1、本科毕业设计（20_届）组胺产生菌的筛选及鉴定所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言311研究历史与现状312研究意义413主要研究内容42材料与方法421实验材料4211菌种来源4212试剂4213仪器5214培养基522实验方法6221组胺产生菌的筛选方法6222组胺产生菌的鉴定方法83结果与讨论931组胺产生菌筛选结果与分析9311五株菌的颜色变化结果与分析9312五株菌的斑点实验结果与分析10313组胺生成确认实验结果与分析1032组胺产生菌的鉴定结果与分析12321五株菌的革兰氏染色结果与分析12322五株菌的生理生化鉴定结果与分析13323五株菌的分
2、子鉴定结果与分析13324同源性分析144结论14致谢错误未定义书签。参考文献15附录错误未定义书签。摘要组胺是一种具有生物活性的低分子含氮有机物，可引起人的过敏性反应，甚至危险生命。本实验通过二步筛选法与常规筛选法对鲭鱼体内的组胺产生菌进行筛选，并通过生理生化实验初步鉴定菌株，最后通过PCR扩增对筛选出的5株菌进行16SRRNA测序及MEGA41分析软件分析5株菌株的同源性并建立系统同源树。结果显示筛选出的5株菌分别为恶臭假单胞菌PSEUDOMONASPUTIDA，弗氏柠檬酸杆菌CITROBACTERFREUNDII，芽孢杆菌BACILLUSSP，巨型球菌MACROCOCCUSCASEOLY
3、TICUS，松鼠葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSSCIURI。关键词鲭鱼；组胺产生菌；16SRRNA；进化树ABSTRACTHISTAMINEISONEOFTHELOWMOLECULARWEIGHT,NITROGENOUSMOLECULARANDPOSSESSEDOFBIOLOGICALLYACTIVEHISTAMINEWILLLEADTOALLERGICREACTION,EVENENDANGEROURLIVESTHISSTUDYUSESTWOSTEPSSCREENINGMETHODANDREGULARSCREENINGMETHODTOSCREENTHEHISTAMINEFORMINGBA
4、CTERIAFROMMACKERELBYMEANSOFPHYSIOLOGYBIOCHEMISTRYEXPERIMENTTOPRELIMINARILYIDENTIFYTHESTRAINS,ATLAST,USINGPCRIDENTIFIESBACTERIA16SRRNAANDUSINGMEGA41SOFTWARETOANALYZETHE5STRAINSHOMOLOGY,THENSETUPANEVOLUTIONARYTREETHERESULTSSHOWTHATTHE5STRAINSAREPSEUDOMONASPUTIDA,CITROBACTERFREUNDII,BACILLUSSP,MACROCOC
5、CUSCASEOLYTICUS,ANDSTAPHYLOCOCCUSSCIURI,RESPECTIVELYKEYWORDSMACKERELHISTAMINEFORMINGBACTERIA16SRRNAEVOLUTIONARYTREE1引言11研究历史与现状组胺（HISTAMINE）是一种具有生物活性的低分子含氮有机物，是由组胺酸脱羧而形成的，通常贮存于组织的肥大细胞中。它是由微生物作用于其前体组胺酸而产生的,普遍认为食物中存在着组胺1。组胺的产生需要满足3个条件1）存在生成组胺的前体物质游离组氨酸；2）存在发生组氨酸脱羧的条件；3）存在适宜微生物生长的环境。与产生组胺有关的细菌普遍存在于盐水环境
6、中，通常存活在鱼体的鳃和内脏中，其主要为一些如杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、埃希氏菌属、变形菌属、假单胞菌属、沙丁氏菌属、链球菌属等微生物2，因此鱼肉因组胺含量超标而引起的组胺中毒事件时有发生36。在体内，组胺是一种重要的化学递质，当机体受到某种刺激引发抗原抗体反应时，引起肥大细胞的细胞膜通透性改变，释放出组胺，与组胺受体作用产生病理生理效应。如组胺对血管通透性的影响7，中枢组胺具有改善学习记忆的作用8，组胺的促生长作用9，组胺降低缺氧性肺动脉高压10，组胺引起变态反应11等。陶志华等人12利用组氨酸肉汤培养液，对海水中的组胺生成菌进行筛选，然后通过生物化学实验和形态学实验，进而对组胺生成菌进
