1、本科毕业设计（20_届）一株海水光合细菌的分离鉴定及在轮虫增养殖中的应用所在学院专业班级海洋生物资源与环境学生姓名学号指导教师职称完成日期年月2目录1引言12材料与方法121材料1211样品来源1212培养基与试剂2213仪器设备322方法3221培养物颜色和菌体形态观察3222活细胞吸收光谱的测定322316SRRNA基因序列分析3224生理特性研究5225海水光合细菌对褶皱臂尾轮虫增养殖的研究63结果与分析731菌体及菌落形态特征732活细胞吸收光谱733菌株CP3的分子鉴定934菌株CP3的生理生化特性9341碳源利用9342氮源利用9343初始PH值对所分离菌株生长的影响10344盐度
2、对菌株生长的影响11345光照与氧气对菌株生长的影响11346生长因子利用11347无机电子供体12348生长曲线的测定1235菌株CP3在褶皱臂尾轮虫增养殖的应用13351轮虫形态特征13352菌株CP3投放实验134讨论1441菌株的单菌落分离1442菌株的生理生化特性1443关于影响菌株的条件1544关于菌种鉴定1545关于海水光合细菌在轮虫增养殖中的应用15致谢16参考文献16摘要我们从浙江宁海东坝养殖场海水养殖塘的泥样中分离到一株海水光合细菌，实验室编号为菌株CP3，我们对菌株CP3做了生物学特性的研究，分析了它的分离纯化、细胞形态、培养特征、活细胞吸收光谱、生理生化特性和16SRR
3、NA基因测序及系统学分析等一系列生物学特性，同时研究了其作用于轮虫培养时对轮虫增养殖的影响。研究结果表明CP3为革兰氏阴性菌，它具有较广的适盐性和耐酸碱特性，厌氧比好氧条件下更适合其生长，菌株CP3的细胞为卵圆形，大小为1015M2229M,厌氧下液体培养物呈红色，最适生长PH60，最适盐度2，CP3能利用S、NA2S、NA2S2O3作为硫电子供体。16SRRNA基因序列测定结果表明菌株CP3与ECTOTHIORHODOSPIRASHAPOSHNIKOVII的相似性水平达997，但是某些形态及生理特征与其不符，可能是新种。在轮虫培养液中，用一定量光合细菌离心后的菌体作为添加剂，发现菌株CP3能
4、在24天内增加轮虫增殖率。因此，在轮虫培养的特定时期加入光合细菌，有助于轮虫的高密度增养殖的实现。关键词光合细菌；革兰氏阴性菌；16SRRNA；轮虫；增养殖ABSTRACTWEISOLATEDONESTRAINOFMARINEPHOTOSYNTHESISBACTERIUMFROMSEDIMENTOFPONDSINDONGBAFARMINNINGHAI,ZHEJIANGPROVINCEWECALLITSTRAINCP3THEARTICLESTUDIEDITSPURIFICATION,MORPHOLOGICAL,CULTURALCHARACTERISTICS,ABSORPTIONSPECTRA,P
5、HYSIOLOGICALANDBIOCHEMICALCHARACTERISTICS,16SRRNAGENESEQUENCEANDITSAPPLICATIONINPROLIFERATIONOFROTIFERTHERESULTSHOWSSTRAINCP3ISGRAMNEGATIVEBACTERIUM,ANDPOSSESSESCOMPARATIVELYEXTENSIVESALTANDPHADAPTABILITYGROWTHOCCURSBETTERANAEROBICALLYTHANAEROBICALLYSTRAINCP3ISOVOIDINSHAPE,10M15M22M29MINSIZEITSANAER
6、OBICCULTURESISREDITGROWSWITHPHOPTIMUMAT60ANDNACLCONCENTRATIONSOPTIMUMAT2STRAINCP3CANUTILIZES,NA2S,NA2S2O3ASSULFIDEELECTRONDONORS16SRRNAGENESEQUENCEANALYSISSUGGESTEDTHATSTRAINCP3HASTHESEQUENCEIDENTITYOF997WITHECTOTHIORHODOSPIRASHAPOSHNIKOVIIHOWEVER,SOMEMORPHOLOGICAL,PHYSIOLOGICALANDBIOCHEMICALCHARACT
