氧核糖核酸长链的双螺旋模型。1961年FJACAB和JMONOD提出了操纵子学说，指出了基因表达的调节机制和其局部变化与基因突变之间的关系，即阐明了遗传信息的传递与表达的关系2。1977年，CWEOSE等在分析原核生物16SRRNA和真核生物18SRRNA序列的基础上，提出了可将自然界的生命分为细菌、古菌和真核生物三域（DOMAIN），揭示了各生物之间的系统发育关系3，这标志着弧菌分类进入到分子水
19、平阶段。12弧菌的形态学分类传统形态分类学主要在菌落的形态特征，菌体的显微结构，如形状，弧度的大小，鞭毛的分布以及数量，荚膜的有无以及荚膜的形态特征以及弧菌的运动性等方面来对弧菌进行分类。弧菌科包括弧菌属、气单胞菌属与邻单胞菌属。多年来，许多学者致力于致病性弧菌的研究。伯杰氏系统细菌学手册1984，九版4自问世以来，有许多过去没能认定的致病性弧菌有所证实及归属。这在弧菌分类学历史上有非常重要的意义。13弧菌的生理生化特征分类目前根据生理生化特征鉴定弧菌的鉴定系统有API2ID32E系统、V18系统、BIOLOG2GN系统等。弧菌可以根据接触酶试验、氧化酶试验、葡萄糖发酵、氨基酸依赖性、硝酸盐还
20、原、药敏试验以及耐盐性检查等生理生化特征进行鉴定以及分类5。14弧菌的分类变化贝内克菌属与射光杆菌名称现已废止，将它们移入弧菌属，而发光杆菌属仍然保留。弧菌属中的鳗鱼弧菌和美人鱼弧菌移入了李斯特氏菌属，1986年获得公认。但不久美人鱼李斯特氏菌又移入发光杆菌属中。气单胞菌属的分类研究很不充分，对鲑致病的气单胞菌与其它单胞菌不同，无动力，在5生长，37不生长，能发酵葡萄糖产生少量气体，因此曾提出归入坏死气单胞菌属，但提案现未能通过，至今仍称为杀鲑气单胞菌。有人重新将气单胞菌从弧菌科分开，另设气单胞菌科。在该菌科中，包括弧菌属，发光杆菌属，也包括李斯特氏菌属及第瓦氏菌属。后者无致病性，一部分菌种以
21、前包括在丛胞菌属中。216SRRNA基因在分子鉴定中的应用2116SRRNA基因的研究传统细菌鉴定方法程序繁琐，时间长，费用高；同时对菌属中各菌种生理生化特性要有详细的认识；并且对鉴定工作者的要求也非常高。虽然酶联免疫吸附试验ELISA和免疫荧光试验IFA等免疫血清学方法大大提高了检测效率，但这些鉴定方法的抗原制备操作繁琐，检测周期至少也需要2天时间，仍无法满足快速鉴定各种弧菌的要求67。有学者通过对500多种不同生物的RRNA基因序列的分析发现其一级结构非常保守，某些序列甚至完全一致8。16SRRNA基因的可变区和恒定区互相交错排列，可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守9。由于16S
22、RRNA基因的功能同源性高且古老，分子大小便于研究，其演化速率和进化距离相对应，既含保守又有可变序列等，因此已是细菌分类学中最常用、最有用的分子鉴定基因。通过分析16SRRNA基因序列，可以判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近，如DNA杂交同源性在60一70以上，或细菌间16SRRNA序列同源性达97以上的菌株就可定为一个种，如同源性只有95，则判定为属于不同属10。WOESE等在通过对16SRRNA基因研究的基础上，已经构建了现已被世界公认的整个生物三域的系统发育进化树。2216SRRNA基因的研究特点16SRRNA基因序列有10个可变区VARIABLEREGION和11个恒定区CONSTAN
23、TREGION，可变区因细菌而异，变异程度与细菌的系统发育密切相关11。大量研究试验证明，总体来说，16SRRNA基因比较适合用于揭示各种生物物种间的种属亲缘程度。久远的演化历程中，16SRRNA基因进化速率非常缓慢，因此16SRRNA基因适合用于作为生物进化距离及其种属亲缘程度的分子标记。目前想获得16SRRNA基因的精确突变速率仍还有很多问题尚待解决，如相异的种群进化速率不同，相同的种群进化速率也不一定相同，且其基因中含有高速率突变的“热点”区以及高度保守区9。但鉴于16SRRNA基因的功能同源性高且古老，分子大小便于研究，其演化速率和进化距离相对应，既含保守又有可变序列等，因此已是细菌分
