1、本科毕业设计（20_届）用16SRRNA基因对九种蟹系统学分析所在学院专业班级海洋生物资源与环境学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言111蟹类的生物学特征112研究历史与现状113研究意义214主要研究内容215应解决的问题32实验材料与方法321样品322试剂323设备324实验方法33结果与分析431核苷酸组成分析432遗传距离分析733系统进化树84结果与讨论841线粒体基因与动物系统发育重建842本研究中9种蟹的系统发育分析95小结10致谢11参考文献12摘要蟹类是水产养殖中的重要经济物种，分布广泛于咸淡水中，具有一定的经济价值。但由于从形态学和细胞学上对其分类有一定的难度，
2、所以利用分子生物学手段鉴定其种类，研究其系统发育情况已经成为主流。本文利用蟹类的线粒体16SRRNA基因片段序列分析的方法，对9种蟹类进行了分子系统学研究。经多重比对和软件分析，得到了种间序列的遗传距离并构建了最大简约（MP）系统树。结果表明秉氏厚蟹和日本蟳两种蟹类具有较近的亲缘关系，这与他们在传统形态学分类上的分类地位有出入。而其余蟹类的进化关系与传统分类学结果是相一致的。该研究可以为蟹类的分类问题及亲缘关系提供一定的分子生物学依据。关键词蟹类；系统发育；线粒体16SRRNA基因；亲缘关系ABSTRACTCRABISANIMPORTANTECONOMICAQUACULTURESPECIES,
3、WHICHWIDELYDISTRIBUTEDINSALTYANDFRESHWATERANDHASSOMEECONOMICVALUEHOWEVER,DUETOTHETHEIRCLASSIFICATIONBASEDONMORPHOLOGYANDCYTOLOGYHASACERTAINDIFFICULTY,SOUSETHEMEANSOFMOLECULARBIOLOGYTOIDENTIFYTHETYPESANDSTUDYTHEPHYLOGENYSITUATIONOFTHEMHAVEBECOMINGMAINSTREAMINTHISPAPER,WEUSETHEMITOCHONDRIAL16SRRNAGENE
4、SEQUENCEANALYSISANDCARRYOUTTHE9KINDSOFCRABSMOLECULARSYSTEMATICSAFTERMULTIPLECOMPARISONANDSOFTWAREANALYSIS,WEGETTHESEQUENCEOFTHEGENETICDISTANCEBETWEENSPECIESANDBUILDAMAXIMUMPARSIMONYMPPHYLOGENETICTREETHERESULTSHOWSTHATTHREECRABSOFHELICEPINGIANDCHARYBDISJAPONICAHAVEACLOSERRELATIONSHIP,WHICHHASTHEDISCR
5、EPANCYOFTHEIRCLASSIFICATIONPOSITIONFORTRADITIONALMORPHLOGICALCLASSIFICATIONTHEEVOLUTIONARYRELATIONSHIPSOFTHEREMAININGCRABSANDTHETRADITIONALTAXONOMYISCONSISTENTWITHTHERESULTSTHESTUDYCANPROVIDEAMOLECULARBIOLOGYBASISOFTHECLASSIFICATIONPROBLEMSFORCRABSANDRELATIONSHIPSKEYWORDSCRABSPHYLOGENETICMITOCHONDRI
6、AL16SRRNAGENERELATIONSHIPS11引言11蟹类的生物学特征111简介蟹是十足目（DECAPODA）短尾次目的甲壳动物，尤指短尾族（BRACHYURA）的种类（真蟹），也包括其他一些类型，如歪尾族（ANOMURA）的种类。常见的有关公蟹、梭子蟹、溪蟹、招潮蟹、绒螯蟹等属，总共约4500种，见于所有海洋、淡水及陆地。通常以步行或爬行的方式移动。蟹类通常为杂食性，多食腐，有些能与其他动物共生。112分布范围大部分蟹类生活于海中，甚至热带国家数量丰富的陆蟹，也不时到海里活动，其生命的早期也在海中度过。世界大部分温暖地区都有丰富的淡水蟹资源，例如南欧长于河水中的春蟹（POTAMON