7、ERISTICSOFCP3STRAINDONOTAGREEWITHIT,STRAINCP3MAYBEANEWSPECIESWEADDACERTAINMOUNTOFPHOTOSYNTHESISBACTERIAAFTERCENTRIFUGATIONTOTHECULTUREMEDIUMOFROTIFERANDFINDTHATSTRAINCP3CANINCREASEPROLIFERATIONRATEOFROTIFERIN24DAYSTHEREFORE,BYADDINGPHOTOSYNTHESISBACTERIUMDURINGASPECIFICPERIODOFROTIFERCULTURINGCANHEL
8、PTOACHIEVEHIGHDENSITYPROLIFERATIONOFROTIFERKEYWORDSPHOTOSYNTHETICBACTERIUMGRAMNEGATIVEBACTERIUM16SRRNAROTIFERPROLIFERATION1引言光合细菌简称PSB，是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物1。光合细菌属于水圈微生物的一种，光合细菌广泛分布于地球生物圈的各处，无论是海洋、湖泊、江河，还是水田、池塘、沼泽、污泥、氧化池、硫磺泉、土壤、极地，甚至在90的温泉中、在300的盐湖里、在深达2000M的深海、在南极冰封的海岸上，都能找到其踪迹。他们在全球水系统中的广泛分布突出了
9、他们在水生食物链和生物地球化学元素循环以及与环境间共同进化中的角色2。PSB均为革兰氏阴性细菌，一般为球型、卵形、杆形、弧形、螺旋形、环形、半环形丝形，也可随培养条件和生长阶段而改变，大部分单个存在3。光合细菌根据它们所含光合色素和电子供体的不同分为不产氧光合细菌（ANOXYPHOTOSYNTHETICBACTERIA）和产氧光合细菌（OXYPHOTOSYNTHETICBACTERIA），是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物4。产氧光合细菌即蓝细菌，能够像植物一样，利用光合作用产生氧气；不产氧光合细菌，即狭义光合细菌，包括厌氧光合细菌（ANAEROBICPHOTOSYNTHETIC
10、BACTERIA，APB）和最近提出的好氧不产氧光合细菌（AEROBICANOXYGENICPHOTOSYNTHETICBACTERIA，AAPB）。根据伯杰氏细菌鉴定手册第九版，不产氧光合细菌被分成七大类群2,5着色菌科（CHROMATIACEAE）、外硫红螺菌科（ECTOTHIORHODOSPIRACEAE）、紫色非硫细菌（PURPLENONSULFURBACTERIA，简称PNSB）、绿硫细菌（CHLOROBIACEAE）、多细胞丝状绿细菌（MULTICELLULARFILAMENTOUS，又称绿色非硫细菌）、螺旋杆菌（HALIOBACTERIACEAE）、好氧不产氧光合细菌（AEROB
11、ICANOXYGENICPHOTOTROPHS）。光合细菌菌体蛋白质含量在60以上，而且富含B族维生素、氨基酸和促生长因子，是优质的营养型饲料添加剂6,7；光合细菌可以直接用来处理高浓度有机废水，不产生污泥处理问题，所需费用较低8,9；光合细菌既是一种优质的生物肥料，又能增强植物的抗病能力10；同时在保健食品方面，光合细菌也有很多的应用11,12；PSB菌体无毒，营养非常丰富，是一类营养成分高且种类比较全的微生物，作为水产养殖生物的饲料添加剂，具有明显的增产效果13。轮虫在以一定浓度的小球藻为饵培养时，在恒温25的条件下，光合细菌添加浓度为250PPM时轮虫的日平均增殖率最高14。褶皱臂尾轮虫
12、是一种半咸水的滤食性浮游动物，多以细菌、浮游藻类及小型原生动物和有机碎屑为食。作为鱼、虾类幼体的开口饵料，其适口性、可得性、营养价值及饲养效果均优于其它饵料，而且适应力强，生长快，繁殖迅速，培养成本低，极易在生产实践中推广利用。褶皱臂尾轮虫的高密度培养是水产养殖鱼、虾育苗成功与否的关键。褶皱臂尾轮虫的大规模、高密度培养的环境条件要求与褶皱臂尾轮虫的生理需求相一致，否则培养的褶皱臂尾轮虫将会增殖不良、密度低、营养价值低、甚至逐渐死亡。本文对一株海水光合细菌的细胞形态、培养特征、活细胞吸收光谱、生理生化特性以及16SRRNA基因序列等进行分析。针对目前国内的研究情况以及生产上的需要，利用微生物制剂
