1、2015届研究生论文答辩,2015年4月,阴沟肠杆菌耐药性分析与产-内酰胺酶及质粒介导基因型检测研究The study of analysis of antibiotic resistance and detection of beta-lactamases and plasmid-mediated resistance genes in Enterobacter cloacae,姓 名： 导 师： 专 业：,主要内容,研究背景,1,实验材料,2,方法步骤,3,结果讨论,4,研究背景,阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae, E.cloacae）为肠杆菌科肠杆菌属细菌，是医院感染
2、常见的条件致病菌之一。可引起呼吸道、伤口、泌尿道、血液系统等多部位感染。,研究背景,根据2011-2012卫生部全国细菌耐药（Mohnarin）报告显示，肠杆菌属的检出率占肠杆菌科细菌的第三位，而阴沟肠杆菌占肠杆菌属细菌的60.8%。,阴沟肠杆菌的耐药问题变得越来越严重，应该引起临床足够的重视。,研究背景,据目前研究显示，阴沟肠杆菌主要的耐药机制为：产生钝化酶或灭活酶；质粒和整合子等可移动基因元件参与的耐药；喹诺酮类（qnr）基因介导的耐药；外膜通透性下降；主动外排泵增强；生物被膜形成等。 阴沟肠杆菌产生的-内酰胺酶是对-内酰胺类抗生素耐药的主要机制。,研究背景,阴沟肠杆菌中-内酰胺酶,碳青霉
3、烯酶,质粒型AmpC酶,染色体型AmpC酶,研究背景,染色体介导的AmpC酶：,质粒介导的AmpC酶：,定义：由肠杆菌科细菌（如阴沟肠杆菌）产生，其具有比ESBLs更广的水解底物谱，能有效水解三代头孢菌素类、单酰环类及头霉素类抗生素，且不受酶抑制剂所抑制。质粒介导的AmpC酶多为持续高产型。,研究背景,研究背景,2008-2012年我院阴沟肠杆菌耐药现状：对头孢噻肟耐药率在40%60%间，对头孢他啶的耐药率在34%50%间,环丙沙星耐药率25%46%间,对阿米卡星耐药率在8%24%间。说明我院阴沟肠杆菌对于有-内酰胺类及喹诺酮类抗生素耐药情况较为严重，有必要对阴沟肠杆菌耐药机制进行深入研究，以
4、更好地预防与治疗阴沟肠杆菌引起的各种感染。,研究背景,据文献报道,肠杆菌科细菌对上述2类抗菌药物的耐药机制研究显示:1.肠杆菌科细菌对-内酰胺类抗生素耐药的主要机制是产生ESBLs及AmpC酶,而大多数编码产ESBLs及AmpC酶的基因是由质粒介导8,9。2.近年发现，质粒上携带的qnr基因可介导喹诺酮类药物的耐药。,研究背景,质粒介导的耐药基因,产ESBLs和(或)AmpC酶菌株中常能检出qnr基因，从而导致细菌多重耐药的产生。,研究背景,微生物菌株同源性分析：意义： 它在帮助临床医生判定医院感染的爆发、确定感染的病原菌、寻找感染源以及识别一些特殊的致病菌等有着重要的作用。,研究背景,通过对
5、我院2008年1月至2014年12月临床分离出的1596株阴沟肠杆菌的感染分布及耐药性进行回顾性统计分析，以了解我院阴沟肠杆菌的临床感染分布及耐药性变迁情况；,本地区对阴沟肠杆菌的耐药性、产酶及耐药基因检测尚缺乏相关报道。,研究背景,收集我院2013年6月-2014年6月临床分离的阴沟肠杆菌非重复阴沟肠杆菌共174株，采用多底物协同-拮抗法、PCR扩增及ERIC-PCR检测，分析我院阴沟肠杆菌对临床常用抗菌药物的耐药性、产AmpC酶和ESBLs的情况、质粒介导的-内酰胺类和喹诺酮类的耐药基因及耐药菌株院内感染的分子流行病学情况。,实验材料,菌株来源：来源于2008年1月2014年12月临床各科
6、室送检的痰、尿液、血液及各种分泌物、引流物等标本,收集2013年6月2014年6月临床检出的鉴定率达98.0%以上的阴沟肠杆菌共174株，去除同一病例同一部位标本的重复菌株。质控菌株:大肠埃希菌 ATCC25922、铜绿假单胞菌 ATCC27853 和肺炎克雷伯菌 ATCC700603（由贵阳医学院附属医院微生物免疫科保存）。,主要仪器：,C02培养箱,蛋白核酸紫外分析仪,凝胶成像仪,全自动细菌鉴定与药敏分析仪,PCR仪,高压灭菌器,实验材料,主要试剂：血琼脂平板（广州市迪景微生物有限公司）；水解酪蛋白（M-H）琼脂（杭州天和微生物试剂有限公司）；药敏纸片：头孢噻肟(CTX，30/片)、头孢噻