24、类学中最常用、最有用的分子鉴定基因。16SRRNA基因由大约1550个核苷酸组成，其长度既能够表现足够的种间多态性，又便于序列分析。除16SRRNA基因外，科学家也试图用其他核糖体RRNA基因如1623SRRNA基因区间以及很多蛋白质进行分析鉴定。但是经过大量相关实验后表明，尽管在个别种类细菌的鉴定上，那些基因相对来说有更好的分辨率13，但一般而言，16SRRNA基因更适用于判定不同类别细菌的分类学地位。2316SRRNA基因序列分析方法16SRRNA基因序列分析中，首先提取菌体的总DNA，利用PCR方法扩增获取样所得总DNA中的16SRRNA基因片段，再通过测序等方法获得该序列信息，然后与1
25、6SRRNA基因序列数据库中的数据进行比对，确定该样本在进化树中的位置，从而确定该菌的分类学地位，即其所属的科属种等。获得测序结果之后，一般会对其进行系统发育分析，即构建系统发育树。构建进化树的计算方法有最小进化方法，最大似然法，最大节约法，距离建树法和相邻连接方法等。常用的序列比对软件有BLAST、CLUTALW或CLUTALX183版本、MEGA、DNAMAN等，也有些在线序列比对网站点可以进行在线比对，服务器是常开的。当然，由于这些序列分析软件所使用的程序方法不同，结果也许各有差异。2416SRRNA基因在弧菌序列分析中的应用16SRRNA基因序列分析检测最大的优势是检测速度快，常规的细
26、菌鉴定和培养方法无法望其项背。而且有些用表型以及生理生化特征难以鉴定的弧菌，16SRRNA基因生物信息学分析可以对其分类地位给出准确的鉴定。241鉴别难以区分的弧菌16SRRNA基因序列分析鉴定一般能够精确到种的水平，因此可以用来鉴定用其他方法难于区分的弧菌。例如，有些相似弧菌之间致病力差异较大，但普通的形态学检测和生理生化指标测定对其难以区分，这给临床上的应用和水产品养殖病害的预防和诊治带来了诸多不便。因此应用16SRRNA基因可以快速鉴定表型上难以区分的弧菌，哈氏弧菌与创伤弧菌之间，以及鳗弧菌与双氮弧菌等通过表型难以区分，均可以通过16SRRNA基因来对弧菌进行鉴定和区别14。由于16SR
27、RNA基因序列分析是在进化基础上对弧菌进行分类，比通过表型分析方法分类更能确定弧菌之间的亲缘关系，因此可以纠正过去分类学上的一些错误认识。242鉴别临床或水产品养殖感染的弧菌弧菌与人类生活密切相关，许多弧菌与人类肠道感染性疾病以及水产品养殖感染性疾病等相关。据相关研究表明，已知的致病弧菌有70多种，哈维氏弧菌VHARVEY、副溶血弧菌VPARAHAEMOLYTICUS、溶藻弧菌VALGINOLYTICUS、鲨鱼弧菌VCARCHARIAE、霍乱弧菌（VCHOLERAE）、创伤弧菌VIBRIOVULNIFICUS、鳗弧菌VANGUILLARUM和最小弧菌VMIMICUS等是主要的致病弧菌15。郭明
28、元等16在军曹鱼体内分离出一株弧菌，通过测定其16SRDNA序列，构建了系统发育树，分析了相关弧菌的同源性，从而确定该致病弧菌为鲨鱼弧菌。243鉴定微生物环境中多种弧菌的群落演替通过对16SRRNA基因分析环境中弧菌群落组成的变化，可以发现其群落演替的规律和外界条件的改变对群落演替的影响等。利用16SRRNA基因分析，不仅速度快，且其精度更高,适于分析大量弧菌的种群变化规律研究1718。3弧菌基因的分子鉴定与系统进化分析3116SRRNA基因的局限但利用16SRRNA基因鉴定其生物学地位也有其局限性，基因横向水平转移及进化速度不同，从单一基因来推断整个生物界的系统进化，其鉴定结果容易出现偏差。