7、FLUVIATILE）。蛙蟹科、馒头蟹科、玉蟹科、梭子蟹科、扇蟹科主要生活在沿岸带；方蟹科、沙蟹科生活在广阔的潮间带。极少数如漂泊蟹和弓腿蟹能附着在木材或其他漂浮物上生活。也有不少种类与其他动物营共栖生活，如绵蟹科，关公蟹科。许多种如豆蟹常潜入一些软体动物的外套腔中、或多毛类的管道中共栖。一小部分蟹类完全在淡水中生长繁殖，它们多栖息于山区溪流的石块下。还有少数蟹类如地蟹能适应陆地生活，穴居于潮湿的泥洞中，繁殖时期则迁移下海。113形态特征蟹的身体分为头胸部与腹部。头胸部的背面覆以头胸甲，形状因种不同而不一样。额部中央具第1、2对触角，外侧是有柄的复眼。口器包括1对大颚，2对小颚和3对颚足。头胸
8、甲两侧有5对胸足。腹部退化，扁平，曲折在头胸部的腹面。雄性腹部窄长，多呈三角形，只有前两对赴肢变形为交接器；雌性腹部宽阔，第25节各具1对双枝型附肢，密布刚毛，用以抱卵。114经济价值蟹类中可供食用的主要有三疣梭子蟹、远海梭子蟹、青蟹和中华绒螯蟹等，具有较高的营养价值。蟹壳可用以提炼工业原料甲壳素，也可提制葡糖胺。有些蟹类可作中药用。蟹幼体或成体可作饲饵或饲料。所以蟹类具有很好的经济价值和市场开发力。12研究历史与现状121背景几乎所有蟹类的幼体刚从卵中孵出时外形与成体完全不同。幼体成为溞状幼虫，体微小，同名，圆形，无肢体，在海面上游泳。蜕皮几次后体型开始增大，成为大眼幼体，这时身体及肢体才更
9、像蟹，再蜕皮一次外形方似成体。所以在蟹幼体时，肉眼很难辨别其种类，但很久以来，关于海洋动物的分类及系统进化关系研究仍局限于对其形态学和细胞学方法。由于形态学和细胞学特征往往是基因表达的结果，可比较的分类信息较少且易受到环境等多种因素影响，所以关于包括蟹在内的许多水生动物的分类及系统进化关系一直是困扰人们的难题。自20世纪60年代以来，蛋白质和DNA等信息大分子被广泛应用于生物系统学研究，克服了在利用形态学和细胞学方法对海洋动物做分类和系统进化研究时的诸多缺点，消除了很多海洋动物分类和系统进化研究中的争议，极大地促进了海洋动物分子系统学的发展1。DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受环境、生物发
10、育阶段及器官组织的影响，因而能较为准确地反映出各个物种间的系统发生关系。而在这其中，线粒体DNA（MTDNA）的优势又更加明显。其具有母系遗传、变异大、无组织特异性等优点，且检测方便，因而在动物的分类、遗传变异分析和系统进化等领域应用广泛。其中尤以编码线粒体细胞色素C氧化酶亚基1（CYTOCHROMECOXIDASESUBUNITI，简称COI）和16SRRNA基因在动物2分子系统学的研究中应用最为广泛。截止到目前为止，国内外报道的利用C0I和16SRRNA基因对生物做系统学分析的文章数量很多，但是所用的实验材料也是涉及了多个种类的生物，其范围很广，另外，同时结合C0I和16SRRNA基因研究
11、方法的文章也不多，大部分是针对其中一种方法的研究。比如，有基于16SRRNA基因序列多样性利用指纹方法构建微生物的分类和识别系统2；利用对虾属线粒体DNA基因序列构建其系统发生关系和演化史等。国内的相关研究成果也有很多，其实验对象涵盖了脊椎和无脊椎动物的大部分种类，从原生动物到哺乳动物均有见报，但是作蟹类的系统学分析较为少见，也有一些用蟹做的研究，但都局限于某一种属的蟹类之间的比较。如，吉鹏宇3等做了六种青蟹群体的线粒体16SRRNA和COI基因部分序列差异的研究（2008）其中的观点也得到了马凌波的证实；有对三疣梭子蟹线粒体DNA16SRRNA和COI基因片段序列的比较研究4；相手蟹属两种蟹
