1、本科毕业设计（20_届）应用电子鼻对几种腐败菌的鉴别研究所在学院专业班级食品质量与安全学生姓名学号指导教师职称完成日期年月2目录0引言11材料和方法211原料和试剂212仪器和设备22方法321培养基的制备3211牛肉膏蛋白胨液体培养基制备3212牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制备3213灭菌过程3214倒平板322菌种的准备3221菌种活化3222涂布3223液体接种3224平板接种培养4225平板菌落计数423电子鼻的检测4241线性判别式分析4242主成分分析43结果与讨论431菌落总数测定432电子鼻原始数据533主成分分析734线性判别式分析835第一主成份的LDA和PCA分析936LOAD
2、INGS分析94小结10致谢103摘要研究目的通过电子鼻对腐败菌的快速鉴定研究，为发展快速无损定量检测食源性微生物提供一定研究基础。方法与结果本研究利用基于金属氧化物传感器的电子鼻技术检测荧光假单胞杆菌（PSEUDOMONASFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LISTERIAINNOCUA）两种致病菌培养液的挥发性代谢产物，结合化学计量学方法主成分分析（PCA）和线性判别分析（LDA）对电子鼻原始数据进行统计学分析。PCA模式识别结果显示该技术能够很好的将两种细菌在培养液中的挥发性代谢产物谱图进行区分，LDA模式可以使组间变异和组内变异的比率达到最大，为电子鼻技术定量检测致病菌提供了有
3、效支撑。意义与传统的微生物检测方法相比，基于气味指纹技术的电子鼻检测具有高效、快速、简便的特点。因此对这种检测手段的应用方法研究，对追踪食源性疾病来源和控制食源性疾病流行具有重要的意义，也是解决当前食品安全问题的迫切需求。关键词电子鼻；腐败菌；主成份分析；线性判别分析ABSTRACTAIMSTHROUGHTHEELECTRONICNOSEFORRAPIDIDENTIFICATIONOFSPOILAGEBACTERIA,FORTHEDEVELOPMENTOFRAPIDNONDESTRUCTIVEQUANTITATIVEANALYSISOFFOODBORNEMICROORGANISMSTOPROV
4、IDEARESEARCHFOUNDATIONMETHODSANDRESULTSINTHISSTUDY,WEHAVEUSEDAMETALOXIDESENSORBASEDELECTRONICNOSETODETECTBACTERIAPSEUDOMONASFLUORESCENSANDWALESLISTERIAMONOCYTOGENESBACTERIACULTUREFLUIDOFTWOVOLATILEMETABOLITES,COMBINEDWITHCHEMOMETRICMETHODSPRINCIPALCOMPONENTANALYSISPCAANDLINEARDISCRIMINANTANALYSISLDA
5、ONTHEELECTRONICNOSERAWDATAFORSTATISTICALCREDITSTHERESULTSSHOWTHATTHEPCAPATTERNRECOGNITIONTECHNIQUECANDISTINGUISHSPECTRAOFVOLATILEMETABOLITES,LDAMODELALLOWSVARIATIONBETWEENGROUPSANDTHEGROUPREACHEDTHEMAXIMUMRATEOFVARIATIONFORQUANTITATIVEELECTRONICNOSEPROVIDEEFFECTIVESUPPORTFORDETECTIONOFPATHOGENSSIGNI
6、FICANCECOMPAREDWITHTRADITIONALMICROBIOLOGICALTESTINGMETHODS,BASEDONELECTRONICNOSEODORDETECTIONFINGERPRINTTECHNOLOGYISANEFFICIENT,RAPIDANDSIMPLEFEATURESTHEREFORE,THEAPPLICATIONOFTHISMETHODOFTESTINGMEANS,FORTRACKINGANDCONTROLOFFOODBORNEILLNESSFROMFOODBORNEEPIDEMICSISOFGREATSIGNIFICANCE,BUTALSOSOLVETHE
7、URGENTNEEDSOFFOODSAFETYISSUESKEYWORDSELECTRONICNOSESPOILAGEBACTERIAPRINCIPALCOMPONENTANALYSISLINEARDISCRIMINANTANALYSIS10引言近年来我国食品安全问题日趋严峻，食品细菌性中毒占各种食物中毒之首，食源性致病菌导致的疾病已经成为危害食品安全问题的最主要原因之一。其中荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）可以从伤口、痰、胸水、尿和血液中分离出来，可导致输血后不可逆的休克，具有临床意义；威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）细菌会引起大肠癌和乳腺癌等疾病。这些食源性疾病主要是通过被污染