13、在科学领域方面获得的巨大成效，从轮虫培养中的残饵、粪便等代谢产物出发，进行研究，充分利用本来想方设法要去除的有害物质，变废为宝，把海水光合细菌应用于褶皱臂尾轮虫的增养殖，希望为水产养殖业的发展提供有价值的材料及理论依据。2材料与方法21材料211样品来源菌种CP3来自宁波大学生命科学与生物工程学院“应用海洋生物技术”教育部重点实验室光合细菌资源（浙江宁海东坝养殖场海水养殖塘的泥样中得到）。实验用到的褶皱臂尾轮虫采于宁波象山高泥育苗场。样品的采集按照海洋调查规范15的要求进行。应用采泥器采集表层泥样，取泥样1G于螺口厌氧管中，加灭过菌的液体培养基至满，拧上螺口帽，混匀。带回实验室，放入32光照强
14、度30005000LUX的培养箱培养。光下培养约515天，待有红色、粉色、黄色或褐色生长物明显生长后，再连续转接多次以求培养液中光合细菌占优势，待进一步分离。212培养基与试剂AAT基础培养基（表1），稍作修改（参照IMHOFFJF1992）表1AT基础培养基配方TAB1ATBASALMEDIUMFORMULATION成分数量成分数量乙酸钠10GFESO47H2O18MG丁酸钠10G维生素溶液10ML氯化钠NACL10G微量元素溶液（SLA）10MLMGCL26H2O025G氯化铵NH4CL10G氯化钙CACL2005G（50MG）酵母膏02G磷酸缓冲液母液5ML加蒸馏水至1L注（1）维生素母
15、液成分（MG/100ML）生物素BIOTIN10，烟酸NIACIN35，盐酸硫胺素THIAMINEDICHLORIDE30，对氨基苯甲酸AMINOBENZOACID20，盐酸吡哆胺PYRIDOXOLIUMHYDROCHLORIDE10，泛酸钙CAPANTHOTHENATE10，VITAMINB125。（2）微量元素母液成分（MG/L）FECL24H2O1800，COCL26H2O250，NICL26H2O10，CUCL22H2O10，MNCL24H2O70，ZNCL2100，H3BO3500，NA2MOO42H2O30，NA2SEO35H2O10。（3）磷酸缓冲液成分（G/L）KH2PO468
16、,K2HPO4114。磷酸缓冲液需单独灭菌，用前加，以免高温灭菌时产生沉淀。（4）半固体加4G琼脂。（5）AT基础培养基加入253的氯化钠，用于培养海水样品。BDNA提取试剂（1）1TE溶液（PH80）；（2）50MG/ML溶菌酶；（3）20SDS溶液（十二烷基硫酸钠）；（4）酚/氯仿/异戊醇溶液（25241,V/V）；（5）氯仿/异戊醇溶液（241，V/V）；（6）70乙醇溶液；（7）3MOL/LNAAC溶液；（8）异丙醇。CPCR相关试剂超纯水；10PCRBUFFER；DNTP；TAQ酶（TAKARA）；模板DNA。D琼脂糖胶回收DNA试剂BINDINGBUFFER；WASHSOLUTIO
17、N；无菌水。213仪器设备A设备SPDJ系列水平净化工作台；HVE50型高压灭菌锅；RXZ300B人工气候箱；UV2102PC型紫外可见分光光度计（UNICO）；FR复日紫外/可见光分析生物凝胶成像系统；日本奥林巴斯BX60光学显微镜；CX31RTSF系统生物显微镜；EPPENDORFPCR扩增仪；DHG9123AS型干燥箱；VORTEX振荡器；微波炉；电泳槽；SL202N电子分析天平；梅特勒托利多（AL104）电子天平；DK8D型电热恒温水槽；B仪器厌氧管、普通玻璃试管、试剂瓶、15MLEP管、PCR管、移液枪、针管、锥形瓶、量筒、烧杯、玻棒、镊子、记号笔、酒精灯、废物缸等。22方法221培
18、养物颜色和菌体形态观察2211菌落形态（1）将CP3活化菌液以生理盐水逐级稀释成101、102、103、104、105、106、107、108八个梯度，分别取105、106、107、108的稀释液01ML注入20ML厌氧管的半固体AT培养基中培养（加有硫化钠），待有菌落产生。（2）肉眼观察菌落的颜色以及其他形态特征。2212菌体形态取CP3单菌落活化，待其到指数生长期时进行观察。（1）肉眼观察其液体培养物颜色。（2）用结晶紫简单染色，用日本奥林巴斯BX60光学显微镜观察菌体的形态、大小。222活细胞吸收光谱的测定采用AT基础培养基，对菌株CP3进行培养，取对数生长期的培养物进行活细胞吸收光谱的
19、测定，离心洗涤后，悬浮于质量分数60的蔗糖溶液中，用UV3100PC型紫外分光光度计在300900NM波长连续扫描16，记录其光吸收峰值17。22316SRRNA基因序列分析2231细菌DNA的提取115MLEP管收集菌体，离心8000RPM，5MIN2用一定体积的1TE溶液将菌细胞悬浮，混匀3在菌悬液中加入溶菌酶至终浓度2MG/ML，缓慢来回颠倒，充分混匀，37水浴40MIN，每隔35MIN上下来回缓慢混匀4然后加SDS溶液至终浓度2，上下颠倒，充分混匀，60水浴约2H，每隔一段时间观察液体粘稠度及细胞破壁情况5加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液25241，V/V，上下颠倒混匀，4，12000
