1、OPA1 基因突变与常染色体显性视神经萎缩关系的研究项目可行性报告2009 年 12 月2目 录一、立项的背景和意义 .3二、国内外研究现状和发展趋势 .5三、研究开发内容和技术关键 .6四、预期目标（主要技术经济指标、知识产权申请情况、应用前景） .7五、研究方案、技术路线、 组织方式与课题分解 .8六、计划进度安排 .12七、现有工作基础和条件 .13八、经费预算 .163一、立项的背景和意义视神经萎缩是由于视网膜神经节细胞及其轴索受到病理性损害后发生的退行性变。其 遗传方式主要分 为以下几种：常染色体 显性遗传(autosomal dominant inheritance)，常染色体隐性
2、遗传(autosomal recessive inheritance)，X 连锁显 性 遗传(X-linked dominant inheritance)，X 连锁隐性遗传(X-linked recessive inheritance)，Y 连锁遗传(Y-linked inheritance)，母系遗传(maternal inheritance)。常染色体显性视神经萎缩(autosomal dominant optic atrophy, ADOA)，也称Kjer 型 视神经萎缩，是一种呈现进行性视力减退的 遗传性视神经病变。 该病常在儿童期发病，发病率为 1:10 000-1:50 000，患
3、病男女比例为 1:1，视力损伤进程及损伤的严重程度不同，眼底表 现为：视盘苍白， 视觉诱发电位(VEP) 呈振幅减小，潜时延长， 组织病理学表现为 ：视网膜神经节细胞退行性变。除视觉功能障碍外，疾病还可伴有神经、心血管及骨骼肌系统异常。OPA1基因定位于 3q28-q29，约1.1Mb，含31个外显子，编码一种与线粒体形态及线粒体DNA (mtDNA) 稳定性维持有关的动力相关GTP 酶， 该蛋白包含五个功能域：线粒体前导序列 (外显子1，2)，N末端螺旋卷曲结构 (外显子5-7) ，GTPase区 (外 显子8-16) ，中央动力区 (外显子17-24) 和C末端螺旋卷曲结构 (外显子27-
4、28)。OPA1基因通过选择性剪切产生8个mRNA亚型，在人体内不同部位均有表达，原位杂交和免疫 组化结果显示：在视网膜表达比较丰富。研究表明：ADOA的发病主要与OPA1基因突变有关。目前，已经发现205个与ADOA发病有关的OPA1突变（http:/lbbma.univ-angers.fr/lbbma.php?id=9 ），多数4集中在GTPase 区、中央动力区以及C末端螺旋卷曲结构区。申请者所在课题组自2004年以来一直致力于Leber遗传性视神经病变(LHON)发病机制的研究，我院与北京、福建以及全国各地其他医院的合作，已经收集视神经萎缩病例800余例，同时 ，我 们已经对所收集病例
5、 进行LHON相关的mtDNA三个原发位点的筛查，并发现 400多个携带三个原发突变位点的家系。然后，我 们对这些家系进行了线粒体全基因组测序分析。其结果整理发表在包括Ophthalmology.(IF: 5.296)，Invest Ophth Vis Sci (IF:3.582)，Mitochondrion (IF:4.262)，biochemical and biophysical research communications (IF 2.648)和中华医学遗传学杂志等国内外知名杂志十余篇。本课题的研究目的在于了解中国人群ADOA的临床表现及遗传规律，寻找与ADOA发病有关的OPA1基因
6、新突变，绘制中国人群OPA1基因突变谱，探索OPA1基因突变在ADOA发生发展中的作用，从而进一步阐述疾病的发病机制，为遗传咨询的开展、疾病的 预防、干 预和治疗提供理 论基础。5二、国内外研究现状和发展趋势在国外，Eiberg et al于1994年对3个丹麦家系进行连锁分析，发现3号染色体的端粒区(3q28-qter) 与该病 紧密连锁，并将该基因命名 为OPA1；1997年，Votruba et al对 5个英国家系的研究，将OPA1基因定位于3q28-q29 ；2000年，Delettre et al发现OPA1基因突 变与ADOA 的发病有关。到目前 为止，已经发现205个与ADOA
7、发病有关的OPA1 突变，认为主要通过单倍剂量不足或 显性负效应机制导致疾病的发生。Olichon et al通过siRNA使得OPA1 基因表达下调，线粒体异常聚集,这说明OPA1基因对线 粒体分布起作用。人类和鼠RNA干扰 以及HeLa 细胞中RNA干扰实验研究表明：OPA1 基因表达受累会 导致线粒体断裂以及嵴结构破坏，以及 线粒体膜动作电位消失，可能导致 线粒体介导的凋亡。 Lodi et al 报道携带OPA1 突变的ADOA病人中，mtDNA拷 贝数减少，骨骼肌内ATP合成减少，这进一步支持ADOA的发病与线粒体能量系统有关。以上研究均表明：OPA1 基因对mtDNA数目和线粒体形
