1、青蒿素片的研发过程,姓名：XXX 学号：. 专业：,2018/7/31,Contents,一、研究历史,青蒿素的故事原来始于中国文化大革命和援越抗美战争时期。当年在越南战争的战场上，由于疟疾的流行，作战双方的士兵纷纷感染疟疾，严重地影响了部队战斗力。抗氯喹的恶性疟原虫 (Plasmodium falciparum) 的出现更成为当时疟疾防治的主要难题. 1967年5月23日，在毛泽东主席和周恩来总理的指示下，一项具有国家机密性质、代号为“523项目”的计划就此启动了。项目短期的目标是要尽快研制出能在战场上有效控制疟疾的药物 ，而它的长远目标是通过筛选合成化合物和中草药药方与民间疗法来研发出新的
2、抗疟药物。 1969年1月，屠呦呦被任命为北京中药研究所523课题组的组长,领导对传统中医药文献和配方的搜寻与整理。,历经380多次鼠疟筛选，1971年10月取得中药青蒿素筛选的成功。1972年从中药青蒿素中分离得到抗疟有效单体，命名为青蒿素，对鼠疟、猴疟的原虫抑制率达到100%。 1973年经临床研究取得与实验室一致的结果，抗黄花蒿疟新药青蒿素由此诞生。 1981年10月在北京召开的由世界卫生组织主办的“青蒿素”国际会议上，中国青蒿素的化学研究的发言，引起与会代表极大的兴趣，并认为“这一新的发现更重要的意义是在于将为进一步设计合成新药指出方向”。 1986年，青蒿素获得新一类新药证书，双氢青
3、蒿素也获一类新药证书。这些成果分别获得国家发明奖和全国十大科技成就奖。 2011年9月23日，青蒿素的研究者屠呦呦获得美国纽约拉斯克奖，这是中国科学家首次获得这一国际医学大奖。 2011年11月15日，中国中医科学院在京举行“2011年科技工作大会”。会上授予屠呦呦中国中医科学院杰出贡献奖，奖励青蒿素研究团队100万元人民币。 2012年7月4日，上海交通大学宣布，在世界上首次实现了抗疟药物青蒿素的常规人工化学合成。,二、实验方案,方法一、CO2超临界流体萃取法 实验步骤： 1、粉碎-装料：将黄花蒿粉碎成中粉，装入料筒中，在整体装入萃取釜中。 2、CO2超临界流体萃取：CO2经热交换器冷却进入
4、贮罐；冷CO2经压缩机压缩至20MPa，再经热交换器加热至50进入萃取釜中；两萃取釜间歇交替工作，每个萃取釜萃取4个小时后切换，保证萃取液连续从萃取釜中抽出；萃取液先通过过滤器除去可能夹带出的固体颗粒，然后经热交换器加热至60，进入一级分离釜，萃取液析出部分杂质后进入另一热交换器，调节温度至所需值，再进入二级分离釜析出青蒿素等溶质。分离釜采用两组并联，当一组解析溶质时，另一组放空取出提取物。 3、硅胶柱净化：从二级分离釜出来的CO2带有少量的溶质和水分，经热交换器将温度调至预设值后进入硅胶柱。硅胶柱采用两柱并联操作，一个硅胶柱进行吸附操作时；另一个硅胶柱进行再生。净化后的CO2 经热交换器进入
5、贮罐，完成一次循环操作。 4、补充新鲜CO2：由于萃取釜卸料、分离釜放料以及硅胶柱再生等过程都需要放空，不可避免的会损失，故需要不断补充。,工艺流程,工艺原理： 利用CO2超临界流体的可调溶解性能，选择性地提取青蒿素。通过硅胶柱色谱，进一步 提高青蒿素的收率。,方法二、大孔吸附树脂法 实验步骤： 1.渗漉提取：黄花蒿粗粉加60%乙醇室温浸泡6小时，渗漉，收集渗漉液。 2.大孔吸附树脂分离：渗漉液经活性炭脱色，抽滤，滤液上ADS-17树脂柱，水洗后用30%的乙醇洗脱，收集洗脱液。 3.回收溶剂-重结晶：将洗脱液于60减压浓缩，回收乙醇，静置得青蒿素粗品，再经70%的乙醇重结晶，制得青蒿素。,工艺