12、类线粒体16SRRNA基因序列的比较5等等诸如此类的分析报道。122在动物遗传多样性方面的研究动物遗传多样性的研究对揭示动物表型多样性的本质及建立动物种质资源库的工作具有非常重要的意义。总体来说，该工作还处于起步阶段。具有代表性的工作是关于梭子蟹的研究。梭子蟹是我国重要的海洋经济蟹类，做好梭子蟹科种质资源的保护及可持续开发及利用具有非常重要的意义，因而梭子蟹明确科内各属的系统进化关系是当务之急。郭天慧4等对三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）线粒体基因片段分析发现其种内变异较低，在3个样本中基因片段有比较多的插入或缺失，同源性为372，进而奠定了以基因片段研究梭子蟹遗传
13、多样性的理论基础。此外，吉鹏宇3等人，对从广东阳江，广东吴川，广东珠海，福建东山，海南海口，海南三亚等六地区采集的6个青蟹群体进行分子遗传变异差异的研究，结果表明东山等六地青蟹群体根子遗传背景基本相似。123在蟹类分类中的应用除了上述的两项实验，分子生物学手段研究系统发育关系，在蟹类中的其他的研究也比较多。一些国外学者采用C0I基因片段探究了东亚地区的绒螯蟹属系统进化关系，采用NJ和ML法的聚类分析结果支持新绒螯蟹属为一个独立的属，而直额绒螯蟹都是绒螯蟹属所有其他成员的姐妹群，因而不支持平绒螯蟹属是一个有效的属。国内也有学者做过类似的研究。邱高峰6等利用PCR技术，扩增了中华绒螯蟹、独额绒螯蟹
14、线粒体16SRRNA片段，经测序，与GENBANK数据库中的日本绒螯蟹和台湾绒螯蟹16SRRNA同源序列进行比较。结果表明，中华绒螯蟹与日本绒螯蟹亲缘关系最近，然后与台湾绒螯蟹聚为一支，独额绒螯蟹则成为相对独立的一支。此外，孙红英7等人做了中国大陆绒螯蟹线粒体16SRDNA序列变异与分子鉴定标记工作；孔晓瑜8进行了中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体C0I基因片段的序列比较研究。此外，徐敬明5等测定了相手蟹属红螯相手蟹与褶痕相手蟹线粒体16SRRNA基因部分片段的序列，结果表明，分布与中国的3种相手蟹种，无齿相手蟹和红螯相手蟹的亲缘关系最近，而它们与褶痕相手蟹的亲缘关系则较远。13研究意义线粒体基因以
15、其特殊的组成结构和演化方式在生物分子系统学的研究中具有不可取代的作用，并已经广泛地应用与海洋动物的分类、系统进化和遗传多样性等方面的研究中。总体来说，迄今为止，对不同种类的蟹进行分子生物学方法的系统发育分析还不多见，本实验以不同种类的蟹为实验材料进行16SRRNA基因比较研究，期望可以给日后的蟹种间的差异份析提供一些参考数据和理论依据。14主要研究内容3包括研究材料不同种螃蟹的采集和购买；对样品进行一系列分子生物学处理，主要包括线粒体DNA的提取、PCR扩增和产物纯化、测序、数据分析以及系统发育树的构建；得出最终结论，形成论文。15应解决的问题通过对几种蟹类的16SRRNA的序列等相关问题的研
16、究，并构建系统发育树，从而弄清这几种蟹类的在系统发育上的关系，进一步实践分子生物学手段在生物种类鉴别和系统发育研究上的优势。2实验材料与方法21样品本实验所用的样品均采购于水产品市场，共计9种，分别是三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）、锯缘青蟹（SCYLLASERRATA）、中华绒螯蟹（ERIOCHIERSINENSIS）、日本蟳（CHARYBDISJAPONICA）、秉氏厚蟹（HELICEPINGI）、隆线拳蟹（PHILYRACARINATA）（俗称和尚蟹）、日本大眼蟹（MACROPHTHALMUSJAPONICUS）、红星梭子蟹（PORTUNUSSANGUINOL
17、ENTUS）和细点圆趾蟹（OVALIPESPUNCTATUS）。每种螃蟹取2只个体，其中1只活体解剖后，取一定量的肌肉组织于15ML的离心管中，放置于80保存备用；另一只放置于标本瓶中，用70的酒精浸泡，以便于查证。22试剂本实验用到的试剂有LISIS细胞裂解液、20MG/ML蛋白酶K、苯酚氯仿异戊醇（25241）混合液、氯仿异戊醇（241）混合液、3M乙酸钠溶液、80冰乙醇、TE溶解缓冲液、25LPCR反应液、10MOL/L的正、反方向引物、去离子水。23设备本实验用到的设备有关超低温冰箱、水浴锅、离心机、PCR扩增仪，电泳仪。24实验方法241基因组DNA的提取DNA的提取参照分子克隆实验