29、对于某些弧菌的16SRRNA基因系统进化分析，16SRRNA基因的分辨率有所不足1920。鉴于以上原因，因此近年来弧菌分子鉴定和系统进化在应用其他的基因与16SRRNA基因相结合从而共同鉴定的方向发展21。同时，关于16SRRNA高级结构分析在细菌分类上的鉴定的应用也取得了重大进展。3216SRRNA高级结构应用于分类鉴定20世纪80年代以来，一些学者开始转向了对16SRRNA二级结构的分析研究，并且已经取得了不小的进展。相关研究表明，16SRRNA二级结构可做为一个新分类指标，并作为系统分类的重要补充。相比一级结构而言，二级结构在系统分类中有着更独特的意义。首先，16SRRNA的二级结构具有
30、更高的保守性，尽管不同的RRNA的一级结构可能有所不同，但他们都可折叠成类似的二级结构即由多个臂环STEMLOOPSTRUCTURE所组成的结构。1983年，WOESE等比较分析了细菌界、古细菌界和真核生物界共150多个物种的16SRRNA基因全序列，详细论述了三界生物16SRRNA二级结构的特点，发现序列比较方法不但是预测假定结构的一个有力工具，而且有利于发现该分子的重要功能区段，同时指出二级结构上的改变可能导致能量变化并影响到功能22。33GYRB基因在弧菌分类学鉴定上的应用GYRB基因是编码促旋酶B亚单位的基因，普遍存在于细菌中。该基因进化速率较快,每100万年的平均碱基替换率为0708
31、。相关学者提出,GYRB基因能对假单胞菌、弧菌、气单胞菌等不同属内的近缘种进行分子鉴定,还可通过设计种特异性引物进行定量PCR,同时也能结合变性梯度凝胶电泳技术DGGE追踪微生物的动态。GYRB基因弥补了16SRRNA基因或ITS序列无法区分近缘种的缺陷,给近缘种的鉴别或其群体指纹图谱分析带来了新的曙光,是当前国内外用于近缘种研究的热点,是细菌系统发育分析上非常值得重视的新的分子鉴定基因之一。邴旭文等综合比较了GYRB基因与16SRRNA基因对霍乱弧菌的分辨率，实验证明，GYRB基因比16SRRNA基因在霍乱弧菌的鉴定上具有更高的分辨率2324。因此，在16SRRNA基因基础上，通过其与GYR
32、B基因相结合将会在分辨率以及高精度高通量等各方面上都有更优化的鉴定效果。34RECA基因在弧菌分类鉴定上的应用RECA蛋白具水解蛋白酶活性，RECA蛋白除参与DNA重组之外，还参与DNA修复、突变和细胞分裂，为多功能蛋白。在许多弧菌中均存在功能类似的RECA蛋白25。有研究发现，RECA基因对霍乱毒素基因在霍乱弧菌染色体上的拷贝扩增起作用，使菌株的毒力增强。MAHENTHIRALINGAM等发现利用RECA基因研究BURKHOLDERIA属所有细菌的分类，证明是RECA基因是非常有效的鉴定工具。THOMPSON等26利用RECA做标记研究弧菌科细菌的系统发育关系，表明RECA基因比L6SRRN
33、A具有更好的辨别能力，适合做为弧菌科细菌鉴定的工具。王成义等27通过实验发现，虽然霍乱弧菌VIBRIOCHOLERAE与拟态弧菌VIBRIOMIMICUS亲缘关系较近，但是比较两株进化树可知它们的发育学地位并不完全一致，根据16SRRNA基因建树结果两种不同的细菌混杂在一起，而依据RECA基因建树的结果能够把两种不同的细菌分开，霍乱弧菌与拟态弧菌的16SRRNA基因和RECA基因的序列同源性分别为994996、923931。4展望弧菌的分类和鉴定经历了漫长的研究阶段。随着分子生物学的发展，以细菌的形态学、生理生化等为特征的鉴定细菌方法逐渐被一种以可翻译核苷酸序列为基础的可定量、较精确的分析方法
34、所取代。1977年，CWEOSE等在分析原核生物16SRRNA和真核生物18SRRNA序列的基础上，提出了可将自然界的生命分为细菌、古菌和真核生物三域（DOMAIN），揭示了各生物之间的系统发育关系，这标志着弧菌分类进入到分子水平阶段。随着弧菌发现的种类的增加，以及分类学中新的问题的出现，新的分子鉴定基因不断出现，具有较高分辨率的分子基因如RECA基因、GYRB基因、DNAE基因、MDH基因和GAPA基因等多种基因与16SRRNA基因相结合，共同分析鉴定，从而将其精确定位。相信随着科学技术的发展，分子鉴定系统将会越来越完善，分子鉴定的精度也会越来越高，而且随着人们对基因的进一步深化了解和实验技
