1、 1 本科毕业论文外文翻译 译文： 高效液相色谱法测定血浆中氨基乙磺酸 来源： Chromatographia Vol.24,1987,p.360-362 P.A.Biondi F.Manca A.Negri C.Lucarelli 摘要： 首先用丹酰化衍生血浆中的氨基乙磺酸，再利用高效液相色谱荧光检测来测定。衍生化后以四丁基铵为抗衡离子，从混合物物中提取。进而研究不同的四丁基铵浓度和混合物组成对结果的影响。甲基牛磺酸，是作为内标加入血浆样本以保证良好的再现性。这个程序应用于测定来自于不同的哺乳动物样本中的氨基 乙磺酸。 关键词： 氨基乙磺酸；柱液相色谱；血浆；离子对提取法 引言 正如最近的一
2、个证据充分的检查所指出的那样，人们对氨基乙磺酸（ 2-氨基乙磺酸 , 牛磺酸 )的研究兴趣在不断的增加。虽然它的生物作用还没确定，但是在不同器官中存在的牛磺酸与保护细胞的完整性有关。需要通过一个快速而简单的程序来找到对血浆的牛磺酸含量进行常规分析的一个合适的方法。就这一点而言，高效液相色谱法就是一个技术性选择。作为不稳定的邻苯二甲醛衍生物的替代物，我们最近在用 DNSCI 来分析制剂中存在的牛磺酸。这项研究的目的是检测DNS 衍生物对测 定不同样本中的血浆牛磺酸的适用性。我们是在经过净化与参数研究后，再进行高效液相色谱法，可以避免对最终层析图的干扰。 实验 材料 牛磺酸和高乙磺酸 (3-氨基乙
3、磺酸 , o-Tau)是西格玛公司提供； DNS-CI 和HPIC-grade 甲醇是由默克公司提供；四丁胺 (TBA)卤化物 (TBA-F, TBA- CI, TBA-Br, TBA-I) 是由瑞士的 Fluka 公司提供的。 色析法条件 一个日本分光公司的高效液相色谱系统装有一个 GPA40 梯度编程器，微量液相色谱仪 和分别激发和射出的波长分别为 240nm 和 52Onm 的 FP-210 荧光探测仪。层离就在充满液相色谱柱填料并固定在 Manu Fix 支架处的打印机上表2 现出来 。洗涤液混合物在分析过程中呈阶梯式改变 。用比例为 30 比 70 的甲醇与水的溶液，其含有乙酸 (0
4、.6% v/v)，三乙胺 (0.1% v/v) ，在流速为 1ml/min的情况下来洗提牛磺酸 和 o-Tau 的衍生物；在注入 20 秒后，用甲醇洗涤 10 秒，然后再用洗涤液化合物恢复 10 后再次进行注入。 程序 所有的操作都是在用锡箔包裹的有螺旋帽的聚四氟乙烯小瓶中进行，这是是为了防止样本进行光降解。 0.2ml的 血浆加上 1 mM o-Tau 的水溶液，边有力的摇晃边滴入乙腈（ 0.5ml), 离心分离后，往上层的清夜加入的碳酸钠缓冲剂(40raM, pH 9.5, 1 ml)和 DNS-CI 的密度为 2mg/ml 的乙腈 (0.5ml)溶液。这个反应混合物在 40 摄氏度的条件
5、下放置 20 秒，用二氯甲烷（ 3ml）洗涤，再加入含水的 50mM TBA-Cl (1 ml)，再用二氯甲烷（ 3ml）进行萃取。 把这个有机相在无水的钠硫酸盐中过滤，然后在氮流中蒸干。把残渣溶入到高效液相色谱洗涤混合物（ 0.1ml）中，最后用高效液相色谱法进行 分析。 定量分析 将不同体积的含水的 1 mM 牛磺酸溶液 ，其包含 5-100nmoles 和有恒定体积的含水的 1 mM o-Tau 溶液 (20/JI)，按照以上所描述的程序进行处理。通过测绘 DNS-Tau 和 DNS-o-Tau (Rh)的最高值与牛磺酸的数量的比例，得到一个刻度曲线图。通过血浆样本中的 Rh 测试值得出
6、牛磺酸的容量。 复原研究 往包含的相同容量 (50nmoles)的 DNS-Tau 和牛磺酸 ,减少固定容量（ 1.5ml）的乙腈水反应混合物中加入不同浓度 (1-100mM)的 TBA 盐水溶液（ 1ml），并用二氯 甲烷萃取（ 3ml）。向生成的分离有机相中加入固定容量的二氯甲烷水溶液（ 0.1ml），水溶液中包含等量的 DNS-o-Tau 和 o-Tau (25nmoles)。通过蒸发 DNS-o-Tau 二氯甲烷溶液和向残渣内加入还没有提取的反应化合物 DNS-Tau ，将取得的每个样本的 Rh 与所准备的样本中得到的 Rh 相比较。用这样得出的 Rh的比例计算得出复原效益。 结果与讨
7、论 开发其结构基来找到一个适合利用敏感和精确的高效液相色谱测定血液中的化合物的方法。在这种情况下存在牛磺酸，氨基和酸性硫磺基群的小分子。在所描述的程序中 ，第一个与 DSN-CI 反应的化合物产生显色剂产品，因而增加了检测的敏感度；另一方面，第二个发生反应的化合物，在水溶液中带有负电荷，3 与水中的阳离子结合，进而在有机溶剂中提取出来，因此增加了整体的分离性。 按照以前的陈述， DNS-CI 作为一个众所周知的氨基酸试剂，产生了一个稳定的适用于对牛磺酸进行高效液相色谱常规检测的衍生物。 这个分离条件与我们在制剂分析中所用的有略微的不同，在以往中，我们是先进行 DNS 氨基酸衍生物实验的。表一显