7、行分析。结果分离得到2株细菌，依据两种组胺菌的特征和生理生化特征，分离菌可能分别属于奈瑟氏菌属、黄杆菌属。CHENHC等人13利用组氨酸胰蛋白酶大豆培养液，对引起食物中毒的金枪鱼团子中的组胺生成菌进行筛选，并对13株菌株的16RDNA进行PCR扩增，鉴定结果为三株肠杆菌，两株成团泛菌，四株变栖克雷伯氏菌，四株粘质沙雷氏菌。李华等人14利用PCR技术及HPLC检测方法对22株中国优良酒酒球菌的生物胺代谢安全性进行研究。结果表明，PCR检测结果与HPLC测定结果一致，从我国葡萄产区筛选的优良酒球菌均不产生组胺。何健15报导摄入840MG组胺产生轻微中毒症状，超过40MG产生中等中毒症状，超过100
8、MG产生严重中毒症状。马玲16对干酪中的生物胺进行了研究，并指出干酪中大量组胺的形成很可能归因于有脱羧酶活性的微生物，除脱羧酶的活性外，组胺的底物游离组胺酸的浓度也很重要，达到中毒剂量的胺的形成往往仅发现于蛋白降解过度的干酪。陆永梅等人17建立了测定酿造酒黄酒中生物胺含量的高效液相色谱法，首次采用该法测定了黄酒中的生物胺，测得尸胺、组胺和亚精胺为005UG/ML。谢诚等人18研究了混合菌种发酵对草鱼肉微生物和生物胺变化的影响，研究表明混合菌种发酵鲢鱼和鲭鱼中的生物胺都得到了很好的控制，尤其是组胺的含量。孔维府等人19报导TLC法现已有效地应用于临床和生化检验、毒物分析、药材及其制剂真伪的鉴定、
9、质量控制和资源调查等方面。与其他分析方法相比，TLC法无需昂贵的分析仪器，费用低，操作简便、快捷。但该法测组胺含量不够精确。TSAIYH等人20采用高效液相色谱法对引起一起食物中毒事件的罐装鲭鱼的组胺含量进行了检测。此方法在测组胺时经常采用，但分析时间稍长。此法优点是分离度高，能将各种成分有效分离，具有良好的峰型，因此该方法对食品中生物胺的检测具有一定的应用意义。国外对食品中组胺的来源、代谢、检测方法、监测和毒性等做了大量研究工作，而我国则起步相对较晚，并且主要是对检测方法的研究，但尚有许多亟待解决的问题，比如我国常见食物发酵食品、动物性食品等中组胺污染水平的研究，食品保藏、加工、烹饪条件对食
10、物中组胺含量的影响研究等，以及组胺形成机理的研究都较少21。12研究意义组胺是海洋鲭科鱼类中含量最多和最主要的生物胺，因此组胺含量常被作为检测这类水产品腐烂变质程度的指标。并且组胺属于单胺类神经递质，参与多种生理病理活动过程，如对睡眠、摄食、体温、精神情感性疾病的调节。组胺原本就具有药理和毒理学作用，因此通过对组胺的研究可以更好的驾驭这种化学活性物质，避其不利，发挥益处，为人所用。宁波地区水产品丰富，出口的产品中很大一部分为中上层鱼类，这些产品因为组胺含量超标而被禁止出口的现象每年都有发生，通过更好的研究组胺，组胺产生菌，组胺形成机理及测定组胺的方法，可以选择更好的方法储藏和加工鱼类，从而有效
11、降低鱼类中组胺含量，增加出口贸易。13主要研究内容本实验通过二步筛选法与常规筛选法对鲭鱼体内的组胺产生菌进行筛选，并对筛出的菌进行鉴定，确定菌株的种属。菌种的鉴定主要通过生理生化实验，分子生物学法（16SRRNA测序）来确定，并建立系统同源树。2材料与方法21实验材料211菌种来源组胺产生菌株来源于鲭鱼鱼体中。鲭鱼购于学校附近的菜市场，购置后的鲭鱼放在无菌保鲜袋中，立即送回实验室进行样品处理。212试剂胰蛋白胨（杭州微生物试剂有限公司）酵母浸粉（中国医药上海化学试剂公司）葡萄糖（广东光华化学有限公司）琼脂（北京陆桥技术有限责任公司）蛋白胨（杭州微生物试剂有限公司）酵母（中国医药上海化学试剂公司
12、）L组氨酸（上海晶纯试剂有限公司）大豆胨北京陆桥技术有限责任公司牛肉膏北京陆桥技术有限责任公司正丁醇无锡市传妮化工有限公司引物16SF/16SR（上海英骏生物技术有限公司合成）氯化镁，硫酸钾，氯化钠，蔗糖，磷酸钾，碳酸钠，氯化钾均为分析纯。PMD19TSIMPLE，DNALIGASIONKITVER20TAKARA公司DNTPS、RTAQDNA聚合酶、T4DNALIGASE（含10缓冲液）TAKARA公司引物的序列16SF5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3上海英骏生物技术有限公司合成引物16SR的序列5CCGTCAATTCCTTTRAGTTT3上海英骏生物技术有限公司合成213仪器高