6、原理： 青蒿素在大孔吸附树脂的表面吸附和氢键吸附的作用下，吸附量大，易解析。,三、临床前研究,药理学,毒理学,药代动力学,药理学,1,（1）抗疟作用,实验证明：青蒿素对红细胞内期疟原虫无性体有较强杀灭作用。对抗氯喹和奎宁的疟原虫有良好的疗效。但对原发性和继发性红细胞外期及蚊体内的孢子增殖无影响。本品的抗疟作用与叶酸代谢无关，也不像氯喹等抗疟药那样干扰DNA的复制，其抗疟作用主要是破坏疟原虫滋养体的膜系结构，干扰疟原虫的表膜-线粒体功能，使原虫体无法摄取宿主红细胞内的营养物质而发生肿胀、死亡，并不断排出体外。 青蒿素被疟原虫体内的铁催化, 其结构中的过氧桥裂解, 产生自由基, 与疟原虫蛋白发生络
7、合, 形成共价键, 使疟原虫蛋白失去功能, 从而死亡李锐等认为青蒿素及其衍生物通过抑制细胞色素氧化酶, 干扰原虫膜系线粒体功能, 阻止原虫消化酶分解宿主的血红蛋白成为氨基酸, 使疟原虫无法得到供给自身蛋白质的原料, 而迅速形成自噬泡, 导致虫体瓦解死亡。Steven 等认为青蒿素与原虫内的氯化高铁血红素反应导致副产物活性氧的产生, 而活性氧的产生导致疟原虫膜系统的损害, 从而原虫代谢功能紊乱直至死亡。,药理学,1,（2）抗癌作用,青蒿素可显著降低急性白血病K562细胞端粒酶活性，抑制癌细胞生长和诱导细胞凋亡。端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白多聚酶。端粒酶活性增加与肿瘤的发生、发展密切相关，大量研究
8、资料表明，造血系统的恶性肿瘤均表现高端粒酶活性，其活性的高低对判断白血病的疗效、恶性程度、预后及复发均有重要的临床意义。故抑制端粒酶的活性，不仅可增加肿瘤细胞凋亡，还可增加其他化疗物质的疗效。,（3）抗吸血虫作用,（4）抗心律失常,（5）增加免疫功能,毒理学,2,2.1 小鼠的急性毒性,用体重1822克的小鼠分组.以不同剂量的青篙素混悬液一次灌胃,记录三天内死亡数.按Burn一Karbe氏法计算半数致死量,LD50=4530士672.7mg/kg。 不同种类动物大剂量单次注射双氢青蒿素的急性症状有：动物懒动、发抖，运动失调，呼吸缓慢，感觉迟钝及反正反应消失。鸽子、豚鼠、兔、猫及狗可表现出痉挛性
9、和强直性的惊厥，死前均有频繁抽搐，先呼吸停止然后心跳停止。鸽子对双氢青蒿素的毒性对敏感，大鼠最耐受。存活动物一般在10h24h后逐渐恢复正常。,毒理学,2,2.2 大白鼠的长期毒性,取体重80I00克的大鼠32只,分为四组,雌雄配搭均匀.第一组大剂量为1000mg/kg,第二组为500mg/kg,第三组为250mg/kg,第四组为对照.每天给药一次,连续14天.给药前称体重.测心电、血像.给药期间,每三天称体重一次.观察一般表现及食欲.最后一次给药后12小时内测心电.停药24小时测血像后各组处死一半.取心、肝、脾、肺、肺、肾、脑、胃作病理切片检查.其余动物一周后再处死作病理切片检查,结果指出:
10、三个实验组与对照组的体重增长率是一致的.说明青篙素对大鼠的食欲和生长没有影响.且心电、血像和各组的病理学检查,均无异常改变.,毒理学,2,2.2 恒河猴的长期毒性,恒河猴肌注青蒿素溶液亚急性毒性病理学研究表明：恒河猴连续14天肌注青蒿素溶液，按每天肌注24mg/kg、48mg/kg、96mg/kg、192mg/kg，分别为小、中、大、特大剂量组。于停药后3天，发现96mg/kg、192mg/kg组引起多种脏器组织的损伤。表现为骨髓红系和粒系细胞减少、成熟发育障碍、巨核细胞增生、心肌细胞变性或灶性坏死（以超微结构病变为主）；肝、肾营养不良性改变；淋巴组织萎缩；注射部位损伤等。其中以骨髓和心肌损伤