35、术的发展，那些通过分子鉴定也难以准确定位的物种终将准确定位。分子鉴定将会朝着系统化和高精度化发展。参考文献1东秀珠,蔡妙英常见细菌系统鉴定手册M北京科学出版社20011061282CRISTIANECTHOMPSON,ANACAROLINAPVICENTE,RANGELCSOUZAGENOMICTAXONOMYOFVIBRIOSJBMCEVOLUTIONARYBIOLOGY2009,9258213121483WOESECR,FOXGEPHYLOGENETICSTRUCTUREOFTHEPROKARYOTICDOMAINTHEPRIMARYKINGDOMSJPROCNATLACADSCIUSA1
36、977,7411508850904WILLIAMS,WILLKINS,BALTIMOREBERGEYSMANUALOFSYSTEMAICBACTERIOLOGYM19862842965THOMPSONFL,KLOSEKEVIBRIOTHEFIRSTINTERNATIONALCONFERENCEONTHEBIOLOGYOFVIBRIOSJBACTERIOL2005,18813459245966WOESECRBACTERIALEVOLUTIONJMICROBIOLREVL987,512212717DUBNAUD,SMITHI,MORELLP,ETALGENECONSERVATIONINBACILL
37、USSPECIESCONSERVEDGENETICANDNUCLEICACIDBASESEQUENCEHOMOLOGIESJPMCNAILACADSCIUSA1965,5424914988HUNTDE,DAVIDLA,GEVERSDRESOURCEPARTITIONINGANDSYMPATRICDIFFERENTIATIONAMONGCLOSELYRELATEDBACTERIOPLANKTONJSCIENCE2008,32058108110859YAMAMOTOS,HARAYAMASPCRAMPLIFICATIONANDDIRECTSEQUENCINGOFGYRBGENESWITHUNIVER
38、SALPRIMERSANDTHEIRAPPLICATIONTOTHEDETECTIONANDTAXONOMICANALYSISOFPSEUDOMONASPUTDASTRAINSJAPPLENVIRONMICROBIOL1995,6131104110910杨鸢劫,俞菊华,陈辉等暗纹东方鲢非O1群霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测J水产学报2006,30452553011BIOSCAEG,OLIVERJD,AMAROCPHENOTYPICCHARACTERIZATIONOFVIBRIOVULNIFICUSBIOTYPE2,ALIPPOLYSACCHARIDEBASEDHOMOGENEOUSOSERIGR
39、APHWITHINVIBRIOVULNIFICUSJAPPLENVIMICROBIOL1996,66391892712FOUZB,AMAROCISOLATIONOFANEWSEROVAROFVIBRIOVULNIFICUSPATHOGENICFOREELSCULTUREDINFRESHWATERFARMSJAQUACULTURE2003,21767768213韩先朴,卢全章鳗鲡弧菌病病原的分离与鉴定J微生物学报1984,24438639114林天龙,许斌福,董传甫等鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定J中国人兽共患病杂志2005,211199599715王国良,金珊,薛良义等海水网箱养殖鲈鱼皮肤溃疡病及其病