13、速分散仪PH计，上海精科离心机ANKETDL802B双目生物显微镜XSP2C无菌操作台ZHJH1112氮吹仪DC12H，浙江三和科教仪器有限公司稳压稳流电泳仪DYY型,上海医用分析仪器厂生化培养箱SHP250,上海精宏实验设备有限公司数显恒温水浴锅HH6，山东省鄄城新华电热仪器厂立式压力蒸汽灭菌器LDZX50KBS，上海申安医疗器械厂漩涡振荡仪GL88B，海门市其林贝尔仪器制造有限公司分光光度计CARY100紫外可见分光光度计，美国瓦里安公司密封式恒温可调电加热器FD2，嘉兴市欣欣仪器设备有限公司QIAQUICKGELEXTRACTION试剂盒，北京构尔德科技发展有限公司214培养基2141V
14、RBG琼脂培养基，购于杭州微生物试剂有限公司2142TCBS琼脂培养基，购于杭州微生物试剂有限公司2143PI琼脂培养基蛋白胨200G氯化镁14G硫酸钾100G三氯生0025G琼脂136G蒸馏水1000MLPH值69712144组胺选择性培养基胰蛋白50G酵母50GL组氨酸20GNACL5G琼脂15G甲酚红0520ML蒸馏水1000MLPH652145胰蛋白胨大豆胨琼脂（TSA）胰蛋白胨15G大豆胨5G氯化钠5G琼脂13G蒸馏水1000MLPH71752146糖发酵培养基蛋白胨培养基1000ML16溴甲酚紫乙醇溶液12MLPH76另配20糖溶液（葡萄糖）10ML2147淀粉培养基蛋白胨10GN
15、ACL5G牛肉膏5G可溶性淀粉2G蒸馏水1000ML琼脂1520GPH722148葡萄糖蛋白胨水培养液蛋白胨5G葡萄糖5GK2HPO42G蒸馏水1000MLPH7222实验方法221组胺产生菌的筛选方法2211二步筛选法筛选A倒平板将VRBG琼脂培养基、PI琼脂培养基、TCBS琼脂培养基以及组氨菌选择培养基加热溶解，冷却至5560时，分别到平板。B制备10倍系列稀释样品匀液称取10G样品（36下放着16小时）放入盛有90ML稀释液的内置有玻璃珠的锥形瓶中，振荡摇匀10MIN，制成110的样品匀液。用1ML无菌吸管或移液枪吸取110样品匀液1ML，沿管壁缓慢注于盛有9ML稀释液的无菌试管中，振摇
16、试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1100的样品匀液。用同样的方法制成103，104，105，106，107的样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ML无菌吸管或吸头。C涂布平板根据对样品组胺产生状况的估计，选择23个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，吸取适量的匀液涂布到各平板中。每个稀释度做两个样，同时，分别吸取适量的空白稀释液涂布到各平板中作为空白组。D培养各平板置于351的恒温箱中培养24H。E初筛观察菌落特性，并记录，同时依据其特性，随机选择一些菌落，挑取接种到新的培养基平板中，置于351的恒温箱中培养24H，进行进一步的分离纯化（多次划平板），使菌落成为单菌落
17、。将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到TSA斜面，置于4条件下保存，培养24H。F二次筛选将TSA斜面上的菌种接种到组胺菌选择培养基中，在35下培养24H。观测菌落特性，是否出现带有紫色光晕的紫色菌落出现，有则为阳性。222212颜色变化实验筛选A取干净的试管，加入5ML的组胺选择性液体培养基，灭菌冷却后接菌，每株菌做两个平行，另外取空白稀释液做空白对照。B在35下培养24H36H后，再加12滴05的甲酚红溶液，振荡后看颜色变化。2213斑点实验筛选A将各菌种接种到5ML组胺选择性液体培养基中，培养12H，待用。B将无菌滤纸片放到倒有组胺选择性培养基的平皿中央，后用无菌枪头吸取510U
18、ML的培养液，滴到滤纸片上，后在351下培养，观察实验结果，确定斑点的大小。2214组胺生成确认实验A标准曲线的制作以组胺标准品溶液进行线性实验，各系列浓度为0、5、10、20、30、50UG/ML。取1ML各系列浓度的标准品溶液加到10ML的离心管中，依次加入4ML11碳酸钠溶液以及3ML反应试剂，混匀，5MIN后在496NM下测定各管的吸光值，并用蒸馏水做空白对照，每个浓度测定三次，以平均值计算。B待测样品的制备挑取分离出的单菌落接种到组胺选择性培养液中，于30下培养72H后，取1ML培养液于50ML的离心管中，加085的生理盐水定容至25ML，漩涡振荡混匀。取稀释液1ML于干净的10ML
