1、血细胞分析的溯源及质量保证,国际参考方法建立国际参考方法vs目前方法学的溯源血液学实验室的质量保证,血细胞分析的基本内容,红细胞计数白细胞计数血小板计数血红蛋白浓度的测定白细胞分类,血球之父，行业鼻祖,1947年，华莱士.库尔特先生获得库尔特原理的发明专利。迄今，全球有95%的血细胞分析仪采用库尔特计数原理。1953年，全世界第一台血细胞计数仪由库尔特家族研制诞生。,溯 源,血细胞计数 显微镜计数库尔特计数多参数计数（物理、化学、免疫学法）相关问题：检测结果大相径庭(室间差异)，需标准化,欧洲血液学会召开了题为“血细胞分析技术及其标准化”的研讨会1963年，里斯本1、成立国际血液学标准化委员会
2、( International Council for Standardization in Haematology)2、解决室间差异3、建立血液细胞分析的国际参考方法4、建立溯源体系：各方法与国际参考方法比较,溯 源,参考方法（Reference method）,一种可清楚和准确描述的用于特定检测的技术，该技术要有依据，可提供高度准确和精密的实验数据以评价其他实验方法检测结果的有效性。若有决定性方法，参考方法的准确性必须与决定性方法进行比较。参考方法应溯源至一级计量标准并且须标示不准确度和不精密度。 （ICSH）,红细胞国际参考方法（ ICSH， 1994年）,原理：电阻法（ ZBI 法）方
3、法：采用Coulter ZBI电子细胞计数仪（单通道、半自动），测定固定容量的颗粒数。用等渗缓冲生理盐水作1/50000倍稀释，测量和纠正重合误差。单通道计数仪，能用于检测通过小孔的红细胞、白细胞，小孔为100m和70m，其长度：直径比率为1。用水平压力计控制稀释细胞悬液的流量为1ml，与脉冲分析仪连接，设置阈值下限，微型计算机采集数据纠正重合误差。对于新鲜血和乳胶颗粒重复测定精度可达0.35%。,技术要求：1、检测系统所有血液流路部分都采用多年不会变形的石英玻璃部件；2、定量部使用水银压力计；3、稀释使用A 级的精密烧瓶和精密吸管；4、为了最大程度减少流体检测中的误差, 设计尽可能简单。,红
4、细胞国际参考方法（ ICSH， 1994年）,利用不同浓度的标本同时通过检测部位的细胞数的比例不同的原理,以连续稀释的检测结果计算出无限稀释倍率浓度时的检测结果(在该浓度下,可认为没有细胞同时通过检测部) ,并将该结果确定为所测标本的“真值”。,红细胞国际参考方法（ ICSH， 1994年）,白细胞国际参考方法（ ICSH， 1994年）,ZBI 法： 只作一次稀释，加入Zapoglobin后在1-5分钟内计数。其他同红细胞计数要求,血小板的国际参考方法（ ICSH， 2001年）,原理：流式细胞仪间接计数血小板方法：采用EDTA抗凝全血，加特异性荧光标单抗（CD41和CD61）染色血小板，被
5、染色血小板在流式细胞仪上根据荧光强度和散射光，得出PLT和RBC比率，再根据血小板和红细胞的比率,乘以红细胞参考方法所检测得到的红细胞真值来间接计算出血小板的真值。计数至少50000个血小板，精度可达2%。用血细胞计数盘直接计数血小板的方法，因为计数盘误差为1%，若计数500个血小板，精度为5%。,测定溶解红细胞中血红蛋白转化成氰化高铁血红蛋白的吸光度,血红蛋白国际参考方法（ ICSH，1978年）,技术要求：1、分光光度计的质量,2、石英比色杯的精度,3、标本的稀释精度,4、根据参考方法中的规定对试剂进行调整,5、按照规定使用清洁的过滤网对标本进行 测试前的过滤等。,血红蛋白国际参考方法（