20、RPM离心，10MIN6取上清液于新管，并重复上一步骤，直至水相澄清为止7取上清夜，加等体积的氯仿/异戊醇溶液241，V/V，充分摇匀，4离心12000RPM，10MIN8取上清液加1/20体积的NAAC溶液，再加2倍体积的异丙醇，上下颠倒，充分混匀94离心12000RPM，10MIN10倒掉上清液，倒扣于纸上吸干，加70乙醇，离心8MIN11倒掉上清液，待酒精完全风干，加入一定体积的纯水182232PCR反应应用细菌通用性引物（27F1541R）PCR扩增试验细菌的16SRRNA基因全序列1引物27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAGTM5781541RACGGCTACCTTGTTAC
21、GACTTM578250LPCR反应体系10BUFFER5L；引物15L；引物25L；DNTP5L；TAQ酶05L；模板DNA1L；纯水49L；3PCR反应循环参数94，预变性3MIN94，1MIN，60，1MIN，72，1MIN，1CYCLE94，1MIN，59，1MIN，72，1MIN，1CYCLE94，1MIN，58，1MIN，72，1MIN，1CYCLE94，1MIN，57，1MIN，72，1MIN，1CYCLE94，1MIN，56，1MIN，72，1MIN，1CYCLE94，1MIN，55，1MIN，72，1MIN，25CYCLES72，延伸3MIN。2233琼脂糖凝胶电泳取15LP
22、CR产物进行08的琼脂糖凝胶电泳，30MIN后观察结果，然后利用FR复日紫外/可见光分析生物凝胶成像系统进行拍照。2234琼脂糖凝胶中回收DNA片段1用灭过菌的手术刀割下含所要回收DNA的琼脂块，将放入15ML离心管中2加400LBINDINGBUFFER，混匀后放置于55水浴中约10分钟，使胶彻底融化3融化的胶溶液转移到UNIQ10柱，放入20MLCOLLECTIONTUBE，室温下放置2MIN，然后8000RPM室温下离心1MIN4弃去废液，加入500LWASHSOLUTION，10000RPM室温下离心30S5重复步骤（4）一次6弃去废液，10000RPM室温下离心30S，以除去残留的W
23、ASHSOLUTION7将柱子放入新的干净的15ML离心管中，加入30L无菌水，室温下放置2MIN810000RPM室温下离心1MIN，收集管中的液体即为回收的DNA片段。2235细菌16SRRNA基因序列的测定送上海生物工程技术公司进行序列测定，获得菌株16SRDNA序列。2236细菌16SRDNA序列的系统发育学分析将所得序列用BLAST程序在GENBANK数据库中进行相似性搜索，从中获取相近的典型菌株16SRDNA序列，用CLUSTALX程序进行序列对排，将相似性低的序列登录GENBANK数据库，随后采用NEIGHBORJOINING法19构建系统进化树。224生理特性研究2241碳源利
24、用实验在除去碳源（丁二酸钠、醋酸钠、酵母膏）的培养基中，分别添加各种碳源20,21，所加碳源量见表（表2）。灭菌后，以1ML菌液/25ML培养液的接种量接种，光照厌氧30下培养。每天观察菌液变化，待菌生长后测其OD值（660NM）。表2碳源实验需加碳的含量TAB2CONTENTOFTHECARBONSOURCE碳源100ML加量（G）碳源100ML加量（G）淀粉0106G丙酸钠0126G乙醇045ML乙酸钠0160G乳酸钠073ML苹果酸钠0192G半胱氨酸0250G谷氨酸钠0146G甘露醇0395G柠檬酸钠0192G酒石酸钠0209G甲酸钠0409G阳性对照0200G丁二酸钠0264G阴性对
25、照无葡萄糖0130G2242氮源利用实验在除去氮源（氯化铵、酵母膏）的培养基中，分别添加以终浓度为01（W/V）尿素、硝酸钠、亚硝酸钠、谷氨酸钠22，以及氮气（N2培养基11），灭菌，以1ML菌液/25ML培养液的接种量接种，光照厌氧30下培养。每天观察其菌液变化，待菌生长后测其OD值660NM。2243PH值实验采用AT液体培养基，培养基灭菌后，用1MOL/L盐酸和1MOL/L氢氧化钠将PH值调至55，60，67，79，90，以1ML菌液/25ML培养液的接种量接种，光照厌氧30下培养，分别在第三天和第七天测定其OD值660NM。2244盐度实验采用AT液体培养基，其他成分不变，NACL质量