8、的食物和水源等而感染，因此建立一种快速、准确的检测方法对追踪食源性疾病来源和控制食源性疾病流行具有重要的意义，也是解决当前食品安全问题的迫切需求1。微生物的检测方法较多，传统方法依靠微生物的培养及形态学生理生化实验，但耗时长效率低敏感性差，不能及时检出样品中的病原菌。现代免疫学和分子学等方法主要针对微生物的蛋白质和核酸进行检测，特异性效率高，但是这些方法往往需要对微生物进行富集培养或者细胞壁提取DNA等，样品预处理过程比较复杂，而且达不到实时检测的目的2。1982年英国WARWICK大学的PERSUAD和DODD模仿哺乳动物嗅觉系统的结构和机理提出了电子鼻的概念，电子鼻又称气味扫描仪、人工嗅觉
9、分析系统，是20世纪90年代发展起来的一种实现快速分析气味的新颖仪器，有一定选择性的电化学传感器阵列和适当的模式识别系统组成，能够识别简单和复杂气味的仪器，其工作原理类似人的鼻子，故称之为“电子鼻”。基于气味指纹技术的电子鼻检测方法主要是针对微生物的挥发性代谢产物,对样品本身没有什么特殊要求,无需对样品本身进行任何处理,具有检测迅速、灵敏度高、使用寿命长、成本低廉，因而在微生物快速无损检测方面具有良好的应用前景。微生物挥发性代谢产物（MICROBIALVOLATILEORGANICCOMPOUNDS,MVOCS）是微生物代谢产物的重要组成部分，是重要的信息素，也是人类了解微生物生命活动本质规律
10、的重要窗口3。不同微生物个体的MVOCS往往不同，它们一般具有种属特征，因此这些气味物质以及由它们组成的气味指纹图谱可以潜在的被用来作为微生物鉴定与检测的依据。早期研究中，学者们主要利用顶空技术结合气相色谱和质谱仪（GCMS）对微生物的挥发性代谢产物进行分析，然而由于GCMS技术对操作要求比较高，前期处理相对复杂等，这逐步阻碍了它们对微生物气味指纹的研究4。最近，PAVLOU等人运用电子鼻技术区分了14株梭菌属细菌和12株BACTEROIDESFRAGILIS细菌的气味指纹；在国内，疍勋涛等人利用自己开发的气味浓缩电子鼻提高了两株病原菌的区分能力，表明电子鼻技术在微生物快速检测上具有应用潜力5
11、，6。另外由于不同种类的细菌菌体所含的酶系统不同,从而分解能力不同造成其代谢产物不同。另外,由于细菌生长要经历迟缓期、对数期、稳定期、衰退期四个阶段，所以对同一细菌的不同生长阶段,挥发物的浓度也有差异。也就是说在同样的培养基中培养一定时间后,对营养基质的利用情况和所产生的产物就会不同。电子鼻主要由气敏传感器阵列、信号处理系统和模式识别系统等功能器件组成，如下图一所示。在电子鼻系统中，气敏传感器阵列是整个系统的基础，具有不同的选择性，利用其对多种气体的交叉敏感性，将不同的气味分子在其表面转化为可测定的电信号，实现混合气体分析7。目前电子鼻传感器的主要类型有导电型传感器、压电式传感器、场效应传感器
12、、光纤传感器等，最常用的气敏传感器的材料为金属氧化物、高分子聚合物材料、压电材料等。在信号处理系统中的模式识别部分主要采用人工神经网络和统计模式识别。2电子鼻的工作原理的类似于人体嗅觉系统，按照人的嗅觉形成过程，电子鼻对气味的分析识别过程包含三个部分（1）气敏传感器阵列与气味分子反应后，通过一系列物理化学变化产生电信号；（2）电子信号经过电子线路，将信号放大并转换成数字信号输入计算机中进行数据处理；（3）处理后的信号通过模式识别系统，最后定性或者定量的输出对气体所含成分的检测结果8。本研究利用基于金属氧化物传感器的电子鼻技术检测荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LIN
13、NOCUA）两种致病菌培养液的挥发性代谢产物，结合化学计量学方法主成分分析（PCA）和线性判别分析（LDA）对电子鼻原始数据进行统计学分析。PCA模式识别结果显示该技术能够很好的将两种细菌在培养液中的挥发性代谢产物谱图进行区分，LDA模式可以使组间变异和组内变异的比率达到最大，为电子鼻技术定量检测致病菌提供了有效支撑9。1材料和方法11原料和试剂菌种荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）牛肉膏蛋白胨液体培养基（又称营养肉汤，用于培养细菌）成分牛肉膏3G，蛋白胨10G，氯化钠5G，蒸馏水1000ML，PH74牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（又称营养琼脂培养基，用于