18、指南（SAMBROOK等，2001）的苯酚氯仿抽提法抽提基因组DNA，具体步骤如下（1）取100MG附肢肌肉，置于15ML离心管中，加入100LLISIS裂解缓冲液，剪刀剪碎肌肉；（2）加入450LLYSIS裂解液和45L20MG/ML蛋白酶K，充分混匀，55水浴34H至澄清；（每隔20MIN摇一下，至液体呈透亮。）（3）冷却至室温，加入550L苯酚氯仿异戊醇（25241），去蛋白，上下颠倒混匀10MIN，12000RPM，4离心10MIN；（4）吸取上清液于新的离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇（241），除去残留蛋白及酚，上下颠倒混匀5MIN，12000RPM，4离心10MIN；（5）小心吸
19、取上清液于新的离心管中，加入08倍体积的3M乙酸钠溶液，20沉淀30MIN，12000RPM，4离心10MIN；（6）弃上清，800L70冰乙醇洗涤，10000RPM，4离心8MIN；（7）弃上清，室温下风干沉淀，加入100LTE溶解缓冲液溶解沉淀；（8）产物在1的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察检测是否有目的条带后，20保存备用。242PCR扩增基因片段扩增所用引物的核苷酸序列为16SRRNA引物15GCCTGTTTATCAAAAACAT3，引物25CCGGTCTGAACTCAGATCACGT3。PCR反应总体积为25L，其中含模板DNA50100NG，10PCR4BUFFER25L，上、
20、下游引物各012MOL/L，DNTPS02MMOL/L，MGCL22MMOL/L，TAQ酶TIANGEN02U。在ICYCLER热循环仪BIORAD上进行PCR反应94预变性2MIN；94变性45S，48退火1MIN，72延伸1MIN，35个循环；72延伸5MIN。PCR扩增产物经12琼脂糖凝胶检测，电泳缓冲液为1TAEPH80，电压为4V/CM，常温电泳，核酸染料染色，于凝胶成像系统下观察并拍照记录。243PCR产物纯化及测序PCR产物电泳检测后，于紫外灯下切割目的条带，用上海生工公司UNIQ10PCR产物纯化试剂盒纯化。采用ABIPRISMTM测序系统进行双向测序。244数据分析测序后所有
21、序列用INFORMAX软件进行编辑、校对和对位排序，并对排序结果进行分析和手工校正。然后采用MEGA40分子进化遗传分析软件对所有目的基因片段进行数据处理及群体遗传结构分析，计算核苷酸组成和种间遗传距离，基于最大简约法构建该类群的16SRRNA的分子系统树，节点的置信度检验采用BOOTSTRAP分析（1000个循环）。3结果与分析31核苷酸组成分析将扩增得到的9种螃蟹的16SRRNA序列用CLUSTUALX18软件进行比对。将比对结果手工剪切，校正后用MEGA40统计，结果发现每种样品的AT含量均高于GC含量，符合线粒体DNA碱基组成特点。9种螃蟹的同源序列组成见图1，其核苷酸组成百分比见表1
22、。567图19种螃蟹16SRRNA同源片段组成FIG1HOMOLOGOUFRAGMENTSOF16SRRNAFOR9SPECIESOFCRAB表19种螃蟹16SRRNA基因片段核苷酸组成特征TABLE1NUCLEOTIDECOMPOSITIONOF16SRRNAFOR9SPECIESOFCRAB螃蟹名称TUCAGAT总长红星梭子蟹3501913291306794860三疣梭子蟹3661763471127134840锯缘青蟹3711743511047224820细点圆趾蟹3461923501126954890中华绒螯蟹3611753631007244680隆线拳蟹3881523639775147