26、浓度分别为0，1，2，3，5。培养基灭菌后，以1ML菌液/25ML培养液的接种量接种，光照厌氧30下培养，分别在第三天和第七天测定其OD值660NM。2245光照与氧气实验采用AT液体培养基，分别置于光照厌氧、黑暗厌氧、光照有氧、黑暗有氧条件下培养，分别在第三天和第七天测定其OD值660NM。厌氧培养基充满厌氧管，有氧厌氧管中留有一半空气。2246必需生长因子实验在除去维生素的培养基中分别如表3加入生长因子，灭菌后以1ML菌液/25ML培养液的接种量接种，光照厌氧30下培养。第五天测其OD值660NM。表3生长因子实验生长因子种类及含量TAB3TESTOFGROWTHFACTORTYPESAN
27、DCONTENTOFGROWTHFACTORS生物素MG/L对氨基苯甲酸MG/L维生素B12MG/L烟酸MG/L盐酸吡哆辛MG/L盐酸硫胺素MG/L泛酸钙MG/L1020050350103012010050350103013010203501030140102005010301501020050350301601020050350101701020050350103801020050350103012247无机电子供体实验硫化物无机电子供体利用的测定是在原先的培养基中加入终浓度分别为01（W/V）S、5MMOL/LNA2S2O3、05MMOL/LNA2SO3和1MMOL/LNA2S9H2O，观
28、察其利用状况。先将NA2S配成母液，过滤除菌，然后注射入灭过菌的厌氧管中。2248生长曲线的测定取活化后的菌液接种到液体培养基，每隔12H取样稀释4倍后用紫外可见分光光度计（UV3100PC型）在660NM处测定吸光值，并用血球计数板记录菌体个数，连续测定6天，依吸光度值作光合细菌的生长曲线。225海水光合细菌对褶皱臂尾轮虫增养殖的应用研究2251生长动力学研究用小球藻与面包酵母作为饵料培褶皱臂尾轮虫，进行实验室轮虫驯化。对褶皱臂尾轮虫进行预培养，初步握褶皱臂尾轮虫的基本生长规律，在光学显微镜下观察轮虫的形态结构。实验中用到的褶皱臂尾轮虫采于宁波象山高泥育苗场；小球藻来自于宁波大学藻种室，用灭
29、菌海水加小球藻3号营养液进行实验室培养；面包酵母取于高泥育苗场，用300目纱布过滤到盛有海水的烧杯中，取过滤得到的溶解液投喂轮虫。血球计数板计数小球藻浓度约为8106/ML。2252菌株CP3投放实验实验中添加的光合细菌CP3取于生长旺盛期（光照培养下第3天）的CP3培养液，OD值约为075，8000R/MIN条件下常温离心3分钟，弃去上清液，保留菌体。取12个500ML锥形瓶，分为6组，每组设两个平行，分别标记为0A、0B、1A、1B、2A、2B、3A、3B、4A、4B、6A、6B。取定量原轮虫培养液，加入新鲜海水稀释、混匀，用1ML移液管吸取1ML对轮虫进行计数，约12个/ML。装于12个
30、锥形瓶，每个锥形瓶分装300ML。各组分别加入0、1、2、3、4、6ML光合细菌培养液离心后的菌体。置于小室窗台，保持温度在25（空调）左右。每天早8点和晚8点投喂小球藻和面包酵母，每天在早晨8点投喂前对轮虫进行计数（计数前摇匀）。3结果与分析31菌体及菌落形态特征CP3菌体形态与菌落形态详见下表（表4）表4菌株形态及基本特征TAB4BASICCHARACTERISTICSOFCP3菌体形状菌体大小（M）革兰氏染色生长快慢菌液颜色菌落颜色菌落形状菌落大小（MM）CP3卵圆10152229快深红色红色绒球状0110菌体形态显微图见图1。图1CP3100光镜照片FIG1CP3100THELIGHT
31、MICROGRAPH32活细胞吸收光谱菌株CP3活细胞经紫外可见分光光度计连续扫描见图2，可以看出CP3在375382NM，585596NM、798806NM、830890NM都出现最大吸收峰，表明此菌株含有细菌叶绿素A；CP3在490NM，520534NM附近出现最大吸收峰，表明有正常螺菌红质系的类胡萝卜素存在。图2CP3的吸收光谱图FIG2ABSORPTIONSPECTRUMOFLIVECELLSUSPENSIONOFCP3THIOALKALIVIBRIOVERSUTUSTHIOALKALIVIBRIOJANNASCHIITHIOALKALIVIBRIONITRATISTHIOALKALI