7、肟/克拉维酸(CTX/CA，30/10/片)、头孢他啶(CAZ，)30/片、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CA，30/10/片)、头孢吡肟(FEP，30/片)、亚胺培南（IPM，10/片）和头孢西丁(FOX，30/片），均购自英国Oxoid公司；高纯度质粒小提中量试剂盒（离心柱型）（TIANGEN，北京）；细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（TIANGEN，北京）；引物（上海生工生物有限公司）；Premix ExTaq Version（大连宝生物公司）等。,实验材料,实验方法,1.耐药性分析,细菌分离、培养,Microscan walkaway-40SI全自动细菌鉴定与药敏分析仪,药敏数据,
8、WHONET5.6软件和SPSS17.0软件进行统计分析,实验方法,2.产AmpC酶和ESBLs的检测,贴药敏纸片，35培养16-18h,贴纸片要求：FEP与CTX/CA圆心间距为20mm，CTX/CA与CTX、CTX与CAZ、CAZ与CAZ/CA、CAZ/CA与FOX圆心间距24mm，IPM与周边6个纸片的圆心距25mm。,实验方法,结果判读：（l)产ESBLs:CTX/CA与CTX和(或)CAZ/CA与CAZ的抑菌圈直径差5mm，和（或）FEP与CTX/CA间出现协同。(2)产AmpC酶：IPM敏感（抑菌圈16mm）+FOX耐药（抑菌圈18mm）。 产AmpC酶的表型判断: IPM与CAZ
9、,CTX,FEP,CTX/CA和CAZ/CA间拮抗,使后5种纸片抑菌圈的内缘半径缩小,与外缘半径产生半径差。 高诱导型AmpC酶：任意一个药敏纸片的最大半径差4mm； 部分去阻遏型AmpC酶：任意一个药敏纸片的最大半径差2mm且4mm； 完全去阻遏型AmpC酶：任意一个药敏纸片的最大半径差2mm，诱导阴性（抑菌圈内无散在的菌落）。(3)ESBLs十AmpC酶：(1)表型阳性+(2)表型阳性。(4)ESBLs+完全去阻遏型AmpC酶：还可表现为CAZ，CTX，CAZ/CA和CTX/CA的抑菌环直径均为6mm, FEP表现为耐药且与CTX/CA间出现协同。,不同产酶表型的M-H琼脂平板图,阴性对照
10、,ESBLs阳性对照株,不同产酶表型的M-H琼脂平板图,不产酶株型,单产ESBLs型,不同产酶表型的M-H琼脂平板图,高诱导型AmpC酶,部分去阻遏型AmpC酶,完全去阻遏型AmpC酶,不同产酶表型的M-H琼脂平板图,高诱导型AmpC酶+ESBLs,部分去阻遏型AmpC酶+ESBLs,完全去阻遏型AmpC酶+ESBLs,实验方法,细菌复苏培养,3. 耐药基因检测：,DNA纯度及浓度检测,细菌质粒DNA的提取,PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察并保存结果,目的基因测序,按细菌高纯度质粒小提中量试剂盒（离心柱型）提取,引物设计,从ncbi上查找各基因登录号，交由上海生工生物有限公司设计并合成
11、,PCR扩增,实验方法,4. 同源性检测,细菌复苏培养,细菌基因组DNA的提取,PCR扩增,PCR产物于0.9%琼脂糖凝胶电泳,ERIC-PCR电泳图谱判读,运用Quantity one 4.6软件对DNA图谱进行聚类和相似性分析，采用UPGMA方法，条带位置差异宽容度2.0%，相似度80%者为同一带型，代表同一克隆，80%者为不同带型，代表不同克隆，分别依次命名为A、B、C.型。,结果与讨论,1. 2008-2014年阴沟肠杆菌的检出情况及排序,耐药性监测结果,提示阴沟肠杆菌作为临床感染常见的条件致病菌之一，占有一定重要的位置，应引起临床重视。,构成比%,2. 2010-2014年阴沟肠杆菌