19、离心管中，加入1ML的生理盐水，再加05G的混合盐，剧烈振荡几次，加入1ML的正丁醇漩涡振荡1MIN，在3100G下离心10MIN，吸取上层有机相，重复萃取两次，合并有机相，取1ML萃取液于40水浴下氮气吹干，残余物用1ML蒸馏水溶解，待用。C组胺含量的测定1ML溶解液中，依次加入5ML11碳酸钠溶液以及2ML反应试剂，混匀，5MIN后在496NM下测定各管的吸光值，并用蒸馏水做空白对照，每个样重复测定3次，取平均值。222组胺产生菌的鉴定方法2221革兰氏染色实验A涂片固定。B草酸铵结晶紫染1分钟。C自来水冲洗。D加碘液覆盖涂面染约1分钟。E水洗，用吸水纸吸去水分。F加95酒精数滴，并轻轻摇
20、动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。G蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。2222生理生化试验方法各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的最终产物不同，反应出它们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被作为细菌鉴定和分类的重要内容23。A糖发酵试验糖发酵试验是常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为能源及碳源，但是细菌的分解糖类的能力上有相当大的差异，某些菌能使某些单糖或双糖分解，并产酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（甲烷、氢、二氧化碳），或者只产酸而不产生气体。酸和气体的产生与否，可以由培养
21、后试管指示剂的颜色变化和小套管内气泡的有无来判定。当发酵产酸时，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色。方法1）将上述含指示剂的蛋白胨水培养基分装于试管中，在每管内放一支倒置的小玻璃管（DURHAMTUBE）。2）将已分装好的蛋白胨水培养基和20的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水121灭菌20MIN，糖溶液112灭菌30MIN。3）灭菌后，每管以无菌操作加入20的无菌糖溶液05ML。B淀粉水解试验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。方法以1824H的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板或直接移种于淀粉肉汤中，于361培养2448H，或于20培养5天。然后将
22、碘试剂直接滴浸于培养物表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。CVP试验某些菌生长于葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，而丙酮酸又可缩合、脱羧而转化成乙酰甲基甲醇，如加入强碱液，即与空气中的氧起作用产生二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的含胍基成分作用生成红色化合物，称阳性反应，没有红色化合物产生则称阴性反应。方法将试验菌接种于通用培养基，于361C培养4天、培养液25ML先加入5萘酚，纯酒精溶液06ML，再加40氢氧化钾水溶液02ML，摇动25M
23、IN，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或361恒温箱，如2H内仍不显现红色、可判定为阴性。D甲基红试验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至PH45以下，使甲基红指示剂变红。方法挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于361或30（以30较好）35天，从第二天起，每日取培养液1ML，加甲基红指示剂12滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。E过氧化氢酶试验具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成
