1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物工程 根霉与米曲霉原生质体一次基因组改组后代酶活力和形态特性变化规律研究 摘 要 本实验是对根霉与米曲霉原生质体一次基因改组的后代进行进一步的研究，经人工培养多代后观察菌株的形态特征、部分生理生化特性分析。实验对亲本米曲霉、根霉、及其融合后的后代进行了传代培养。通过对亲本以及一、三、五、七代在生长时的形态特征进行定量分析，结果表明亲本和其杂交后代在培养基上生长都比较旺盛，菌体形状颜色都比较相似。测定蛋白酶、淀粉霉的活力，淀粉霉活力中亲本根霉的平均 Hc 值是1.527，亲本米曲霉的平均 Hc 值是 1.518，而后代霉活最高的融合一代 3 的平均 Hc
2、值是1.781，最低的融合七代 1 的平均 Hc 值是 1.193。 SDS 电泳分析发现后代的条带大多比亲本少，说明后代与亲本存在一定差异。 关键词： 米曲霉；根霉；原生质体；酶活力； SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ABSTRACT This experiment is Rhizopus oryzae protoplasts with the restructuring of the descendants of a gene for further study, after several generations of artificial culture strains were obse
3、rved morphological, physiological and biochemical characteristics analysis.Experiments on the parent Aspergillus,Rhizopus, and their descendants were fused subculture.By parents,and one, three, five, seven generations in the growth morphology when quantitative analysis shows that parents and their h
4、ybrid offspring are more vigorous growth medium, the cell shape of color are more similar. Determination of protease, amylase, starch mold activity in the parental Rhizopus average Hc value is 1.527, the parent Aspergillus average Hc value is 1.518, while the descendants of mold living the highest i
5、ntegration of generation 3, the average Hc value is 1.781, the lowest fusion seven generations of an average Hc value is 1.193. Finally its SDS gel electrophoresis analysis showed that most bands of future generations less than the parents, offspring and parents that there are some differences. Keyw
6、ords: Oryzae; Rhizopus; Protoplasts; Activity; SDS-polyacrylamide gel electrophoresis I 目 录 1 前言 . 1 1.1 研究的现状 . 1 1.2 实验研究的意义 . 1 2 实验材料、试剂、设备和方法 . 2 2.1 实验材料 . 2 2.2 实验药品和试剂 . 2 2.3 实验仪器设备 . 2 2.4 主要溶液试剂及配制 . 3 2.5 其他实验材料 . 4 2.6 实验方法 . 4 2.6.1 菌种活化 . 4 2.6.2 菌丝体培养 . 4 2.6.3 菌种融合过程 . 4 2.6.4 诱变原生质
7、体 . 5 2.6.5 高产酶菌株的筛选 . 5 2.6.6 传代培养 . 5 2.6.7 形态观察 . 6 2.6.8 酶活测定 . 6 2.6.9 蛋白质提取 . 6 2.6.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及分析 . 6 3 结果与分析 . 7 3.1 高产酶菌株的筛选 . 7 3.2 后代形态分析 . 7 3.2.1 平板培养基观察结果 . 7 3.2.2 显微镜观察结果 . 9 3.2.3 淀粉酶活观察结果 . 10 3.2.4 蛋白酶活观察结果 . 10 3.3 酶活测定结果与分析 . 11 3.3.1 不同菌种的蛋白酶活力测定结果 与分析 . 11 II 3.3.2 不同菌种的淀