12、主要标本类型中的检出情况,提示在有皮肤黏膜受损等情况下，机体的正常屏障防御功能减弱，阴沟肠杆菌更易入侵感染而致病。,3. 阴沟肠杆菌中主要标本类型分布情况,由于临床送检标本中，痰标本的数量最多，所以，对于呼吸道标本中检出的是感染菌还是定植菌的问题还存在一定疑惑，有待通过结合临床相关资料，进行分析统计后进一步明确。,4. 阴沟肠杆菌在主要标本来源中的耐药情况,说明阴沟肠杆菌引物泌尿系统感染的耐药情况较其他系统感染更为严重，临床治疗是应根据药敏结果合理选择抗生素。,5. 株阴沟肠杆菌在主要临床科室中的耐药情况,这些科室患者大都病情严重，免疫力下降及住院时间较长；行气管插管、气管切开、呼吸机及长时间
13、留置静脉导管、尿管等侵入性诊疗操作较多，破坏了机体的天然屏障功能而导致感染；由于广泛的使用广谱抗菌药物、免疫抑制剂等药物，抑制了正常菌群，使体内菌群失调，阴沟肠杆菌定位转移至其他部位，导致医院内感染和耐药菌的流行。,6. 阴沟肠杆菌在不同年龄组间的耐药情况,原因：成人和老年人长期应用抗生素会使敏感菌株不断被杀灭，留下耐药菌株大量繁殖，同时使一些抗生素由敏感转为耐药，这种抗生素的选择性压力是造成细菌耐药的主要原因。儿童可能因为较少或无抗生素应用史，所以耐药率较低。,7. 2008-2014年阴沟肠杆菌对15种抗菌药物的耐药性变迁,反映了我院对抗生素的合理使用及控制管理较好的结果。,可能与阴沟肠杆
14、菌产生-内酰胺酶、整合子、qnr基因介导耐药、外膜通透性改变、主动外排泵的系统作用、药物作用靶位的改变等23耐药机制有关。,临床上使用第三、四代头孢菌素及喹诺酮类等抗菌药物治疗本菌感染时，必须根据药敏试验选择药物，否则，即使联合用药也多无效。,七年中，共检出耐亚胺培南的菌株56株，应引起重视。但是近两年内，亚胺培南仍然是目前抗菌活性最强的药物，依然可以作为多重耐药菌感染的重症疾病的首选药。,09年后阿米卡星的耐药率有所下降，可能是由于其具有耳毒性和肾毒性，使其在临床上应用减少。,1.阴沟肠杆菌产不同表型AmpC酶和ESBLs,结果与讨论,产酶表型检测结果,有12株而不能分型，可能是阴沟肠杆菌中
15、还存在其他类型的AmpC酶而本法不能检测出。,2.产酶株耐药情况,3.不同表型产酶株对15种抗菌药物的耐药率,阴沟肠杆菌同时产两种酶对常用抗生素的耐药情况更加严重，应加强监测。,1.-内酰胺酶基因的检出分布情况,30株,41株,结果与讨论,耐药基因检测结果,2.-内酰胺酶基因检测率,ESBLs基因总检出率为31.03%,AmpC酶基因总检出率为21.26%,说明我院分离的阴沟肠杆菌存在多种ESBLs耐药基因，以TEM型为主，而VEB型少见。,王凤霞33等在天津地区阴沟肠杆菌中发现DHA和ACT-1基因阳性率分别为10.4%和32.2%； 陈洁等34在宁波地区阴沟肠杆菌中发现ACT-1和DHA基
16、因阳性率分别为3.5%和29.4%而赵旭5研究发现阴沟肠杆菌中质粒介导的DHA-1型AmpC酶的阳性率为17.5%，是AmpC酶的主要流行型。,说明质粒型AmpC 酶基因的流行存在地区差异，而我院同时存在DHA-1型和ACT-1型的AmpC酶基因。,3.-内酰胺酶基因型与表型检测结果,其可能是多底物协同-拮抗法同时检测AmpC酶和ESBLs，药物相互之间存在影响而使ESBLs的检出率低或是待检菌产酶量低而致使表型筛选不出有关,需进一步研究证实。,其原因可能是其它株存在其他类型ESBLs基因而本试验未涉及到,原因可能是AmpC酶主要是由染色体介导，而本次实验检出的是质粒型AmpC酶基因；其次是存
17、在其它质粒型AmpC酶基因而本试验未涉及到。,可能与待检菌产酶量低导致表型筛选呈阴性。,4. qnr基因的检测结果,共47株qnr基因阳性率27.01%,说明我院阴沟肠杆菌株同时存在三种PMQR基因，以qnrB基因较多。,周强等38在广州地区阴沟肠杆菌中报道的qnrA、qnrB、qnrS基因检出率分别为3.1%、7.5%、4.4% ；2011年张玉梅等39在山西地区发现qnrA、qnrB基因检出率分别为4%、16%，没有检测到qnrS。,由于各地区环境因素、用药习惯不同，质粒介导qnr基因的检出率也就各不相同。,5.qnr基因型与耐药表型结果：,*：P0.05，经2检验，环丙沙星耐药或敏感株对