24、水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。方法用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落，置于洁净的试管内，滴加3过氧化氢溶液2ML，观察结果。在半分钟内发现气泡者为阳性，不发现气泡者为阴性。2223分子生物学法聚合酶链式反应POLYMERASECHAINREACTION，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR扩增由变性退火延伸三个基本反应步骤构成模板DNA的变性，双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA；模板DNA与引物的退火复性，系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链；引物的延伸，在TAQ酶（在72左右，活性最佳）的作用
25、下，以DNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链2425。以筛选出的菌悬液为模板，用引物16SF5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，引物16SR5CCGTCAATTCCTTTRAGTTT3进行PCR扩增，PCR扩增反应为25L体系，反应体系如表1。反应经94预变性4MIN后，循环扩增34次94变性45S，55复性40S，72反应1MIN，循环结束后72延伸反应10MIN；扩增产物经1M/V琼脂糖凝胶电泳分离后，预期大小的扩增条带用QIAQUICKGELEXTRACTION纯化，连接入PMD19TSIMPLE质粒载体，转化大肠杆菌TG1，菌液送上海华大基因公司测序。
26、表1PCR反应体系TABLE1PCRREACTIONSYSTEM试剂剂量（UL）无菌蒸馏水1775BUFFER2516SF2016SR20RTAQ酶025菌悬液053结果与讨论31组胺产生菌筛选结果与分析通过二步筛选法，颜色变化实验，斑点实验，组胺生成确认实验从鲭鱼肉中初步筛选到5株组胺产生菌，这5株菌的序号分别为HIS1，HIS8，HIS13，HIS17，HIS20（HIS1，HIS8，HIS13，HIS17，HIS20为菌株筛选时的序号）。311五株菌的颜色变化结果与分析通过试管中颜色变化的明暗程度，初步推断出菌株的产组胺能力，实验结果表明，接种各菌株的液体培养基在加入甲酚红溶液后均有明显
27、的颜色变化。这五株菌均具有产组胺能力。表2五株菌的颜色变化结果TABLE2THERESULTSOFTHE5STRAINSCOLORTRANSFORMATION序号结果HIS1HIS8HIS13HIS17HIS20注表示接种各菌株的液体培养基在加入甲酚红溶液后均有明显的颜色变化。312五株菌的斑点实验结果与分析通过斑点实验观察平皿中斑点的大小可知，培养24H与30H之后平皿中出现了可观测到的斑点，且不同菌株的平皿中的斑点大小不同，通过斑点的大小可以进一步确定该菌株的产组胺能力。每组菌做三次平行实验，计算平均值，见表3。从表3中看出五株菌均具有产组胺能力，其中HIS8的产组胺能力最强，HIS13的
28、产组胺能力最弱。其它三株菌产组胺能力相差不大。表3五株菌的斑点实验结果TABLE3THERESULTSOFTHE5STRAINSSPOTEXPERIMENT序号培养24H出现紫色晕斑的大小（CM）培养30H出现紫色晕斑的大小CMHIS124253050HIS832004400HIS1321502675HIS1725753175HIS2025003100313组胺生成确认实验结果与分析以组胺标准品溶液进行线性实验，各系列浓度所得吸光值如表4。表4组胺标准品溶液吸光值TABLE4THEABSORBANCEOFTHEHISTAMINESTANDARDSUBSTANCE浓度（UG/ML）ABS平均值1