6、ICSH，1978年）,PCV 国际参考方法（微量离心法）,该法同精密毛细管法相比,从开始操作开始到往精密毛细管内吸入红细胞的步骤是相同的,但是计算时却慎重地避开了精密毛细管的上部和下部仅取中央部分,通过国际参考方法测定该部位的血红蛋白浓度。其结果与国际参考方法测得的全血的血红蛋白浓度的比率为PCV。,血细胞分析结果的溯源性,使用国际参考方法对加入抗凝剂EDTA2K的正常人新鲜血液进行检测,其结果作为该标本各指标的真值（A）。,使用要校准的血细胞分析仪(下称检测系统) ,对同一标本进行检测,并对检测结果进行修正使其与国际参考方法的检测结果相同,该检测系统(B) 与国际参考方法具有可溯源性,即A
7、 = B。问题：如果将某一区域内所有相同的检测系统(C) 都使用上述的同一份新鲜健康人血液进行检测,并把检测结果修正到与国际参考方法一致,实际操作中会存在许多困难。,血细胞分析结果的溯源性,用已溯源到国际参考方法的检测系统(B) 检测可以长期保存的固定后的血液,然后再用其他相同的检测系统(C) 检测该样品,并把所得结果修正到与(B) 相同,此时,市场上相同的检测系统便可以同与国际参考方法可溯源的仪器进行间接溯源,即B = C。 A = B ,B =C A = C结论：市场上的检测系统都可以与国际参考方法进行溯源,血细胞分析结果的溯源性,用C 对其他不同检测系统D 进行溯源性校准时, 可以假定C
8、 为A ,如果两者之间使用新鲜健康人血液具有互换性的话,再用固化后的血液进行调整使C = D , A =B ,B = C ,C = D A = D , 结论：不同检测系统也与国际参考方法具有可溯源性。,血细胞分析结果的溯源性,继续推进此溯源链，就可以推进各国、各地域的标准化,最终实现各单位间检测结果的标准化。,血细胞分析结果的溯源性,溯源 仪器校正、检定（宏观）日常工作质量保证：室内、室间质控（微观）,1、质量保证的过程2、室间质量控制（PT方案）3、室内质量控制4、方法学评价/仪器比对,血液学实验室的质量保证,分析前：标本的采集 （病员信息、采集过程）分析中：目的，原理，标本要求，试剂，质量
9、控制，操作步骤，仪器保养、工作人员能力要求、结果解释和误差来源 分析后：影响测试结果的因素分析、取报告的时间(TAT）、投诉与反馈,质量保证的过程,PT方案 (Proficiency testing) 通过实验室之间的比对判断实验室的检测能力的活动。是室间质量评价的重要方案，通过参加此项能力比对检验活动，可持续监控实验室分析性能，确保检测结果的准确性、可重复性和可比性，促进实验室质量改进。,室间质量控制（PT方案）,能力比对分析（proficiency testing，PT）是室间质量评价技术方案之一。它最初起源于美国，后来许多国家包括我国也采用了此模式，PT已成为全球性室间质量保证系统（Ex
10、tenalnal quality assurance system，EQAS）的主要内容。其方法是将未知标本分发给各实验室，对回报结果进行分析，判断实验室获得正确测定结果的能力，通过各实验室间持续的比较，为衡量实验室的质量提供可靠的标准。为了保护病人的利益和公众的福利，美国国会通过了 1988年临床实验室修正案（clinical laberatory improvement amendrnent，CLIA88），强制性地将PT作为实验室认可的主要内容之一。,室间质量控制（PT方案）,CLIA88的PT方案规定，每年至少进行3次PT调查，每次调查至少包括5个不同的质控标本，即在一年的时间内，对于