23、40秉氏厚蟹3751003431827185100日本蟳3581193491737075190日本大眼蟹366334451568116340均值364142363131727505116SRRNA基因片段经CLUSTALX18比对分析，共截取642个碱基组成的同源片段，其中有102个碱基序列为保守序列，不计插入/缺失片段，有640个位点存在核苷酸变异。其中，相对保守的序列片段分布于89BP到189BP之间。所有比对片段中A、C、G、T的平均含量分别为363、142、131、和364，AT的含量较高，平均为727。32遗传距离分析将9种蟹类的16SRRNA基因片段的比对结果输入软件，根据序列变异
24、和碱基转换比值和颠换比值的加和值，计算物种之间的相对遗传距离，并构成矩阵，具体见表2。9种蟹类的16SRRNA基因序列遗传矩阵显示，其最小遗传距离仅为58000，出现在三疣梭子蟹和红星梭子蟹之间，说明它们的亲缘关系较近。8表29种蟹类16SRRNA基因序列的相对遗传距离矩阵TABLE2PAIRWISEDISTANCEMATRIXOF16SRDNAGENEFRAGMENTAMONG9SPECIESOFCRAB拉丁名123456781PORTUNUSSANGUINOLENTUS2PORTUNUSTRITUBERCULATUS580003SCYLLASERRATA73000750004OVALIPE
25、SPUNCTATUS100000108000760005MACROPHTHALMUSJAPONICUS1470001510001390001440006PHILYRACARINATA1190001270001160001120001450007HELICEPINGI2600002580002580002590002620002520008CHARYBDISJAPONICA257000257000255000260000257000255000860009ERICROCHIERSINENSIS29200027800027700029400028200028400027600028700033系统
26、进化树用最大简约法（MAXIMUMPARSIMONY）构建9种蟹类的16SRRNA基因序列系统演化树。在构建系统发生树时，用BOOTSRAP法检验，1000次重复抽样得到结点的置信度以自引导值估计。9种蟹类的系统发生树见图2。图29种蟹类的16SRRNA序列系统树FIG2PHYLOGENETICRELATIONSHIPSAMONG9SPECIESBASEDONMPANALYSISFROM16SRRNADATA4结果与讨论41线粒体基因与动物系统发育重建线粒体基因已经被证明适合于分子系统学研究，在细菌、贝类、虾类、蟹类和鱼类等生物的分子系统学研究中均被广泛地应用。尽管线粒体DNA仅占整个真核生物
27、总DNA的1以下，但其在研究物种的遗传分化方面具有独到的优势。其中，利用C0I和16S基因片段键的DNA序列差异性构建的分子系统树已经解决了很多动物之间的系统发生关系。2007年报道，雷忻9等人采用PCR扩增、测序的方法，对鹟亚科6属16种鸟类的线粒体COI基因序列1176BP进行测定，并以荒漠伯劳和发冠卷尾作为外群构建BAYES、ML、MP3棵系统发育树。结果支持寿带属、扇尾鹟属、方尾鹟属3属于鹟亚科其他鸟类亲缘关系较远，PORTUNUSSANGUINOLENTUSPORTUNUSTRITUBERCULATUSSCYLLASERRATAOVALIPESPUNCTATUSPHILYRACARI
28、NATAMACROPHTHALMUSJAPONICUSHELICEPINGICHARYBDISJAPONICAERIOCHIERSINENSIS975710097991000204060801001201409扇尾鹟属于方尾鹟属亲缘关系较近，鹟属为单系发生。该结论解决了鹟亚科部分属间的进化关系，为鹟亚科分类系统的研究提供了分子水平证据。此外，陈丽梅10等以C0I基因片段作为分子标记初步研究了大竹蛏、长竹蛏和小刀蛏（CULTELLUSATTENUATUS）之间的分子系统进化关系，统计数据结果显示大竹蛏与长竹蛏的遗传距离为01712，而两竹蛏类与小刀蛏的遗传距离分别为02662和02933，作者认