40、原菌的研究J黄渤海海洋2000,183858916郭明元,刘广锋,冯娟1株军曹鱼病原弧菌的鉴定及其系统发育树分析J中国水产科学2006,13582382817朱传华,何建国,黄志坚网箱养殖石斑鱼爆发性溃疡病病原菌分离、鉴定及致病性研究J中山大学学报2000,39327828218THOMPSONC,THOMPSONK,VANDEMEULEBROECKEK,ETALUSEOFRECAASANALTERNATIVEPHYLOGENETICMARKERINTHEFAMILYVIBRIONACEAEJINTERNATIONALJOURNALOFSYSTEMATICANDEVOLUTIONARYMICR
41、OBIOLOGY2004,545,91992419塞文婴,东秀珠定向进化同源基因在细菌系统进化研究中的应用J微生物学通报2000,27537738120谢珍玉,胡超群弧菌毒力基因水平转移与进化的研究进展J热带海洋学报2005,243869521LINKOUSDA,OLIVERJDPATHOGENISISOFVIBRIOVULNIFWUAMINIREVIEWJFEMSMICROBIOLLETTERS1999,1741620721322於剑,艾必燕,樵星芳等16SRRNA的高级结构分析在细菌分类鉴定上的应用J重庆中草药研究2010,61293223李献梅,王小芬,杨洪岩等促旋酶B亚单位基因GYRB
42、在鉴别细菌近缘种中的应用J微生物学报48570170624邴旭文,阎斌伦,张晓君等泥鳅病原霍乱弧菌的表型与分子鉴定J海洋与湖沼2009,40669269825张晓君,陈翠珍,阎斌伦等凡纳滨对虾病原副溶血弧菌的表型及分子特征J海洋与湖沼2009,40565466226THOMPSONFL,KLOSEKEVIBRIOTHEFIRSTINTERNATIONALCONFERENCEONTHEBIOLOGYOFVIBRIOSJBACTERIOL2005,188134592459627王成义,闰茂仓,陈少波等基于16SRRNA和RECA香鱼鳗利斯顿氏菌的分离鉴定J海洋通报2010,2918491本科毕业设
43、计（20_届）两株弧菌的分子鉴定目录摘要（ABSTRACT）1引言111弧菌分类学现状与分类学历史1111弧菌分类学现状1112弧菌分类学历史11216SRRNA简介与应用113研究的意义与内容22材料与方法221实验材料、仪器和试剂2211材料2212仪器与设备2213试剂322方法与步骤3221实验材料准备及形态学观察3222改良弧菌DNA提取方法3223DNA测定4224PCR扩增与测序4225生物信息学分析53结果与分析531两株弧菌的分离及形态学观察532两株弧菌的DNA提取及其测定63316SRRNA基因的PCR扩增与测序73416SRRNA基因序列分析835系统发育分析84讨论9
44、41形态学观察942改良弧菌DNA提取方法1043弧菌分子鉴定结果105结论10参考文献12附录13附录一XHS29号菌株的16SRRNA基因测序结果13附录二461号菌株的16SRRNA基因测序结果13摘要本文选用的环境样品为朱家尖浅水区水样，利用TCBS培养基培养梯度稀释平板法分离纯化出相应的两株未知优势弧菌。本文建立了一种基于CTABNACL法的改良弧菌DNA提取的方法，该法通过高盐和CTAB对黏性多糖的沉淀而除去多糖，从而从富含黏性多糖的弧菌中提取获得了高质量的DNA。以16SRRNA基因作为分子标记对环境样品中分离的两株未知弧菌样品进行系统发育学分析从而对其分类学地位进行鉴定，鉴定结