14、培养细菌）成分牛肉膏3G,蛋白胨10G，氯化钠5G，琼脂15G，蒸馏水1000ML，PH74碎冰12仪器和设备电子鼻仪器电子分析天平高压蒸汽灭菌锅无菌操作台电热恒温振荡培养箱低温冷冻箱其他培养皿，滴定管，钥匙，泡沫箱，烧杯，量筒（250ML），锥形瓶（500ML），移液枪（1510L10100L1001000L）,枪头，酒精灯，涂玻棒，签字笔，接种环，保鲜膜，一次性手套，酒精灯等2方法21培养基的制备211牛肉膏蛋白胨液体培养基制备制法将15G牛肉膏，5G蛋白胨，25氯化钠和500ML蒸馏水各成分按照配方比例溶解于水中，以1MOL/L氢氧化钠溶液校正PH为74，分装三角瓶（分装量以三角瓶容积的
15、1/2到2/3为宜）或试管（分装至试管高度1/4左右为宜）。本实验将培养基分装于50ML三角瓶内。212牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制备制法将15牛肉膏，5G蛋白胨，25G氯化钠，75G琼脂和500ML蒸馏水各成分溶解于水中，以1MOL/L氢氧化钠溶液校正PH为74。213灭菌过程本实验所用高压蒸汽灭菌锅采用01MPA，121，20MIN灭菌条件。3（1）首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。（2）放回内层锅，并装入上述培养基和平皿板。（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，防止漏气。（4）用电驴加
16、热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。带冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力所需时间。214倒平板右手持盛培养基的500ML锥形瓶放置火焰旁边，用左手将试管塞轻轻拔出，锥形瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞。左手持培养皿并将皿盖在火焰旁打开一缝，迅速倒入平皿板约15ML，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。最后用保鲜膜密封平皿板，隔绝外面空气，防止杂菌污染。22菌种的准备221菌种活化在无菌操作台内操作，使用前打开无菌室紫外灯辐照灭菌
17、30分钟以上，并且同时打开超净台进行吹风。紫外灯辐照灭菌后，将接种环灼烧，冷却，挑取少量上述菌种于50ML液体培养基内，荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA），置于30的电热恒温振荡培养箱内隔夜培养。222涂布将上述两种菌液用100到1000L的移液枪分别吸取1ML原始菌液与固体培养基上，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然后改变90沿另一条直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次，室温下静置5到10MIN。标注威尔斯菌和荧光假单胞杆菌，置于30的电热恒温振荡培养箱内隔夜培养。22
18、3液体接种用接种环挑取平板上单个菌落于20ML液体培养基，标注荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA），置于30的电热恒温振荡培养箱内隔夜培养。224平板接种培养将事先灭菌密封的平皿板用记号笔分别标明101，103，105，107的荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS），威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）和实验日期等。采用梯度稀释平板计数法，即在无菌水平净化台里，用100L移液枪吸取100L的菌液，加入900L的灭菌生理水，制成110的均稀释液，再依次进行L00倍递增稀释，至适当稀释度103，105和107后，采用平板划线分离法划线用无菌接种环挑取上述
19、配置液在平板培养基上作连续划线。每个梯度做一个平行。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于30的电热恒温振荡培养箱内隔夜培养。225平板菌落计数取出隔夜培养的103，105，107三个梯度共12个荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）平板，然后测定两个菌的菌体数量，根据大部分菌体量在100到200且比较分散，采用全部计数；其余采用平均四份，取其中一块4，得到菌体数量。计算公式每毫升样品中菌落形成单位数（CFU）同一稀释度2次重复的平均菌落数稀释倍数4根据所得菌落形成单位数，吸取一定量菌液于液体培养基，标注威1，威2，威3，荧1，荧2，荧3和空白培养基置于30的