29、23000005014930149101496014931003036000303203033200572305729057200572430081400813708144081405013595135901359113592以浓度为横坐标，相应吸光值为纵坐标制作标准曲线如图1。Y00269X00172R20999200204060811214160102030405060组胺浓度（UG/ML）ABS图1组胺标准品标准曲线FIG1STANDARDCURVEOFTHEHISTAMINESTANDARDSUBSTANCE培养72H的菌液测得的吸光值如表5表5五株菌培养72H后的吸光值TABLE5T
30、HEABSORBANCEOFTHE5STRAINSAFTERCULTIVATINGFOR72HOURS序号ABSHIS101304HIS804600HIS1300873HIS1701404HIS2001339通过标准曲线方程Y00269X00172和五株菌培养液的吸光值分别计算出五株菌培养液中的组胺含量为HIS1421UG/ML，HIS81646UG/ML，HIS13261UG/ML，HIS17458UG/ML，HIS20434UG/ML。由于实验操作过程中稀释了50倍，所以各株菌培养物组胺实际含量为HIS12105UG/ML，HIS8823UG/ML，HIS131305UG/ML，HIS17
31、229UG/ML，HIS20217UG/ML，如图2通过组胺生成确认实验表明，这五株菌均具有产组胺能力，其中HIS8的产组胺能力最强，HIS13的产组胺能力最弱，HIS1，HIS17，HIS20的产组胺能力很接近。组胺生成确认实验结果与斑点实验结果接近。210582313052292170100200300400500600700800900H1H8H13H17H20菌株号组胺浓度（UG/ML）图25株菌株的产组胺能力的比较FIG2COMPARISONOFTHE5STRAINSHISTAMINEPRODUCINGABILITY32组胺产生菌的鉴定结果与分析321五株菌的革兰氏染色结果与分析通过
32、对筛选出的五株菌进行革兰氏染色，结果如图1所示，HIS1,HIS8,HIS13三株菌为革兰氏阴性菌，HIS17，HIS20为革兰氏阳性。HIS1HIS8HIS13HIS17HIS20图3五株菌的革兰氏染色结果FIG3THERESULTSOFTHE5STRAINSGRAMSTAIN322五株菌的生理生化鉴定结果与分析表6五株菌的生理生化实验结果TABLE6THERESULTSOFTHE5STRAINSPHYSIOLOGYBIOCHEMISTRYEXPERIMENT序号HIS1HIS8HIS13HIS17HIS20糖发酵淀粉水解VP甲基红过氧化氢酶（深）323五株菌的分子鉴定结果与分析PCR产物经
33、1M/V琼脂糖凝胶电泳分离，经凝胶成像系统拍照，结果显示如图4，从图上可知，除HIS7以外的几株菌的PCR条带亮度均很高，片段长度大致在900BP左右。图4五株菌的PCR电泳图FIG4THE5STRAINSPCRELECTROPHOTOGRAM采用CHROMAS软件校对并输出5株菌PCR产物序列。以上游引物所测PCR产物序列为正链，根据与下游引物所测序列逆向互补链的重叠部分，以CHROMAS软件拼接出产物DNA片段序列。图5部分CHROMAS软件分析图FIG5PARTOFTHECHARTOFCHROMASSOFTWAREANALYSIS通过国际互联网，通过NCBI数据库检索比对，确定5株菌分别
34、为HIS1（PSEUDOMONASPUTIDA）、HIS8（CITROBACTERFREUNDII）、HIS13（BACILLUSSP）、HIS17MACROCOCCUSCASEOLYTICUS、HIS20（STAPHYLOCOCCUSSCIURI）。表7五株菌的分子鉴定结果TABLE7THERESULTSOFTHE5STRAINSNUCLEICACIDIDENTIFICATION序号种（属）名中文名相似度HIS1PSEUDOMONASPUTIDA恶臭假单胞菌99HIS8CITROBACTERFREUNDII弗氏柠檬酸杆菌99HIS13BACILLUSSP芽孢杆菌99HIS17MACROCOC
35、CUSCASEOLYTICUS巨型球菌99HIS20STAPHYLOCOCCUSSCIURI松鼠葡萄球菌99324同源性分析在NCBI数据库中检索到同源性与非同源性的9株菌株并得到其16SRRNA的部分序列，利用MEGA41分析软件，与得到的5株菌的16SRRNA的部分序列进行同源性比对，建立系统同源树2627，如图4。图6系统同源树FIG6EVOLUTIONARYTREE4结论通过本实验的研究，通过二步筛选法和常规筛选法从鲭鱼中筛选出5株能产组胺的菌株，5株菌均具有较强的产组胺能力。其中菌株HIS8的产组胺能力最强，经过生理生化鉴定，PCR对16SRRNA的测序，以及同源性比较，HIS8鉴定