32、VIBRIOTHIOCYANOXIDANSTHIOALKALIVIBRIOHALOPHILUSTHIOALKALIVIBRIOPARADOXUSTHIOALKALIVIBRIONITRATIREDUCENSTHIORHODOSPIRASIBIRICATHIOALKALIVIBRIODENITRIFICANSTHIOALKALIVIBRIOTHIOCYANODENITRIFICANSECTOTHIORHODOSPIRAMARISMORTUIECTOTHIORHODOSPIRAMOBILISECTOTHIORHODOSPIRAMARINAECTOTHIORHODOSPIRASHAPOSHNIKOV
33、IICP3ARHODOMONASAQUAEOLEINITROCOCCUSMOBILISALKALILIMNICOLAHALODURANSALKALISPIRILLUMMOBILEHALORHODOSPIRANEUTROPHILAHALORHODOSPIRAHALOCHLORISLAMPROCYSTISPURPUREAMETHYLOTHERMUSTHERMALISTHIOALKALISPIRAMICROAEROPHILARHEINHEIMERABALTICARHEINHEIMERAPACIFICA图3菌株CP3的系统进化树FIG3NEIGHBORJOININGTREEOFCP3002040608
34、11214163004005006007008009001000扫描波长/NM吸收光度值33菌株CP3的分子鉴定用NCBI的BLAST功能将菌株CP3的16SRRNA基因序列与GENBANK中已登录的基因序列做比对，然后通过RDP下载相关标准菌株序列，再利用EBI程序进行CP3与标准菌株的序列比对。测序结果表明，菌株CP3与外硫红螺菌外硫红螺旋菌属ECTOTHIORHODOSPIRA的ECTOTHIORHODOSPIRASHAPOSHNIKOVII的16SRRNA基因序列相似性达到997。通过进化树来判断某个种或属的细菌在漫长的进化过程中所处的地位，选取相似种属内所有种和科间属外的一些种来分析
35、CP3的进化地位。具体进化关系见上图（图3）。34菌株CP3的生理生化特征341碳源利用碳源等基质利用试验是光合细菌分类鉴定上的重要鉴别特征，可作为种属精确鉴定的重要依据23,24。碳源利用结果表5表明菌株CP3在乙酸钠、柠檬酸钠、丁二酸钠为碳源的培养基上可以生长，相对于正常培养基乙酸钠，在丁二酸钠下可以较好的生长，柠檬酸钠下生长缓慢，且生长得不好，在其余培养基上基本不能生长。表5菌株CP3对碳源的利用情况TAB5UTILIZATIONOFCARBONSOURCEOFSTRAINCP3甲酸钠淀粉半胱氨酸甘露醇丙酸钠乙酸钠谷氨酸钠丁二酸钠柠檬酸钠乳酸钠CP3342氮源利用不同氮源实验结果表明菌株
36、CP3只在N2、NH4CL培养基上生长，而NH4CL培养基上生长相对较好，在不加氮源的培养基上几乎不能生长，说明它的生长需氮源。表6菌株CP3对氮源的利用情况TAB6UTILIZATIONOFNITROGENSOURCEOFSTRAINCP3氮源CP3N2NA2NO3NANO3NH4CL尿素谷氨酸钠阴性注表示该培养基上细菌能够生长OD660010020，表示该培养基上细菌生长较好OD660020表示不能生长343初始PH值对所分离菌株生长的影响培养基的PH的改变会影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响微生物对营养物质的吸收利用，而且还会影响微生物代谢反应中各种酶的活性。微生物在其生命活动过
37、程中，也会分泌胞外产物，改变外界环境的PH，以适应自身的生长25。图4的结果显示，菌株CP3属于耐酸碱菌种，适宜生长的PH范围比较广，PH5580下均能生长，其最适PH为60。图4PH对菌株CP3生长的影响FIG4EFFECTOFPHONTHEGROWTHOFSTRAINCP3表7的结果表明，CP3在光照厌氧环境下培养一段时间5天后，培养液的PH值会升高。这可能由于光合细菌在生长代谢过程中释放出了碱性代谢物，也可能是由于光合细菌选择利用了酸性基团的营养成分，从而使碱性基团残留，PH升高26。表7菌株CP3PH的变化TAB7THECHANGEOFPHOFSTRAINCP3初始PH值最终PH值55