20、电热恒温振荡培养箱内隔夜培养。23电子鼻的检测电子鼻采用静态顶空气方法对样品进行分析。首先将装好样的样品瓶进行加热振荡使样品在瓶中迅速达到多相平衡，接着由自动进样器抽取样品瓶中顶空的部分气体并直接打入传感器箱，最后通过传感器与样品气体进行反应。本实验中电子鼻参数具体如下菌液浓度15109CFU/G，信号总获取时间100S，信号频率10S，载气为合成干燥空气，载气流速300ML/MIN，进样体积2ML,温度常温。24数据分析241线性判别式分析线性判别分析是一种常用的分类方法，使用该方法需要样本空间呈正态分布，并有相等的离差。构造的判别函数由原始变量经线性组合得出，能够最大限度地区分不同的样本集
21、，在降低数据空间维数的同时最大限度地减少信息丢失。这种数学分类规划则将N维空间分成一些子空间，并将其定义在直线、平面或超平面上。这种计算判别函数的方法可以使组间变异与组内变异的比率最大。由于LDA具有分类效果好、易实现等优点，所以成为在电子鼻系统中应用十分广泛的方法，并都取得了良好的效果。242主成分分析主成分分析是将所提取的传感器多指标的信息进行数据转换和降维，并对降维后的特征向量进行线性分类，最后在PCA分析的散点图上显示主要的两维散点图。PCA1和PCA2上包含了在PCA转换中得到的第一主成分和第二主成分的贡献率。贡献率越大，说明主要成分可以较好的反映原来多指标的信息。一般情况下，总贡献
22、率超过70到80的方法即可使用1012。3结果与讨论31菌落总数测定根据以下原则计数菌落总数菌落总数在100以内时，按其实有数报告；大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的倍数来表示。如下表1显示的是不同稀释度的荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）的菌落总数。计算方法涂布平板计数法CFU数/MLG样品同一稀释度两次重复实验的平均菌落数稀释倍数表1荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）的菌落总数TABLE1THETOTALPLATECOUNT
23、OFPFLUORESCENSANDLINNOCUA例次稀释度及其菌落数两稀释液的菌落数乘稀释倍数之比报告方式CFUG103105107威尔斯李斯特菌多不可计多不可计1451510914014109荧光假单胞杆菌多不可计多不可计13714109136141095由上述表格得出威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）的菌落总数为（145140）/210714109荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）的总数为（137136）/210714109通过菌落总数可以得出荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）的菌液体细菌的浓度在109CFU/ML左右。此目的在于消除周
24、围环境对测试结果的影响，主要是消除菌落数量多少的不同对测试结果的影响。因此在后续步骤中将培养好的菌液分装到10ML的培养瓶中，取样量为2ML/瓶，每个样品做两个平行重复。以上操作对两个菌都一样。32电子鼻原始数据对各个样品依次用电子鼻进行检测，得到各样品的电子鼻输出信号与采集时间的关系。以威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）1号样品为例，图1为各个传感器对同一样品威尔斯菌的响应曲线。图1威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）的10根传感器的响应曲线FIGURE1THETENSENSORRESPONSECURVEOFLINNOCUA图2荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）的10根传感器的响应曲线
25、FIGURE2THETENSENSORRESPONSECURVEOFPFLUORESCENS6实验检测每个样品时，数据采集时间为100秒，共有10根传感器。图中横轴为时间轴，共100秒，纵轴为响应强度，每条曲线代表一个传感器在100秒内的相应值变化1314。从图1中可以看出，随着采集时间的延长，传感器1到10的输出信号逐渐变化，由图明显可以看出威尔斯李斯特菌大致在20秒时候达到最大相应值，在80秒后逐渐趋于稳定。在其它培养瓶下的同种菌液，用电子鼻进行检测，得到的电子鼻输出信号与采集时间关系和图1类似。图2显示的是各个传感器样品对荧光假单胞杆菌的响应曲线。与图1比较可以发现两者存在明显区别，该菌