8、粉酶活力测定结果与分析 . 14 3.4 SDS 凝胶 电泳 . 17 3.4.1 电泳 扫描图 . 17 3.4.2 蛋白定量分析 . 18 3.4.3 定量检验报告 . 18 3.5 蛋白质带分析 . 22 3.6 泳道中带分布报告 . 22 3.7 列相似性分析 . 28 3.7.1 相似性图表 . 28 3.7.2 亲本及其后代的聚类分析 . 29 4 小结 . 30 参考文献 . 31 1 1 前言 1.1 研究的现状 米曲霉菌是一类重要的工业真菌，因能分泌多种酶类广泛用于食品发酵等行 业，且应用领域仍在不断扩展。为了向米曲霉的安全应用提供更全面的参考信息，并希望从中寻找有药理活性的
9、药物前体，本研究对米曲霉进行了系统的化学成分研究和探索 1。 米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、 生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了 1000 多年。 米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体，米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这
10、将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。米曲霉基因组的破译，也为研究由曲霉属真菌引起的曲霉病提供了线索 2。 米曲霉菌落生长快， 10 天直径达 5 6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、 果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变 3。 除了细菌以外，根霉是迄今为止丝状菌中产 L 乳酸的另一重要菌种。根霉菌是真核生物 ,其核有核膜包围 ,具各种细胞器 .基因结构中编码区不连续有内含子，根霉菌分布广，约 10 种以上。通常对人无害，食用甜酒药及糖化饲
11、料就是选用此菌制备的。根霉菌为条件致病菌。可引起食品霉变，可导致实验室污染。有匍枝根霉、小孢根霉、少根根霉和米根霉等，可引起毛霉菌病，蜂窝组织炎等。 根霉、米曲霉原生质体双亲融合后代第 1-7 代各后代的菌落、菌体形态特征的观察、分析，通过对各后代蛋白酶活力、淀粉 酶活力、糖化酶活力、 SDS 电泳等多种方法测定、分析，同亲本相比较，得出融合后代的形态特征、生理生化特性和稳定性等遗传特性和变化规律。 1.2 实验研究的意义 米曲霉（ Aspergillus oryzae）是酿造业中的重要微生物，对酱油、豆瓣、米酒等的产率和风味起着重要作用。然而生产实践中，米曲霉的生产能力常常欠佳，生长较快的2
12、 菌种往往蛋白酶活力较低，而蛋白酶活力较高的往往生长速度较慢。对米曲霉的选育，尤其是针对蛋白酶活力选育优良的菌种一直以来都是一个重要课题，传统采用的诱变得育种方法费时费力，且随机性太大，不 易得到理想菌种。对两种霉的原生质体融合后代进行进一步的研究，经人工培养多代后进行杂交试验，观察菌株的形态特征、部分生理生化形态分析以及的分析，为得到品种更优秀的，有利遗传更稳定的，作用范围更广的后代作铺垫。于是该课题采用的是原生质体融合的方法得到优良菌种。 2 实验材料、试剂、设备和方法 2.1 实验材料 菌种：米曲霉、根霉、米根融合菌株一代、米根融合菌株三代、米根融合菌株五代、米根融合菌株七代。 2.2
13、实验药品和试剂 表 1 实验药品和试剂 名称 纯度 生产厂家 丙烯酰胺 化学纯 国药集团化学试剂有限 公司 N， N 亚甲基双丙烯酰胺 化学纯 国药集团化学试剂有限公司 琼脂糖 杭州微生物试剂有限公司 甘氨酸 分析纯 上海展云化工有限公司 三羟甲基氨基甲烷 Aladdin chemistry Co.ltd Nanqiao Town，Fengxian District， No.008 QIGANG Road in shanghai 过硫酸铵 天津市福晨化学试剂厂 SDS-PAGE 低分子量标准蛋白 中国科学院上海生物化学研究所监制 冰乙酸 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 甲醇 分析纯 国药集团