38、6067707690696876788990344盐度对菌株生长的影响由图5可知，菌株CP3在盐度5时，几乎不生长；在04的盐度下都能生长；在13生长的很好，2为最适生长盐度。因此，菌株CP3的生长对盐度的要求不高，可以在较大范围盐度内生长。图5盐度对菌株CP3生长的影响FIG5EFFECTOFNACLCONCENTRATIONONTHEGROWTHOFSTRAINCP3345光照与氧气对菌株生长的影响实验结果（表8）表明，CP3不能在黑暗的条件下生长，光照厌氧条件下CP3的生长比光照好氧条件下要好，说明此株菌均为兼性厌氧菌。表8光照与氧气对菌株CP3生长的影响TAB8EFFECTOFLIGH
39、TANDOXYGENONTHEGROWTHOFSTRAINCP3培养条件CP3光照有氧光照厌氧黑暗有氧黑暗厌氧注表示不生长，表示该培养基上细菌能够生长，表示该培养基上细菌生长较好346生长因子利用实验结果表明（表9），CP3在缺乏任何一种维生素的培养基中均能较好生长，菌株CP3在缺乏对氨基苯甲酸的情况下生长最好。在缺乏另外几种维生素的培养基中菌株的生长情况比添加全部维生素的培养基中的好，这可能是由于培养基中添加的各种维生素的量过多抑制了菌的生长，所以在培养基时维生素的加量可以适当减少。表9菌株CP3对生长因子的利用情况TAB9UTILIZATIONOFGROWTHFACTORSOFSTRAIN
40、CP3生长因子CP31生物素2对氨基苯甲酸3维生素B124烟酸5盐酸吡哆辛6盐酸硫胺素7泛酸钙8全注表示该培养基上细菌能够生长，表示该培养基上细菌生长较好，表示该培养基上细菌生长良好347无机电子供体光合作用过程中厌氧光合细菌通常使用硫化物或其他还原性硫化合物以及氢分子或有机小分子等作为电子供体27。通过菌株CP3对硫化物的利用（表10）可知，菌株CP3能利用S、NA2S2O3和NA2S9H2O，不能利用NA2SO3。表10无机电子供体对菌株CP3生长的影响TAB10EFFECTOFINORGANICELECTRONDONORSONTHEGROWTHOFSTRAINCP3无机电子供体CP3SN
41、A2S9H2ONA2SO3NA2S2O3注表示不生长，表示该培养基上细菌能够生长，表示该培养基上细菌生长良好348生长曲线的测定以细菌660NM波长下的OD值为横坐标，以菌体数量为纵坐标，做出菌株CP3菌体数与OD值的关系图（图6）。从图中得到，光合细菌菌株CP3的菌体数量与OD值大小呈线性关系。可以用公式Y6107X1106此公式来表示，X为OD值，Y即为此OD值下的菌体数量。0002,00047,48500000098,88000000208,14050000042,25350000063,380200000812,53400000Y6E07X1E060100000002000000030
42、000000400000005000000060000000700000000020406081OD值（660NM）菌体数量图6CP3菌体数量与OD值大小的关系FIG6THERELATIONSHIPBETWEENBACTERIALNUMBERSANDTHETHEODVALUESOFCP3以OD值与培养时间的关系作CP3的生长曲线图图7。菌株CP3在24H左右进入对数生长期，48H后生长速率放缓，细菌总量达到最大值，达到光合细菌生长的稳定期。图7光合细菌菌株CP3的生长曲线FIG7PHOTOSYNTHESISBACTERIASTRAINCP3GROWTHCURVE35菌株CP3在褶皱臂尾轮虫增养
43、殖的应用351轮虫形态特征用1ML移液管吸取摇匀的培养液，对光观察，肉眼可以观察到生长良好的褶皱臂尾轮虫游动活泼，趋光性强。在显微镜下观察则个体肥大，胃肠饱满，多数成体带夏卵，一般34个。生长不良者则多数不带卵或带冬卵，出现雄体，死壳增多，活力减弱等现象。352菌株CP3投放实验0010203040506070801224364860728496108120132144时间/HOD660计数每天早晚8点从搅匀的培养液中取含有褶皱臂尾轮虫的培养液LML，在日光下进行计数，轮虫个数以饱满游动白色个体为准，每次计数重复三次，最后求出每毫升褶皱臂尾轮虫数的平均值。分析对计数结果进行统计分析，得到图8图