8、示的是在三乙胺容量维持在 0.008% v/v的条件下， DNS-Tau 和 DNS-o-Tau 的容量因子，而 DNS-o-Tau 是在 TBA 盐分从 TBA-F 增加到 TBA-I 的条件下萃取的。这有可能取决于一个事实，即从有机相中萃取并存在于注射样本中的 TBA 卤化物，允许洗涤液中较少的疏水性的三乙基胺离子被 TBA 离子部分的分离，这在在一定程度上取决于它的浓度。事实上，有大量的反荷离子时，二氯甲烷中的 TBA 盐溶液的溶解度和它在注入样品中的容量增加。鉴于这种情况 ， DNS-Tau 和 TBA 离子的相互作用就更剧烈。为了独立于最终样本中的 TBA，将洗涤混合物中的三乙胺浓度
9、增加到 0.1%v/v。在这些情况下， 用 TBA 萃取的 DNS-Tau 用 k洗涤。当注入样本中含有不同容量的TBA 时， DNS-Tau 没 有发生多大的变化。实际上，较大数量的三乙胺可以使 TBA 离子和 DNS-Tau 之间的反应达到最小。图 1 说明了两个典型的高效液相色谱剖面图。 图 2反应的是 TBA 反荷离子与 TBA 盐浓度的有机溶剂中 DNS-Tau 的复原依赖性。在高浓度下的可溶于有机溶剂的 TBA-F 和 TBA-CI，不助于将 DNS-Tau高效的从水相中提取出来，这与我们先前对相似混合物进行实验所表现的结果一样。由于两种盐分在复原产量上的差异很细微，所以会选择 吸
10、水性较差和花费较低的 TBA-CI。对水相离子化合物进行离子对提取，是一个可以帮助消除干扰的有效程序。事实上，在这种情况下，两极和非阴离子化合物保留在碱性水相中，而无极化合物在与 TBA-CI 反应之前就被二氯甲烷去除。除分离性之外，对挥发性有机溶液中的 DNS-Tau 的离子对提取增大了这个方法的敏感度，使最后样本集中在一个小的体积中。 DNSTau/DNS-o-Tau (Rh)的峰值比例和经过上述程序提取的牛磺酸的量，在5-100nmoles 的范围内，根据方程式 Rh = 0.0444. nmoles 牛磺酸 + 0.178 (r = 0.995）得出的是线形关系。 可检测到的牛磺酸的最
11、少数量大约是 lnmole。图 3是根据应用这个方法的例4 证来显示了不同的哺乳动物的血浆样本中的牛磺酸的含量。对猫的血浆样本分析五次后得出牛磺酸的容量为 138 -+ 6.7nmole/ml (C.V.: 4.9%)。这说明了用o-Tau 作为内部标准可以确保良好的再现性。 总的来说，上述的程序看上去简单，可靠，因此也适用于临床和营养学研究，因为在此处， 血浆牛磺酸分析是一个需要考虑的重要的生物参数。 图 1 与 DNS-Tau 相关的不同的 TBA 盐分的容量因子的影响 a)在本实验中，用于萃取 DNS-Tau 的 TBA 盐水溶液的浓度为 50mM,与在试验部分所描述的相同 b)本实验所
12、用的洗涤液是（ 25： 75）的甲醇与水的化合物，包含乙酸 (0.6% v/v)和三乙基胺 (0.008% v/v)。 c)未萃取。这次评估与含有 未经萃取的 DNS-Tau 的标准样品有关。 图 2 5 包含有 Tau 和 o-Tau (左 )的衍生物 DNS的标准反应混合物和通过上述的程序从狗的血浆样本中得出的样品的典型的色谱剖析图 。 图 3 在不同的 TBA 盐水溶液中的恢复的 DNS-Tau 百分比浓度的影响 。 a)在离子对提取前添加到反应混合物中的水溶液的浓度，根据实验部分所描述的程序。 b)在这种浓度下， TBA 溶解在水中。 图 4 不同的哺乳动物的血清样本中的牛磺酸含量。
13、6 参考文献 1 C. E. Wright, H. H. Tallan, Y. Y. Lin, G. E. Gaull, Ann. Rev. Biochem. 55,427 (1986). 2 P.A. Biondi, A. Negri, A. loppolo, J. Chromatogr. 369, 431 (1986). 3 Y. Tapuhi, D.E. Schmidt, W.Lindner, B.L. Karger, Anal. Biochem. 115, 123 (1981). 4 P.A. Biondi, N. F. Gu, C. Secchi, Clin. Chim. Acta, 121, 79 (1982). 7 外文翻译原文 Chromatographia Vol.24,1987,p.360-362 8 9