14、化学试剂有限公司 2.3 实验仪器设备 表 2 实验仪器设备 仪器名称 生产厂家 稳压稳流电泳仪 DYY 4 型 北京市六一仪器厂 酸度计 PELTA-320 梅特勒 -托利多仪器（上海）有限公司 3 立式自动电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂 超净工作台 SW-CJ-ICV 苏州安泰空气技术有限公司 DK 8D 电热恒温水槽 上海齐欣科学仪器有限公司 DHP 420 电热恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司 PB203-N 型电子精密天平 宁波江南仪器厂 JY98 超声波细胞粉碎机 上海新 芝生物科技研究所 超声波细胞粉碎机隔离箱 上海新芝生物科技研究所 冷冻离心机 Fresco 德国
15、2.4 主要溶液试剂及配制 （ 1）马铃薯葡萄糖培养基（ PDA）：取一定量的马铃薯，洗净、去皮、切块，在电子天平上称取 100g 左右，与 500mL 的蒸馏水一起放入锅中，煮沸 20 分钟，用四层纱布过滤后取浸出液，加入葡萄糖 10g，琼脂 10g，溶解后加蒸馏水至 500mL。 （ 2）液体菌丝培养基：液体马铃薯培养基（ PSA），用于菌丝体摇瓶发酵。配制方法：取一定量的马铃薯，洗净、去皮、切块，在电子天平上称取 100g 左右， 与 500mL的蒸馏水一起放入锅中，煮沸 20 分钟后，用四层纱布过滤。然后取浸出液，加入蔗糖10g，溶解后用蒸馏水定容至 500mL。 （ 3）牛肉膏蛋白胨
16、培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 15g，琼脂 7.5g,淀粉 1g,加蒸馏水定容到 500mL。 （ 4）酪蛋白水解培养基 ： Na2HPO47H20 1.07g， KH2PO4 0.36g，酪蛋白 10g 琼脂粉15g，加蒸馏水定容到 1000mL。 （ 5） 30%丙烯酰胺贮存液：称取丙烯酰胺 29.0g， N， N-亚甲基双丙烯酰胺 1.0g，加蒸馏水至 100mL，装于棕色瓶于 4 冰箱保存 备用。 （ 6） Tris 提取液：称取 12.114 克 Tris，加蒸馏水定溶到 100mL，用 HCl 调节 pH至 7.4。 （ 7） 10十二烷基硫酸钠（ SDS）溶液：称取十二烷基硫酸钠
17、（ SDS） 10 克，加蒸馏水溶解定容至 100 mL。 （ 8） 10过硫酸铵溶液：称取过硫酸铵 0.1 克，加 0.1 mL 蒸馏水溶解。此溶液要现配现用。 （ 9）分离胶缓冲液： 1.5mol/L Tris-HCl， pH 为 8.8。 （ 10）浓缩胶缓冲液： 0.5mol/L Tris-HCl， pH 为 6.8。 （ 11） SDS-电极缓冲液： 0.025mol/L Tris， 0.192mol/L 甘氨酸， 0.1 SDS， pH8.3。 4 （ 12）分离胶：蒸馏水 16 mL， 30%丙烯酰胺 13.2 mL， 1.5mol/L Tris-HCl（ pH8.8） 10 m
18、L， 10十二烷基硫酸钠（ SDS）溶液 0.4 mL， 10过硫酸铵溶液 0.4 mL， TEMED 0.016 mL。迅速混匀倒入两玻璃板之间（大约离梳子的齿长再加 5cm处）。再在胶液上小心注入一层水，让其凝固 20 30 分钟 4。 （ 13）浓缩胶：蒸馏水 6.8mL， 30%丙烯酰胺 1.66mL， 1mol/L Tris-HCl（ pH6.8） 1.26mL，10十二烷基硫酸钠（ SDS）溶液 0.1mL， 10过硫酸铵溶液 0.1mL， TEMED0.01mL。迅速混匀倒在制备好的分离胶上，并插入梳子，上层用喷雾器覆盖一水层，聚合 30min5。 （ 14）样品处理液： 50m
19、M Tris-HCl（ pH6.8）， 100mM DTT， 2 SDS， 0.1溴酚蓝， 10甘油。 （ 15）染色液： 0.1考马斯亮蓝 R250， 40甲醇， 10冰醋酸。 （ 16）脱色液： 10甲醇， 10冰醋酸。 （ 17）卢戈氏 (Lugol)碘液：碘片 1g，碘化钾 2g，蒸馏水 300mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，混匀，定容。 2.5 其他实验材料 量筒、玻璃棒、烧杯、移液管、移液枪、枪头、离心管、蒸馏水、一次性手套、 TEMED、Molecular Imager GS-800 Calibrated Densitometer、 Quantity
20、one 电泳分析软件等。 2.6 实验方法 2.6.1 菌种活化 将预先保留下来的两种菌种（亲本米曲霉和亲本根霉）在无菌室的超净工作台上分别接种到马铃薯葡萄糖培养基上，接种完成后倒置放于 23 恒温培养箱中 培养 2 3 天。 2.6.2 菌丝体培养 于无菌室的无菌环境下，将液体培养基分装入灭过菌的培养瓶中并标号。将活化好的菌株接种入已经灭过菌的盛有约 30mL 液体菌丝培养基的摇瓶中（菌丝大小不限，只要用接种针在培养基表面菌落处轻轻蘸取一下即可，每次接种后接种针均要在酒精灯火焰中灭菌并冷却才可挑取下一个菌丝）。之后放入 30 ，转速为 120rad/min 的摇床内培养 16-18h。 2.