26、是在40秒时达到最大响应值，然后趋于稳定。表2传感器及其对应的挥发性物质类型TABLE2SENSORANDITSCORRESPONDINGTYPEOFVOLATILESUBSTANCES阵列序号传感器名称性能描述备注1（浅红）W1C芳香成分甲苯10MLM32（黄色）W5S灵敏度大，对氮氧化合物很灵敏NO21MLM33（浅绿）W3C氨水，对芳香成分灵敏苯10MLM34（蓝色）W6S主要对氢气有选择性H2100MLM35（橘红）W5C烷烃芳香成分丙烷1MLM36（棕色）W1S对甲烷灵敏CH4100MLM37（紫色）W1W对硫化物灵敏H2S1MLM38黑色W2S对乙醇灵敏CO100MLM39灰色W2
27、W芳香成分，对有机硫化物灵敏H2S1MLM310（墨绿）W3S对烷烃灵敏CH410MLM3表2是该电子鼻的传感器及其对应的挥发性物质类型，与图1和图2相对应，可以看出威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）对W5S和W1S比较敏感，而荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）对W5S和W2S比较敏感，说明两组样品之间的挥发性物质强度存在差异。各个传感器输出信号随采集时间变化而变化的趋势反映的是各传感器对气味的敏感程度，也蕴含了电子鼻测试样品时所获得的总体信息。通过各个传感器响应强度值信息的比较，如下图3荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）在100秒传感器的相
28、应值，清晰说明从传感器信号响应值的不同可以判断两组样品之间的挥发性物质强度存在差异。图3从左到右是威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）和荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）在100秒时传感器的相应值7FIGURE3LINNOCUAANDPFLUORESCENSFROMLEFTTORIGHTISTHE100SECONDSCORRESPONDINGVALUESOFTHESENSOR经过比较我们可以得出以下结论第一，不同的传感器对同一样品的响应曲线是不同的，说明每根传感器对样品的响应具有选择性。第二，同一传感器对不同样品的敏感性存在差异，比如W5S在威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）的信号相应值
29、强度最大为70而在荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）的信号响应值强度最大为34，而且两者最大相应值时间也不同。综上得出不同传感器对不同样品反应的敏感程度不同。同时，从传感器信号的不同也可以判断威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）和荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）样品之间的挥发性物质强度存在差异15。33主成分分析主成分分析主要是将传感器响应的特征向量矩阵进行数据转换和降维，并对降维后的特征向量进行线性分类，最后将分类结果以PCA散点图的形式展现出来。其基本思想是将众多的变量重新组合成一组新的互相无关的几个综合变量，同时根据实际需要从中取出几个较少的总和变量并尽可能多地反映原来变
30、量的信息。因此，前几个主成分如第一个主成份（PC1）和第二个主成份（PC2）基本包含了传感器的响应结果。图4为气味指纹图的分析信息，图5为威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）和荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）以及空白培养液的气味指纹PCA图。图4气味指纹图的分析信息FIGURE4ANALYSISOFODORFINGERPRINTINFORMATION8图5威尔斯李斯特菌（LINNOCUA），荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和空白培养液气味指纹PCA图FIGURE5THEODORFINGERPRINTPCAMAPOFLINNOCUA，PFLUORESCENSANDBLANKME
31、DIUM从图5可以看出威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）和荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）两种样品的三个重复点能够很好的聚在一起形成一个个组群，进一步表明分析的重复性合格。其中纵坐标第一主成份为74625，横坐标第二主成份为20251，整体上讲，第一主成份和第二主成份之和为94876，总贡献率超过70，表明区分合格。从第二主成份上看，从左到右依次为空白培养液、荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）培养液和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）培养液；而且从第一主成份上看，两种菌和空白培养液有明显三个层次。表明荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）培养液和威尔斯李斯特菌（LINNO