45、果为461号菌株为弧菌属（VIBRIO）的溶藻弧菌VALGINOLYTICUS，而XHS29号菌株为弧菌属（VIBRIO）的哈维氏弧菌VHARVEYI。关键词弧菌；16SRRNA；分子鉴定；系统发育学分析ABSTRACTTHISESSAYSELECTEDFORENVIRONMENTALSAMPLESFROMZHUJIAJIANPHYTALZONEANDUTILIZEDTHETCBSCULTUREMEDIUMTOCULTURE,SEPARATEANDPURIFYTHECORRESPONDINGDOMINATEVIBRIOSBYTHEMETHODOFSERIALDILUTIONOFWATERSAM
46、PLESAFTERTHEACQUISITIONOFTHECORRESPONDINGTWOSTRAINSOFVIBIROS,WEESTABLISHEDAIMPROVEDDNAEXTRACTIONMETHODBASEDONTHECTABNACLOFTHEVIBRIOSANDTHISMETHODUTILIZEDTHEHIGHSALTANDCTABTOREMOVETHEPOLYSACCHARIDEBYPRECIPITATINGTHEVISCOUSPOLYSACCHARIDE，INTHISMETHODWEACQUIREDHIGHQUALITYDNAFROMTHEPOLYSACCHARIDERICHVIB
47、RIOSWEMADEPHYLOGENETICANALYSESABOUTTHETWOSTRAINSOFSEPARATEDUNKNOWNVIBRIOSFROMENVIRONMENTALWATERSAMPLESANDIDENTIFIEDTHEIRTAXONOMICALSTATUSBYTHEMEANSOF16SRRNAGENEASAMOLECULARMARKERTHEIDENTIFICATIONRESULTSHOWEDTHATTHE461STRAINISTHEVALGINOLYTICUSOFTHEVIBRIOANDTHEXHS29STRAINISTHEVHARVEYIOFTHEVIBRIO。KEYWO
48、RDSVIBRIOS；16SRRNA；MOLECULARIDENTIFICATION；PHYLOGENETICANALYSES1引言11弧菌分类学现状与分类学历史111弧菌简介及分类学现状弧菌分布广泛，与人类生活密切相关1。传统形态分类学主要在菌落的形态特征和生理生化特征如菌体的显微结构形状，弧度大小，鞭毛数量与分布，荚膜有无与荚膜的形态特征以及弧菌运动性等方面和如革兰氏染色，发酵葡萄糖反应，氧化酶反应等相应的生理生化特征来对弧菌进行分类。多年来，许多学者致力于弧菌分类学的研究，伯杰氏系统细菌学手册1984，九版3自问世以来，有许多过去未能认定的致病性弧菌有所证实及归属，这在弧菌分类史上是一个
49、非常重要的里程牌。在众多的弧菌之中，不同种的致病性差异很大，而随着当今发现的弧菌种类日益增加，弧菌分类学在致病性差异上的研究日趋重要。如O1型霍乱弧菌被WHO定为国际检疫菌，但许多与O1相似菌株却并不具备致病性2。但是目前弧菌分类学系统仍有诸多不足，而且随着日益增加的弧菌种类和近似菌种的细致区分以及由于菌种之间致病因子的横向基因转移等导致传统的分类鉴定的局限性日益明显。112弧菌分类学历史17世纪80年代，列文虎克首次用自制显微镜观察到微生物这标志着微生物形态学发展阶段的起始点。但直至19世纪60年代初，关于弧菌分类学所进行的观察和记载，仍只停留在形态学基础分类上4。219世纪60年代初，巴斯德（LOUISPASTEUR）、柯赫（ROBERTKOCH）等一大批杰出科学家建立了一套独特的微生物研究方法，成为微生物生理生化分类学的标志5。在这个时期，霍乱和狂犬病等传染病的致病病因等重大发现，以及固体培养基的改进，划线法的纯种分离，建立了细菌细胞的染色技术，显微摄影技术和悬滴培养法，为弧菌的生理学分类提供了重要的生物技术基础。这时的弧菌分类学主要以弧菌的生理生化特征为基础而进行分类学相关研究。20世纪50年代初，随着分子生物学的兴起以及日益增加的高新技术出现，对弧菌的研究进入到分子生物学的