11、任一项目至少可得15个测定。对某个特定分析结果如落于规定限内，则判为接受结果；否则为不可接受结果。对某一个接受结果，不再进行优劣分级。,室间质量控制（PT方案）,从PT报告中可以获得两个重要信息：你自己的实验室与使用同一方法的其它实验室结果的差异；与做同一试验，但使用不同方法的实验室结果比较的情况。,意 义,评价实验室的分析能力；监控实验室可能出现的技术问题；改正存在的问题；改进分析能力、试验方法和同其它实验室 的可比性；教育和培训实验室工作人员，以及评价工作人员的工作能力；作为实验室质量保证的外部监督工具（CLIA88要求）。,PT汇总报告的意义,了解所有参加 PT的实验室成绩分布情况。定量
12、 PT报告包括同组的均值、标准差、变异系数、结果分布和有关描述，以及结果的频数分布。这些数据可以比较同组之间 PT结果的差异和更多有用的信息。监测实验室长期的工作状态；指导实验室工作人员的最低工作水平；提供实验室准确度和精密度的客观证据。,质控表的解释 Westgard 规则BULLS测试规则（移动平均数法 ）用病人标本监测质量控制Delta检查的使用,室内质量控制,多规则质控技术（Westgard 规则）,实验室工作人员有时对一些微小变化的质控数据很难解释，使用多规则质控技术可揭示一些潜在的质量问题。其中有些规则对随机误差敏感，有些对系统误差敏感。方法：即使用一组质控规则来判定分析是否在控，
13、Westgard使用五个不同的规则来判断分析的可接受性，即在LeveyJennings质控图规则的基础上增加了R4s 、41s和10x规则，由此提高了系统误差的检出概率。质控图的制作方法同LeveyJennings质控图的制作，即使用不同浓度的两份质控品，每日随病人标本测定，将结果分别点在相应的质控图上。,Westgard 规则,（1）12s：一个质控结果超过2s。提示警告。（2）13s；一个质控结果超过3s。提示存在随机误差。（3）22s：两个连续质控结果超过2s 。提示存在系统误差。（4）R4s：同批两个质控结果之差的值超过4s，即一个质控结果超过-2s，另一质控结果超过了+2s。提示存在
14、随机误差。（5）41s：一个质控品连续四次的结果都超过+1s或-1s，或两个质控品连续两次的测定结果都超过+1s或-1s 。提示存在系统误差。（6）10X：十个连续的质控结果在平均数的一侧。提示存在系统误差。,BULLS测试规则（移动平均数法 ）,移动平均数法是基于病人群体中红细胞指数（MCV，MCH、MCHC）是稳定的这个前提，对红细胞指数进行连续的统计学分析来监测细胞计数仪操作性能的方法。,建立移动平均数MCV，MCH，MCHC的可接受范围：应连续测定500个病人标本，计算每个指标的均数，可接受范围确定为均数3%。将这些范围输入细胞分析仪中，血细胞分析仪可将20个标本定为一组计算出动态均数
15、并且确定这些动态均数是否落在可接受范围内。当动态平均数超出可接受范围时，仪器会提醒工作人员。如果一个动态平均数不可接受，应该选出前20个标本，因为这种方法对病人群体是敏感的。如果这20个标本来自肾透析病人或者肿瘤病人，那么动态平均数的变化则是由于病人群体的问题而非仪器问题引起。一个真实的报警提示仪器存在着影响一个或多个红细胞参数(RBC、H b、或Hct)的仪器问题。,BULLS测试规则（动态平均数）,用病人标本监测质量控制,用EDTA抗凝标本进行细胞计数的优点之一就是可以用它来监测超过24小时的仪器的重复性。从早上的测试标本中选出五个标本，测定每个标本的均值并且将每个标本分成两份，即相同的两