18、qnr基因阳性检出率比较差异有统计学意义。,提示qnr基因的存在与环丙沙星的耐药有一定的相关性；与左氧氟沙星耐药不存在相关性，其原因有待进一步研究证实。,左氧氟沙星耐药或敏感菌株中qnr基因阳性率经卡方检验，比较差异无统计学意义（P0.05）。,6.质粒介导ESBLs和AmpC酶基因阳性株中qnr基因检出率,注：*：P0.05，经2检验，ESBLs+AmpC酶基因均阴性株与ESBLs、AmpC酶、ESBLs+AmpC酶基因均阳性株对qnr基因阳性检出率比较差异有统计学意义。,提示在产ESBLs或者AmpC酶菌株中qnr基因检测阳性率较高。,6.各耐药基因阳性检测结果电泳图片,注：阴：阴性对照；
19、M:Marker；T:TEM-1阳性条带；S：SHV-12阳性条带；C:CTX-M-3阳性条带；SF:SFO-1阳性条带；V:VEB-3阳性条带；D:DHA-1阳性条带；A:ACT-1阳性条带；QA:qnrA阳性条带；QB:qnrB阳性条带；QS:qnrS阳性条带。,测序比对结果图片如下,TEM-1,SHV-12,CTX-M-3,SFO-1,VEB-3,TEM-1、SHV-12、CTX-M-3、SFO-1、VEB-3基因测序结果与GenBank上TEM-1、SHV-12、CTX-M-3、SFO-1、VEB-3基因相似性均为100%同源，可确定为TEM-1、SHV-12、CTX-M-3、SFO-
20、1、VEB-3型。,测序比对结果图片如下,DHA-1,ACT-1,DHA-1、ACT-1基因测序结果与GenBank上DHA-1、ACT-1基因相似性均为99%同源，可确定为DHA-1、ACT-1型。,测序比对结果图片如下,qnrB,qnrS,qnrA,qnrA、qnrB、qnrS基因测序结果与GenBank上qnrA、qnrB、qnrS基因相似性均为100%同源，可确定为qnrA、qnrB、qnrS型,注：M:Marker 5kb，上下：5kb0.1kb；N:阴性对照；51-60:51-60号标本,部分ERIC分型电泳图,结果与讨论,ERIC-PCR检测结果,70株阴沟肠杆菌同源性聚类分析图
21、,70株携带耐药基因的阴沟肠杆菌电泳DNA图谱相似度在80%以上的有24个型别，分别命名为A至X型，其中，A、B、C、D、F、G、H、M、O、P、R、S、T、U各一株，E、I、J、K型各有2株，N、Q型各3株，L型有4株，W型有6株，V型有9株，X型有18株,另有5株菌未扩增出结果。,提示携带耐药基因的阴沟肠杆菌引起的医院感染存在散发克隆传播情况。,医院应加强医务人员手卫生以及病区的隔离消毒意识,加强抗菌药物的管理和应用,做好临床耐药菌株的监测,预防并阻止耐药菌株在院内传播流行。,同一克隆类型菌株存在于不同科室，而同一科室也存在不同类型的克隆株。,提示科室间可能存在不同克隆株的交叉感染。,结论
22、,1. 阴沟肠杆菌耐药性分析 本院阴沟肠杆菌对临床常用抗菌药物的耐药率呈下降趋势；对于碳青霉烯类抗生素不敏感菌株的出现应引起重视。2. 阴沟肠杆菌产酶情况 本院阴沟肠杆菌以产AmpC酶为主，同时产AmpC酶和ESBLs的菌株对第三代头孢菌素、单环类、青霉素类具有高度耐药性，对碳青霉烯类敏感。碳青霉烯类抗菌药物依然是治疗多重耐药阴沟肠杆菌感染的首选。,结论,3. 阴沟肠杆菌携带耐药基因情况 本院阴沟肠杆菌同时存在不同类型的-内酰胺酶基因和qnr基因，ESBLs耐药基因以TEM-1型为主，ESBLs和（或）AmpC酶基因阳性株可同时携带qnr基因，环丙沙星的耐药与qnr基因存在一定的相关性。产AmpC酶、ESBLs以及质粒介导的耐药基因是导致阴沟肠杆菌多重耐药的主要机制之一。4. 阴沟肠杆菌同源性分析 阴沟肠杆菌在医院内存在部分克隆株散在传播情况。,Thanks!,敬请各位专家老师指导点评！,