29、为小刀蛏与竹蛏之间的遗传距离已达到科之间的水平，所以陈丽梅等支持将其提升为刀蛏科的分类观点。这一结论得到了基于16SRRNA片段序列的聚类分析结果的支持，从而解决了存在争议的几种蛏类的分类及相互亲缘关系问题。此外，陈丽梅还用海参11做了类似的实验，结果也支持这一结论。目前，对星虫动物演化地位的确定也存在争议。针对这一问题，陈子安12等对三种星虫16SRRNA和C0I基因片段序列进行比较，并对其系统发生进行了初步探讨。数据结果支持3种星虫和环节动物的分类地位较近，与软体动物较远的分类观点。其他一些科研工作者也做了很多工作，比如，孔晓瑜13等人用该方法验证了中日韩三国几种魁蚶种间的距离已达到了亚种
30、，甚至种的水平。郑文娟14等人也通过实验证明16SRRNA和C0I基因可以作为研究泥蚶不同地理群体的遗传变异、多样性评估、亲缘关系等方面的很好的分子标记，也可以应用于品种的鉴定、资源保护和利用、遗传育种等方面。类似的实验，还用到了海豚15、浮游桡足类16、文蛤17、真虾18、对虾19、文昌鱼20以及罗非鱼21等生物作为实验材料，可见利用这种方法做生物的系统发育体系的构建，已经日趋成熟。42本研究中9种蟹的系统发育分析从分析得到的9种蟹类的遗传距离表中可以注意到，除了三疣梭子蟹和红星梭子蟹的距离最近之外，秉氏厚蟹和日本蟳的距离也较近，为86000。从系统发育树上看，两种螃蟹也是单独聚成一支。但根
31、据1991年出版的浙江动物志甲壳类一书22中，我们可以查到，秉氏厚蟹属于方蟹科（GRAPSINAE），相手蟹亚科（SESAARMINAE），厚蟹属（HELICE），而日本蟳属于梭子蟹科（PORTUNIDAE），梭子蟹亚科（PORTUNINAE），蟳属（CHARYBDIS），按照传统的分类学，秉氏厚蟹应该与同属于方蟹科的中华绒螯蟹的亲缘关系更近。将它们的16SRRNA序列经过INFORMAX软件分析比对后发现，秉氏厚蟹与日本蟳的序列相似性达到了692，而秉氏厚蟹与中华绒螯蟹的序列相似性只有448。从形态学上看，秉氏厚蟹和日本蟳在眼窝、头胸甲形状和步足形状等方面均有不同。从生活习性上看，秉氏厚蟹生
32、活在潮间带泥沙滩上，而日本蟳生活于低潮线附近，栖居于有水草或泥沙的水底或潜伏于石下。从地理分布上看，两种螃蟹在东海、南海均有分布。从两者的地理分布相同，但是外形和生活习性不同这一情况来分析，可以推测两者可能具有共同的祖先，后来由于环境因素的影响，两者在外部形态上才形成了一定的差异。因为，日本蟳虽然属于梭子蟹科，但它与诸如三疣梭子蟹等具有典型梭子蟹特征的蟹类，在外部形态上也有着一定的差异。比如，日本蟳额前具6齿，侧缘也具6齿，而三疣梭子蟹额具2锐齿，前侧缘连外眼窝在内具9齿，其中第9齿最为长大，向两侧刺出，这是日本蟳所没有的特征。所以也可以推测，日本蟳与秉氏厚蟹可能是具有同一祖先的两种类群，虽然
33、形态上随着外界环境因素的变化而发生了变化，但由于线粒体DNA的保守性，其基因却没有发生太大的变化。从系统树中可以看到，红星梭子蟹、三疣梭子蟹、锯缘青蟹和细点圆趾蟹四种蟹首先汇合。由于形态分类学上，红星梭子蟹和三疣梭子蟹均属于梭子蟹属（PORTUNUS），锯缘青蟹属于青蟹属（SEYLLA），而这两属归于梭子蟹亚科，细点圆趾蟹则属于大蟾蟹亚科（MACROPIPINAE），圆趾蟹属（OVALIPES），大蟾蟹亚科和梭子蟹亚科隶属于梭子蟹科，所以在这四种蟹类的进化关系上，利用分子系统学研究得出的结果与传统分类学是相一致的。随后，隆线拳蟹和日本大眼蟹这一支也汇合进来，由于在形态上与前述几种蟹类的差异较大
34、，所以这也是与系统树显示的结果一致。最后，中华绒螯蟹与上述8种蟹类的亲缘关系最远，几10乎独立成为一支。从其生活习性上看，由于其常穴居于江、河、湖等淡水水域的泥岸，与其他蟹类的生境有着明显的差别，所以这也是与系统树上所反应出的情况相吻合。5小结本研究利用分子生物手段将9种蟹的系统演化进行了研究，探讨了它们之间的亲缘关系，反映出了不同蟹类之间的遗传差距，从而较好地对属、种间的分子分类及系统演化等问题进行研究。蟹类在甲壳动物系统分类及水产养殖等方面占有重要地位，因此其属种间的亲缘关系是个值得深入研究的课题。本研究方法的建立不仅有助于从分子水平上对蟹类种类鉴定、遗传变异、系统演化及相关类群亲缘关系的