21、6.3 菌种融合过程 原生质体制备 ： 将培养好的菌丝体培养液用四层擦镜纸过滤，根据离心管大小装入一定量的菌丝体到已灭菌的离心管中，以 1400 转每分钟的低转速离心 10min。之后去除上清液。然后将沉淀移入另一个已经称量过的灭过菌的离心管内，封好进行称量（菌丝的移动和菌丝的接种，还有上清液的去除等等材料有机会接触外界环境的情况下，这些操5 作都要在无菌的条件进行）。 酶解液的体积按照以下方法来换算：菌丝重量的 1.5 倍就是酶解液的量，酶解液为混合酶液，蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶以一定的浓度混合，用渗透压稳定剂配制而成。酶液的配置要当天配当天用。一是为了防止酶的失活，二是防止对量的估计不足而
22、造成浪费。酶液的配置要在无菌条件下配置防止有杂菌的进入，最后影响试 验的结果。加入混合酶液后将菌丝和酶液充分混匀，放入适当的温度、转速为 100rad/min 的摇床中酶解一定的时间（每分钟 40100 转的震荡不仅可以加快原生质体的释放 ,使达到最大的原生质体形成率的时间缩短 ,有利于提高再生率 ,而且可以抑制孢子的萌发 ,有利于原生质体的形成）。 酶解完成之后将混合液用四层擦镜纸（已紫外灭菌）过滤，接着将滤液装入 EP 管（已灭菌）以 6000 转每分钟的转速离心 20min（由于原生质体小而轻所以一定要高转速才能让原生质体沉淀下来）。之后取少许上清液在显微镜下进行观察，如没有原生质体说明
23、原生 质体已经完全沉淀了。此时可以将上清液去除（即将酶液去除，酶液的去除要尽快，否则会使酶解过程过度，从而造成原生质体的破裂，影响原生质体的形成），然后用渗透压稳定剂悬浮原生质体。以上步骤都要在无菌的条件下进行，防止杂菌的进入，造成污染影响试验结果。 2.6.4 诱变原生质体 紫外照射法诱变原生质体获得后代 6： 用 15 W国产紫外线灯管 ,照射距离 30cm，各取 5mL原生质体悬浮液悬浮，于无菌平皿中分别进行 1、 3、 5、 7min 的照射诱变处理，分析致死率，取未诱变和致死率在 80%以上的诱变时间的原生质体涂布到再生平 板上，在 2628 ，避光培养 2 3 天。 2.6.5 高产酶菌株的筛选 分别将未诱变和诱变后的再生培养基平板长出的菌落接种到液体发酵种子培养基中， 30 摄氏度培养 36h 后，按 5 %接种量接入液体发酵培养基中， 30 摄氏度130r/min 摇床培养 3-4d，分别测定蛋白酶活力，淀粉酶活力，重复 3 次，选取酶活力有提高的菌株。 2.6.6 传代培养 将融合后的菌种接种到马铃薯固体培养基上，浇制 3 个，即第二代。 30 恒温培养箱培养一天后取一点接种第 3 代，并在另一点盖一盖玻片，再培养一天，用于观察形态特 征，最后一点接种到斜面培养基上保存菌种。按这个步骤接种到第七代。