11、较为明显。停药后35天，上述病变明显减轻或消失。表明青蒿素的毒副作用是可逆的。每天肌注青蒿素24mg/kg、48mg/kg，为轻微中毒剂量；96mg/kg为严重中毒剂量；192mg/kg为致死剂量。致死原因为严重心肌损伤。,毒理学,2,2.3 生殖毒性,大鼠与孕后第16天（d16）灌胃青蒿素1/25LD50值 （223mg/kg），几乎全部胎鼠发育正常；孕d68给药,6.1%的胎鼠出现脐疝，其余发育正常；孕d911给药，胎鼠全部被吸收。以小鼠进行实验，也有类似的结果。小鼠与孕d615后每天肌注蒿甲醚5.4mg/kg，对胎鼠的生长发育无明显影响，肌注10.7mg/kg和21.4mg/kg则分别有
12、30%和100%胚胎被吸收。大鼠和兔在相应的低剂量时对胎仔生长发育亦无影响，在相应高剂量时被胚胎大量吸收。由以上结果可知：青蒿素及其衍生物有较明显的胚胎毒性作用，在较小剂量时即可引起胚胎吸收，对存活动物致畸性较小或无致畸性。且在不同孕期给药时对胚胎的作用亦不同。,毒药理学,2,2.4 致突变作用,经Ames试验、微核试验未发现青蒿素具有诱变性。经Ames试验、微核试验及哺乳动物培养细胞染色体畸变试验均未发现青蒿素有致突变作用。,药代动力学,3,中国青蒿素实验小组经大鼠实验表明，大鼠口服青蒿素150mg/kg后，吸收迅速完全，但血药浓度低，维持时间短，显示有首过效应。静脉注射青蒿素混悬水溶液15
13、0mg/kg，血药时程符合二室模型，t为30min，Vd为4.1L/kg，表明青蒿素在体内分布广泛，消除迅速。,3.1 大鼠的药代动力学,药代动力学,3,健康犬10只，随机分为2组，一组采用口服方式连续给药5日，每日1000mg，另一组采用静脉注射方式连续给药5日，每日60mg。各组分别于第1日、第5日采血，应用液相色谱-质谱联用方法测定血浆中青蒿素的含量并计算主要药动学参数。口服组达峰浓度（Cmax）和达峰时间（Tmax）为实测值。以半对数作图法，由消除相末几个浓度点计算消除速度常数 k，并根据 k 计算 t。第一日口服给药后Cmax为29.1 9.9 ng/mL，Tmax为1.9 0.7
14、h， t为 2.6 0.6 h。连续 5 日口服给药后血药浓度已基本测不出，未求算药动学参数。,3.2 健康犬的药代动力学,药代动力学,3,静注组以血药浓度的对数对时间作图得直线，由直线斜率和截距求出初始浓度C0和消除速度常数 k，并计算 t。第 1 日静注给药后的 t为 0.9 0.7 h。静注连续给药 5 日后的t为 0.2 0.04 h。口服第口服第 5 日组给药后血药浓度明显低于单次给药组，静注组第 5 日给药后 t无明显差别。结果表明多剂量口服给药后，血药浓度呈现显著的时间依赖性降低，而静注给药未发现类似现象，表明自身诱导代谢主要影响了首过代谢过程，此外该药在犬体内的口服生物利用度很
15、低，口服给药的血药浓度远低于静注给药。,四、临床实验,（一）、临床期,1、血药浓度-时间曲线 10名受试者空腹口服青蒿素片1 000的平均血药浓度-时间曲线。如下图所示。,2、药代动力学参数按统计处理方案,计算每个受试者的药代动力学参数,10名受试者空腹口服青蒿素片1 000的平均药代动力学参数,见下表。,本实验选择10名中国健康成年男性志愿者,空腹口服青蒿素片1000,进行药代动力学研究。研究结果显示,青蒿素片口服给药后,吸收快、体内半衰期短。,（二）、临床期,青蒿素栓剂每粒含青蒿素分别为100、200、300、400、600mg，成人总量2800mg，首剂600mg，隔4h再给600mg，
16、第2,3d上、下午各给药400mg，小儿剂量按年龄递减，用治恶性疟100例，均能迅速控制临床症状，平均退热时间为（20.711.8）h，平均原虫转阴时间为（53.215.6）h。,青蒿素制剂有4种：片剂、油剂、油混悬剂与水浸悬剂，总量分别为2.53.2,0.50.8,0.81.2,1.2mg。片剂口服，每天24次，其余制剂均肌注给药，疗程均为3天。治抗氯喹株恶性疟143例，全部临床治愈。治脑型疟141例，治愈131例，治愈率为92.7%。,（三）、临床期,治间日疟1511例，恶性疟588例，全部临床治愈，治愈率为100%。,人体内的药理学,青蒿素类药物抗肿瘤谱广， 在体内外对多种肿瘤细胞的生长