8、态的维持以及线粒体代谢的正常进行起着重要作用。在国内，2006年，Ke T et al 在一个中国家系中发现OPA1基因c.1202GA (p.G401D) 突 变与ADOA 和耳聋有关；2007年，Chen S et al 发现一个ADOA家系携带杂合c.2848_2849delGA (p.Asp950CysfsX4)突变，该突变也与耳聋有关；2008年，Li Y et al 发现 OPA1基因杂合剪切突 变c.985-2AG和杂合错义突变c.2197CT (p.R733X)与ADOA的发病有关。综上所述，国内学者主要着重于寻找与ADOA有关的OPA1 基因新突 变，而关于 OPA1基因突变
9、与ADOA发病关系的细胞功能学研究甚少。本项目将对有明显常染色体显性遗传特征以及不携带LHON相关的三个原6发位点病例进行OPA1 基因突 变热点区的筛查，寻找与 ADOA有关的OPA1基因新突变，然后，对重点家系进行OPA1全基因组分析，绘制中国人群中OPA1基因突变谱，并对新突变导致ADOA发病的分子机制进行生物信息学分析以及细胞功能学研究，探索OPA1基因突变在疾病的发生发展过程中的作用，进一步阐述ADOA发病的分子机制，为遗传咨询， 产前诊断，疾病的预防和治疗提供理论基础。7三、研究开发内容和技术关键（一）研究开发内容：寻找与常染色体显性视神经萎缩相关的 OPA1 基因新突变，绘制中国
10、人群的 OPA1 基因突变谱，建立永生淋巴 细胞系进行细胞功能学研究。我们将对有明显常染色体显性遗传特征以及不携带三个LHON相关mtDNA原发位点的家系进行OPA1基因突变热点区(外显子 8，9，12和27)的筛查，寻找与常染色体显性视神经萎缩相关的OPA1基因新突变 位点，通 过对重点家系成员的OPA1全基因 组的扩增分析，绘制中国人群的OPA1基因突变谱。此外，对发现的新突变用生物信息学方法进行氨基酸保守性分析和空间结构预测，并建立永生淋巴细胞系，观察线粒体形 态， 实时定量PCR对mtDNA拷贝数进行检测，以及对细胞氧消耗率进行测定。（二）技术关键“建立永生淋巴细胞系”的工作有一定难度
11、，但是：1. 课题组成员在近 6 年的前期准备工作中，已经熟练掌握细胞培养等相关技术，先后完成了十余个家系淋巴细胞的培养工作；2. 同时，本课题依托浙江省重点研究实验室，主要开展眼科疾病的基础及应用研究，能为本课题提供实验需要的所有仪器和设备；3. 此外，申请者所在的研究团队由实验室学术委员会主任领导，该教授在药物性耳聋、Leber 遗传性视神经病变以及原发性高血压等方面目前居于国际领先水平。教授将在建立永生淋巴细胞系给予理论和技术的支持。8综合上述有利因素，相信本课题组能够顺利解决技术关键。9四、预期目标（主要技术经济指标、知识产权申请情况、应用前景）在两年内，我们将继续收集视神经萎缩病例，
12、并 进一步完善已收集家系的临床和家系资料。同时，我们对所收集病例进行 OPA1 基因的全面系统分析，寻找与 ADOA 相关的 OPA1 基因新突 变，绘制中国人群中 OPA1 基因突变谱；对发现的新突变用生物信息学方法对其进行氨基酸保守性分析和空间结构的预测；此外，建立永生淋巴细胞系进行细胞功能学研究。本研究将有助于我们进一步理解视神经萎缩的发病机制，从而为疾病的遗传咨询、 产前诊断以及临床防治提供理论基础。 对提高患者的生活质量、减 轻社会负担，具有重大的社会效益。本课题的研究结果预计能够在国内外重要学术刊物上发表论文 1-3 篇，同时可在本院建立一支团结互助、高素质、高水平的研究队伍， 这
13、不仅可以提高我院对遗传性疾病研究的整体水平，也可提高我市及至我国在视神经萎缩等相关领域的研究水平。10五、研究方案、技术路线、 组织方式与课题分解（一）本课题的研究方案如下：1. 视神经萎缩家系的收集：本院通过与北京、福建以及全国各地其他医院的合作，预计收集到 100 个明显具有常染色体显性遗传特征的视神经萎缩家系。2. OPA1 全基因组分析：在所收集的视神经萎缩病例中，我们对有明显常染色体显性遗传特征以及不携带三个 LHON 相关 mtDNA 原发位点的家系进 行 OPA1 基因突变热点区 (外显子 8，9，12 和 27) 筛查 。对携带 OPA1 基因新突变 的重点家系进行详细的临床和
14、遗传学研究。 认真阅读并签署知情同意书后， 详细 了解患者及亲属相关资料 (包括姓名、性别、出生日期、籍贯 、发病年龄等)，然后， 对其进行相关的眼科学 检查 ：视力(发病时视力和现在视力) ，视 野检查，色 觉检查，眼底摄影，视觉诱发电 位(VEP)，并采集静脉血3ml，EDTA 抗凝，-20 冰箱保存备用。酚/氯仿法提取患者及其家系成员全血 DNA，紫外分光光度计 DU-800 测定DNA 浓 度，对 OPA1 基因进行 PCR 扩增( 引物参照 Pesch UE et al)，纯化， 测序，与标准序列(NM_015560)比对，绘制中国人群中 OPA1 基因突变谱。3. 生物信息学分析：对发现的新突变通过生物信息学方法进行氨基酸保守性分析以及蛋白空间结构预测， 进一步阐述视神 经萎缩发生、 发展的可能机制。氨基酸保守性分析：