44、8轮虫生长趋势FIG8TRENDOFROTIFERGROWTH可以看出，第三组中轮虫增殖率在光合细菌投入后的2到4天内含量与其他组相比要高，但是后期逐渐各组趋于同一值，这可能是由于水体其他环境因素及营养条件的限制。取培养第3天的生长旺盛的CP3菌株，其培养液OD为075，由生长曲线得到光合细菌浓度约为46107个/ML。当CP3加量为3ML时，轮虫增殖率最高。此时，初始培养液中CP3浓度约为46105个/ML。4讨论41CP3的单菌落分离通常光合细菌菌株的单菌落采用普通的半固体分离方法就可以得到，但是CP3菌株无法得到理想的单菌落，通过一系列分离方法最后在半固体培养基中加入NA2S才能分离得到
45、理想的单菌落。我们推测CP3菌株可能是由于分离出来的单菌落菌株缺少了某种电子供体而不能生长，而CP3菌系中的某些杂菌刚好为其提供了它所需的电子供体，而分离以后的纯菌株需要H2S作为电子供体才能生长，因此需要加入NA2S才能得到CP3的单菌落。42CP3的生理生化特征从上述实验分析，株菌CP3的细胞壁革兰氏染色为阴性，具有较广的适盐性和耐酸碱性，在去除一切有机碳源的情况下不能利用碳酸氢钠自养生长，黑暗不能生长，厌氧比好氧更适合其生长，可较好地利用乙酸盐、丁酸盐为碳源，不严格需要任何一种维生素。菌株CP3的细胞为卵圆形，大小为1015M2229M,厌氧液体培养物呈红色，细胞含有螺菌红质系的类胡萝卜
46、素及细菌叶绿素A，最适生长PH为60,最适盐度2，CP3还能利用S、NA2S、NA2S2O3生长曲线020406080100120140123456时间（天）密度（个/ML）空白/个1号/个2号/个3号/个4号/个6号/个作为硫电子供体。43关于影响菌株的条件由该实验可知，培养基的盐度、初始PH、光照或黑暗、有氧或无氧对菌体生长有很大影响，而在发酵生产中，培养条件的优劣直接影响生产效率和成本，培养条件的最优化是成功进行菌体生产的必要条件28。此外，接种量、温度、搅拌、光照强度等对菌的生长也有很大影响，因此仍需进行实验，以完善菌株的最佳生长条件参数，进一步为菌株的规模化培养及工业化应用提供理论参
47、考。44关于菌种鉴定目前大部分科学家认为单纯依靠16SRRNA基因序列同源性这一指标不足以将菌株鉴定到种2931，光合细菌菌株的鉴定严格来讲需要采用传统的形态学特征、生理生化特征，结合核酸的碱基组成GC，分子杂交等分子生物学手段，才能准确鉴定到种。以伯杰士细菌系统学手册第二版为依据，16SRDNA基因序列测定和其他生物学特征的结果比较，菌株CP3与外硫红螺菌属的特征描述有许多不同，如菌株CP3的菌体形态为卵圆形，最适盐度为2，最适PH为60；而外硫红螺菌属各菌的菌体形态并没有卵圆形，沙氏外硫红螺菌的最适盐度和最适PH分别为3和80等，因此该种有可能是新种，对此有待更深入的实验验证。而该菌的分类
48、地位有待进一步确定。45关于海水光合细菌在轮虫增养殖中的应用轮虫增殖的主要因素为饵料、氧、氨氮的积累和残饵、粪便等代谢产物。在轮虫培养中，随着种群密度的增大，轮虫分泌和水中有机质分解产生的氨将积累到相当浓度，并产生明显的毒性，这些悬浮物有机质还会堵塞回收轮虫用的浮游生物网，不仅阻碍轮虫的回收和清洗，而且伴随着这些轮虫的投喂，还成为了仔、稚鱼疾病的病因。这些有机质更成为细菌的营养源而繁殖出大量的以弧菌、不动杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、霍乱菌、巴氏杆菌、水中产气单胞菌等为优势菌的菌群，严重影响了轮虫的培养，更使轮虫的品质下降。目前国内外把提高轮虫培养的密度、生产力和生产效率的研究重心放在了水处理装置的
49、开发上，投入了大量的资金来去除轮虫培养中的残饵、粪便等代谢产物，未能充分利用这些大量可以利用的有机质。光合细菌具有多种生理功能，代谢类型极为多样，有光能自养、异养和混养多种营养生长方式，具有光合、固碳、降解大分子有机物、固氮、脱氮、硝化、反硝化、硫化物氧化等代谢方式，被广泛应用于有机污水的处理和改善养殖水体环境等，也是许多动物的优质饵料。海水光合细菌CP3菌株作用于褶皱臂尾轮虫时，能在24天内增加其繁殖力，因此在轮虫培养的特定时期添加光合细菌有助于轮虫高密度增养殖的实现，对解决现实中轮虫培养密度低、抱卵率不高的问题有很大帮助。本次研究选取了具有代表性的菌株CP3，研究了其特性及对轮虫培养的作用。各光合细菌菌株的生物学特性研究是一个很耗时的过程，且轮虫的培养有一定的水温、光照等因素的控制，由于时间及季节关系，并未对其余各个菌株及其混合菌株对轮虫培养的影响进行研究。如果对各种光合细菌作用于轮虫培养的影响做较为彻底、全面的研究，选择合适的光合细菌和确定合适的菌液添加剂量，形成优势菌群，以消耗残饵、粪便等代谢产物，减少氨氮的产生并消耗