35、进一步研究，而且是传统形态分类学的重要补充和完善。11参考文献1毕相东,杨雷,侯俊利,等COI基因在海洋动物分子系统学研究中的应用J水产科学,2008,2721051082ZHANGQINGYI,CHENGQIQUN,GUANWEIBINGMITOCHONDRIAL16SGENESEQUENCEVARIATIONANDTAXONOMICSTATUSOFTHREEMACROBRACHIUMSPECIESJZOOLOGICALRESEARCH2009,3066136193吉鹏宇,沈琪,唐小林,等六个青蟹群体的线粒体16SRRNA和COI基因部分序列差异J海洋湖沼通报,2008,69774郭天慧,孔
36、晓瑜,陈四清,等三疣梭子蟹线粒体DNA16SRRNA和COI基因片段序列的比较研究J中国海洋大学学报,2004,34122285徐敬明,张俊丽,方华华,等相手蟹属两种蟹类线粒体16SRRNA基因序列的比较J水产科学,2006,2594434476邱高峰,徐巧婷,王丽卿,等四种绒螯蟹分子分类与系统发育J动物学报,2001,4766406477孙红英,周开亚,杨小军从线粒体16SRRNA序列探讨绒螯蟹类的系统发生关系J动物学报,2003,4955925998孔晓瑜,喻子牛,刘亚军,等中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体COI基因片段的序列比较研究J青岛海洋大学学报,2001,3168618669雷忻,廉振
37、民,雷富民,等基于线粒体COI基因探讨鹟亚科部分属和种的分类地位J动物学研究,2007,28329129610陈丽梅,孔晓瑜,喻子牛,等3种蛏类线粒体16SRRNA和COI基因片段的序列比较及其系统学初步研究J海洋科学,2005,298273211陈丽梅,李琪,李赟4种海参16SRRNA和COI基因片段序列比较及系统学研究J中国水产科学,2008,15693594212陈子安,杜晓东,王庆恒,等3种星虫线粒体16SRRNA、COI和CYTB基因片段的序列比较J广东海洋大学学报,2007,27431013孔晓瑜,姜艳艳,相建海,等魁蚶线粒体16SRRNA和COI基因片段序列测定及其应用前景J海洋
38、科学,2001,2512464814郑文娟,朱世华,沈锡权,等泥蚶线粒体16SRRNA和COI基因片段序列研究J宁波大学学报（理工版）,2008,211394215李莉好,喻达辉,黄佳菊,等三种海豚线粒体COI基因的序列分析J动物学杂志,2007,423202716BUCKLINA,GUARNIERIM,HILLRS,ETALTAXONOMICANDSYSTEMATICASSESSMENTOFPLANKTONICCOPEPODAUSINGMITOCHONDRIALC0ISEQUENCEVATIATIONANDCOMPETITIVE,SPECIESSPECIFICPCRJHYDROBIOLOGI
39、A,199940123925417潘宝平,吴琪,张素萍,等文蛤属16SRRNA基因及ITS1序列的系统学分析J海洋与湖沼,2006,37434234718徐琰,宋林生,李新正用16SRDNA序列初步探讨部分真虾类的系统发育关系J海洋科学,2005,299364119麦维军,谢珍玉,张吕平,等中国明对虾与5种虾类线粒体16SRRNA和COI基因片段的序列比较及其系统学初步研究J海南大学学报自然科学版,2009,271152320LUOJIACONG,XIAOYONGSHUANG,SONGLIN,ETALPHYLOGENETICSEPARATIONOFLANCELETSINCHINAREVEALEDBYMITOCHONDRIALC0IANDCYTBGENEANALYSISJSOUTHCHINAFISHERIESSCIENCE,2007,328141221郭奕慧,喻达辉,黄佳菊,等中国主要养殖罗非鱼亲缘关系的COI序列分析J华中农业大学学报,2009,281757922魏崇德，浙江动物志甲壳类M浙江科学技术出版社，浙江动物志编辑委员会，1991,250440