32、CUA）培养液的挥发性代谢产物呈现出不同的释放。结合图4的分析结果也可以进一步验证基于微生物的挥发性代谢产物的研究对微生物的区分是可行也是有效的。34线性判别式分析线性判别是一种常用的分类方法，由原始变量经线性组合构造出判别函数，能够最大限度地区分不同的样本集，在降低数据空间维数的同时，最大限度地减少信息丢失。对空白培养液、荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）培养液和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）培养液进行LDA分析，如图6所示，其总贡献率达到99948，其中第一主成份为53075，第二主成份为46874，大于PCA散点图的94876。与PCA相比较威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）
33、和荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）两种样品的三个重复点集中，从左到右依次为空白培养液、威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）和荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）培养液，且比PCA区分度高，这表明荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）的区域没有交叉，采用LDA法也能很好的反映两种菌液的挥发性物质存在明显差异，特别在第二主成份上更显著。图6荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS），威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）和空白培养液气味指纹LDA图FIGURE6THEODORFINGERPRINTLDAMAPOFLINNOCUA，PFLUORESC
34、ENSANDBLANKMEDIUM935第一主成份的LDA和PCA分析分别用LDA法和PCA法对荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）以及空白培养液的第一主成份进行分析16，即图5和图6的纵坐标比较可以得出结果，如图7图7左图是LDA，右图是PCAFIGURE7LEFTISLDA,THERIGHTISPCA通过比较我们可以得出LDA第一主成分的响应强度明显呈现3个梯度，威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）能够很好的与荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和空白培养液区分开，而荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和空白培养液区的第一主成份区别差异相
35、对比较小。相对而言PCA第一主成份的响应强度存在明显区域。通过比较我们可以得出荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）的挥发性物质的强度也存在明显差异。36LOADINGS分析利用LOADINGS分析可以帮助区分当前模式下传感器的相对重要性，传感器贡献率越高，则该传感器的识别能力越强17，见图8图8荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）的LOADINGS分析FIGURE8THELOADINGSANALYSISOFPFLUORESCENSANDLINNOCUA10从图8中我们可以看出电子鼻的10个传感器，基本上对荧光假
36、单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）的挥发性物质都有响应，其中传感器W5S对第一主成份贡献率最大，W1S，W2S和W2W对第二主成份的贡献率比较大，W6S,W3S,W1C，W3C和W5C对两个主成份贡献率差不多。由表2可知，传感器W5S主要对氮氧化合物比较灵敏，W1S主要对甲烷比较灵敏，W2S主要对乙醇比较灵敏。因此，综合分析得出荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）的挥发性代谢产物主要是氮氧化合物、乙醇类和芳香型化合物。两者在挥发性代谢产物上区别不是很大。4小结本实验采用金属氧化物气敏传感器检测了荧光假单胞杆菌（PF