36、为弗氏柠檬酸杆菌（CITROBACTERFREUNDII），HIS13的组胺生成能力最弱，经鉴定它为芽孢杆菌BACILLUSSP，其余三株分别为恶臭假单胞菌PSEUDOMONASPUTIDA，巨型球菌MACROCOCCUSCASEOLYTICUS，松鼠葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSSCIURI。参考文献1金安宝水产品中组胺测定方法的改进J中国卫生检验杂质,2007,1711491502谢超,王阳光,邓尚贵水产品中组胺产生机制及影响因素研究概述J肉类研究,2009,474783范青霞,孔亚明,马洪喜,等一起因食用鲭鱼引起的组胺过敏慢性食物中毒J医学动物防治,2006,2242952964冯
37、银凤,周日东,卢丽明,等一起由组胺引起的食物中毒的调查分析J中国卫生检验杂志,2003,1345245庄厚雄一宗食用变质池鱼引起组胺中毒报告J广东卫生防疫,211866王以利一起食用蛤鱼引起组胺中毒的报告J江苏卫生保健,2160617秦迎松,庞训雷,于红丽,等组胺对荷黑色素瘤C57BL/6小鼠微血管壁通透性的影响J徐州医学院学报,2007,2752812848黄育文,余健,陈忠,等中枢组胺对学习记忆的作用J医学与工程,2002,4144469冷向军,王康宁,杨凤,等添加组胺对早期断奶仔猪胃酸分泌、消化酶活性和肠道微生物的影响J中国农业科学,2003,36332432810陆德琴,李会革,叶红,
38、等组胺对肺动脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表达的影响J生理学报,2004,56328829411沈滨,王建军中枢组胺能系统研究的新进展J中国神经科学杂志,2002,18141742112陶志华,佐藤实海水中组胺菌的分离及其理化性质分析J生物技术,2009,191424413SHALABYARSEMIQUANTITATIVEMETHODFORDETERMININGBIOGENICAMINESINFOODSJFOODCHEMISTRY,1995,5231236114李华,李志军,梁新红,等22株中国优良酒酒球菌代谢生物胺的检测J微生物学杂志,2008,284232615何健,李艳霞发酵肉制品中生物胺研
39、究进展J肉类工业,2009,3342475016马玲,刘会平干酪中的生物胺J乳业科学与技术,2007,1232555817陆永梅,董明盛,吕欣,等高效液相色谱法测定黄酒中生物胺的含量J2006,27119619918谢诚,刘忠义,周宇峰,等混合菌种发酵对草鱼肉微生物和生物胺变化的影响J西北农林科技大学学报,2010,38316717219孔维府,范春艳,张翛翰,等论葡萄酒中生物胺生成的影响因素及其检测方法J中国酿造,2010,2196131620TSAIYH,KUNGHF,LEETM,ETALDETERMINATIONOFHISTAMINEINCANNEDMACKERELIMPLICATEDI
40、NAFOODBORNEPOISONINGJFOODCONTROL,2005,1657958521何庆华,吴永宁,印遇龙,等食品中生物胺研究进展J中国食品卫生杂志,2007,19545145422RODTONGS,NAWONGS,YONGSAWATDIGULJHISTAMINEACCUMULATIONANDHISTAMINEFORMINGBACTERIAININDIANANCHOVYJFOODMICROBIOLOGY,20052247548223沈萍,陈向东微生物学实验M第4版北京高教出版社,2008,11214024ZHIHUAT,MINORUS,NAOKIA,ETALSIMPLEANDRAPIDDETECTIONOFHISTAMINEFORMINGBACTERIABYDIFFERENTIALAGARMEDIUMJFOODCONTROL,20092090390625王镜岩,朱圣庚,徐长法生物化学M第3版北京高教出版社,2003,58060026王慧杰,杨向科,马爱民RRNA同源性分析方法在微生物分类中的应用J河南农业科学,20075141727葛永斌详析进化树J生物学教学,2000,2513435