17、均具有明显抑制作用 ，一些新型青蒿素衍生物治疗效果甚至优于目前常用的化疗药物;对部分多药耐药株亦具有杀伤作用，联合化疗时能使药效协同增强， 同时还具有放疗增敏作用 ; 并且其毒副作用小 、成本较低 ，预示其极可能成为具有临床应用价值的抗癌新药 。 青蒿素片有增强细胞免疫功能的作用，可显著提高淋巴细胞转化率，但对抗原结合细胞和抗体形成细胞有非常显著的作用。 青蒿素片能显著降低急性白血病K562细胞端粒酶活性，抑制癌细胞生长和诱导细胞凋亡。 青蒿素片的抗纤维化作用与抑制成纤维细胞增殖、降低胶原合成、抗组胺促胶原分解有关。,人体内的毒理学,经过长期、 大规模临床临床应用 ， 青蒿素被认为是低毒安全的
18、药物。自 1991 1995 年在泰国进行的一项研究显示， 对 3662 名患有恶性疟疾受试者口服给予青蒿素片，连续服用超过 7 天 后， 未 发 现 任 何 与 药 物 相 关 的 毒 副 作用。目前虽然在临床上没有致畸的报道， WHO 建议在妊娠前 3 个月的孕妇避免使用青蒿素类药物。肌内注射油制剂由于释放缓慢，药物暴露时间长， 毒性更大 。对青蒿素类药物抗肿瘤分子机制研究的不断深入， 由于该类化合物存在一定的神经和胚胎毒性。,人体内的药代动力学,关于人体内的药动学资料很少，其原因是目前尚难以找到准备可靠测定此类药物血药浓度的方法。此外，青蒿素及其代谢物可与红细胞膜紧密结合，使其血药浓度-
19、时间曲线复杂化。青蒿素口服吸收快，0.5-1h达血药峰浓度，随后迅速下降，4h降至血药峰浓度1/2以下，72h血中仅含微量。尿中排泄物全是代谢物，主要为氢化青蒿素和还原青蒿素，其代谢物均无抗疟活性。青蒿素亦可经直肠吸收，其在体内分布广泛，以肠、肝、肾含量较多。青蒿素为脂溶性，可透过血脑屏障，并在脑内维持较长时间。其体内过程的特点是吸收快、分布广、代谢和排泄快，24h可排除84%。其复燃率高可能与代谢、排泄快有关。改用油剂肌内注射或用栓剂肛门给药可延缓其吸收、延长作用时间，显著降低复燃率。,1,2,3,4,呼吸系统疾病的介绍,呼吸系统疾病的原因,祛痰镇咳药机制,五、政府审批,1986年，青蒿素获
20、得新一类新药证书，获得国家发明奖和全国十大科技成就奖。 目前，青蒿素已推向国际市场，并在42个国家和地区获得国际药物专利注册，使数以千万计的疟疾病人免于死亡。2003年世界卫生组织又资助500万美元向全世界推广，成为全球一线抗疟药。 2006 年以来, 为克服耐药性, 世界卫生组织(WHO)宣布改用青蒿素的联合疗法(ACT), 挽救了 80 个国家 100 多万人的生命。2011年，青蒿素的研究者屠呦呦获得美国纽约“拉斯克奖”。,六、上市后研究,临床期,青蒿素对各种疟疾，包括恶性疟疾、脑型恶性疟疾及对氯喹耐药的疟疾均有显著疗效，治愈率100%，且临床应用20余年，也未有耐药报道。其退热时间及疟原虫转阴时间都较氯喹快。但对间日疟原虫的近期复发率较氯喹高20%30%，与伯氨喹联用，可使复发率降至10%左右。 此外，国内近年来应用青蒿素预防和治疗血吸虫病也获得较好的疗效，对系统性红斑狼疮及盘状红斑狼疮也均有一定的缓解作用。另据美国生命科学杂质报道，离体实验证实，青蒿素对癌细胞有选择性杀灭作用。美国FDA已批准用于癌症的治疗，包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肾癌和白血病。,2018/7/31,