16、批标本。第一批标本用来检测24小时内仪器的精密度，这批标本每四小时测一次，并计算出24小时内的SD、CV。另外一批于冰箱保存24小时，用于监测仪器的日间精密度，24小时后测定每一个样本的均数。将初始均数和24小时测定均数进行比较来决定均数的可接受范围。每个实验室应建立自己的可接受限。,Delta检查,Delta检查依赖对一个特定病人的连续检测，通过对一个病人的最新检测结果与最近一次检测结果进行比较，来检测某一随机误差，这种检测误差的方法即是Delta检查，它已是实验室信息系统(LIS)所提供的最有价值的信息。,为确定在规定时间间隔内某特定实验（如Hb）的连续测定结果之间的可容许差别，应建立一个
17、容许限，这个容许限定义为LIS对异常结果进行标记提示时的限度。计算Delta检查的差别既可以用绝对值来表示，也可以用百分数来表示，无论用哪种方法，建立的Delta限应当是Delta检查失败时真正的结果改变不被标记。如果仔细设置比较的时间范围以及最大容许误差，正确的结果就不会被标记。因此，一个Delta检查最可能的原因是标本错误或者是随机检测错误。在血液学实验室中某些项目具有非常小的个体内变异尤其是红细胞指数、血小板计数、凝血酶原时间和其他凝血研究等。当这些参数出现一个Delta检查时，结果报告之前应进行复查。,Delta检查,方法学评价/仪器比对,一种新方法或者新仪器的选择，评价，改进都必须遵
18、循已建定的方案，每个实验室应设计出自己的一套方法或仪器的选择，评价，改进方案。,仪器选择,成立专门的委员会来进行选择：成员包括血液学管理者、临床实验室专业人员、实验室信息系统人员、质量主管、生物医学工程师和实验室的主管性能评价调查 ：已使用该仪器人员、商家、文献考虑因素：测试项目的费用，试剂，试剂有效期和保存条件，质量控制，试验的敏感性，特异性和线性，所需的仪器和设备，分析时间和所需要的标本类型。,分析的可靠性,在购买新的仪器或者引入新方法学的同时，实验室必须通过一系列的试验研究来证实该仪器和/或该方法的可操作性。评价：随机误差和系统误差,随机误差,检查批内精密度，根据病人标本中被分析物的医学
19、决定水平选择不同浓度的样本，将同一病人标本分为10到20等份作为同一批进行检测。计算其均数、标准差、变异系数 。CV值生产厂家的CV值，则批内精密度为可接受；如果测定的CV值大于生产厂家的CV值，则查出该数据并将其看作离群值剔除并且重新计算CV。如果该CV值仍然不可接受，那么这种方法存在的随机误差或试剂和/或操作的认为误差都会影响精密度测定,系统误差,系统误差可通过新方法和一种已知是准确的方法对同一病人标本的测定结果来评价。将一份病人标本分为几等份（NCCLS建议至少40个样本，100个更好）进行检测。样本应被随机分配，以便能够更具有临床代表意义，理论上他们还应该不同的病理条件。选择好样本后，
20、应将同一样本等分用两种检测方法进行分析。每种方法中每种标本都测定双份，但两次应在不同的时间段进行测定。所有的分析都应在同一天完成，最好在4小时以内。结果分析：配对T检验 、线性回归分析,线性范围与可报告范围的确定,建立线性范围和容许区间：稀释试验、回归分析验证仪器的可报告范围 ：分析至少三份不同浓度标准品或是落在可报告范围的线性检查物质，每份标本分为两份检测。 1、如果这些结果都落在仪器的容许区间内，则可确证可报告范围。 2、如果结果不在可容许区间内或者非线性，则应选择可报告范围内更多的标准物来进行重复测定。3、如果结果无法验证出仪器的可报告范围，实验室应修改可报告范围。,参考范围的确定,来源：参考书、仪器/试剂厂家、自定参考范围受仪器的多样性、选择的试剂、病人群体的影响。实验室可以选择建立自己的参考范围或者是验证生产厂家的参考范围。理想状态下，参考范围应该基于病人群体的年龄和性别确定。每个年龄和性别范畴内，至少检测120个个体。将年龄分组的方法之一就是每十岁为一组。为了将由于仪器或者试剂的不同，对参考范围的随机变化降到最低，每天应测定5-10个标本。,谢谢,