37、LUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）两种细菌在培养液中的挥发性代谢产物，同时以空白培养液作比较。通过主成份分析，线性判别式分析并结合LOADINGS分析对传感器相应值进行识别和分析，结果表明基于气味指纹的电子鼻技术能够较好的区分荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）两种细菌培养液，利用LOADINGS分析得出两种菌的主挥发性答谢产物区别不大，传感器W5S对第一主成份贡献率最大，W1S，W2S和W2W对第二主成份的贡献率比较大，表明两种菌的主要挥发性气体是氮氧化合物、乙醇类和芳香型化合物。因此，根据线性判别式分析和主成份分析得出荧光假
38、单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）培养液的挥发性物质主要在强度相应值存在明显差异，PCA和LDA方法同时显示两种细菌的气味和响应强度与空白培养液有一定差异，并且根据第一主成份分析表明荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）的气味信息与空白培养液接近，而威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）与其它样品的气味信息差异最大。虽然荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）培养液能区别空白培养液，但其是否能区别其它所有的食源性致病菌尚缺乏比较，另一方面，本实验只是对纯培养的菌做了检测，未曾具体用于食品微生物的检测。因此，本实验的目的
39、在于通过电子鼻对腐败菌的快速鉴定研究，为发展快速无损定量检测食源性微生物提供一定研究基础。相对于传统的微生物检测方法，电子鼻用于微生物的检测基于气味指纹的检测技术，其主要针对于微生物的挥发性代谢产物，对样品没有特殊的要求，操作简单，费时短灵敏度高，最重要的是在操作过程中不需要对样品进行任何破坏处理18，从本次实验中也可以看出。另外，2005年，BALASUBRAMANIAN等用手提式电子鼻系统检测了牛肉中培养的沙门氏菌。2008年，SIRIPATRAWAN等用电子鼻检测新鲜蔬菜中的食源性致病菌。可见，电子鼻在微生物快速检测中是一项非常有发展前景的无损伤快速检测方法19，20。从生物分类学角度上
40、看，两种腐败菌归属于两种不同属，依次分别是荧光假单胞杆菌（PFLUORESCENS）的假单胞菌属和威尔斯李斯特菌（LINNOCUA）的李斯特式菌属。两者在基因序列以及代谢表型上应该是有一定差别的，因此两种菌对空白培养液的利用会呈现差异性，从而其挥发性代谢产物也必然存在一定差异。因此，实验表明基于气味指纹的电子鼻技术具有区分微生物的潜在能力，有望在致病菌快速检测和鉴定方面进一步得到利用。参考文献1唐月明,王俊电子鼻技术在食品检测中的应用J农机化研究,2006,10101691712邱丹丹,刘嘉电子鼻及其在食品分析中应用研究进展粮食与油脂,2010,636383张卓旻,李攻科生物体产生的挥发性有机
41、物的分析J化学通报,2006,6924梁华正,张燮,饶军等微生物挥发性代谢产物的产生途径及其质谱检测技术J中国生物工程杂志,2008,112811241335喻勇新,孙晓红应用电子鼻检测食源性致病菌的研究化学通报,2010,21541596喻勇新,刘源,孙晓红,赵勇基于电子鼻区分三种致病菌的研究传感技术学报,2010,110137周亦斌,王俊电子鼻在食品感官检测中的应用进展J食品与发酵工业,2004,3041291328唐向阳,张勇,丁锐电子鼻技术的发展与展望J机电一体化,2006,411159NATALECDIETALANELECTRONICNOSEFORFOODANALYSISJSENSO
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43、检测虾新鲜度的研究J食品科技,2010,35224624916胥勋涛,田逢春,闫嘉,等结合气体浓缩的电子鼻伤口病原菌快速检测J传感技术学报,2009,22330330617裴晓燕,刘秀梅食源性致病菌定量检测方法研究进展J国外医学卫生学分册,2004,31525726418DUTTARELECTRONICNOSEBASEDTEAQUALITYSTANDARDIZATIONJNEURALNETWORKS,20031684785319BHATMCHARYYAN,SETHSMONITORINGOFBLACKTEAFERMENTATIONPROCESSUSINGELECTRONICNOSEJJOURNALOFFOODENGINEERING,2007801146115620王俊,胡桂仙,于勇,周亦斌电子鼻与电子舌在食品检测中的应用研究进展J农业工程学报,2004,202292295
