1、 1 本科毕业论文外文翻译 译文： 体细胞杂交 “二代 ”的产生和特性来源于 Solanum Tuberosum L体细胞 单倍体和二单倍体种间的原生质体融合 来源： Amer J of Potato Res(2000) 77:149-159 Veli-Matti Rokka,jari P.T.Valkonen,Airi Tauriainen,Leena Pietala,Renata Lebecka,Ewa Zimnoch-Guzowska,and Eija Pehu 摘要 ： 被融合的原物产生体细胞杂种是以 种类间 的 Solanum brevidens Phil和 S. tuberosum
2、.L三倍体 （ 2n=3x=32-34） 和另一个双单倍体 （ 2n=2x=24） S. tuberosum cv. Van Gogh之间的原生质体融合。 参与研究的共 265种植物的再生由原生质体融合导出的愈伤组织和杂种性通过使用特定的融合伙伴等基因系进行 RAPD标记来被验证。非整倍性五倍体 （ 2n = 5x= 51-65） 的二代杂种 ，它的 2C DNA容量排列从 3.36到 4.43pg，相当于应每个融合亲本的总和 （ somatohaploid： 2.22pg；双单倍体 Van Gogh： 1.87 pg） 。大部分的二代体细胞杂种是旺盛的 ， 但在形态上有变量。他们还是非常耐
3、PLRV并且他们还来耐受 PVY感染来源于单倍体融合。即使大多数的第二代杂交的块茎在形态学是多变的但大多数是很烂的形状。在欧文氏菌软腐病抗性试验中 ,块茎显示四倍体 S. tuberosum，双单倍体 S. tuberosum融合双亲比 S.brevidens与 S. tuberosum杂交的六倍体杂种抵抗性高。所有 “ 第二代 ” 体细胞杂种雄性不育不能产生浆果和种子。 关键词 ： 欧文氏菌抗性；流式细胞计数；土豆； RAPD；病毒 抗性 介绍 马铃薯种植 几乎在世界上所有的温带区域 ， 在食品生产中排名第四（ Hawkes， 1990年 ） 。在这大约 230种已知的马铃薯种类中，有七种耕
4、作种类 ，包括二倍体 （ 2n = 2x = 24）， 三倍体 （ 2n = 3x= 36） ,四倍体 （ 2n = 4x = 48） 和五倍体 （ 2n = 5x= 60） 物种 （ Hawkes， 1990） 。 也有许多野生土豆显示有价值的特征，如抗非生物或生物的压力 （ Hawkes， 1990）， 这对于马铃薯生产改进将是非常重要的。不幸的是 ， 几个 S.brevidens种类并不与 S. tuberosum相匹配，因为他们的差异在于胚乳数目的平衡 （ EBN）（ Johnston等， 1980年 ； Johnston 和Hanneman， 1982年 ） 。另外一个可选的方法是将
5、 S. tuberosum和 S. brevidens通过原生质体融合。其中一个野生物种的潜能是作为 Solanum brevidens Phil的病原体2 抗性。 对称体细胞杂交或不对称在野生二倍体杂交和马铃薯块茎栽培种之间获得有潜力的育种价值 ， 由于其抵抗病毒和细菌性疾病。然而 ， 在体细胞杂交和耕种的马铃薯之间进行回交并不总是容易获得 （ Ehlenfeldt 和 Helgeson， 1987年 ；Jacobsen等 ， 1993年 ； Jacobsen等 ， 1994年 ） 。 回交作为一种新颖的策略最近被提出， 即 S. tuberosum和 S. brevidens分别与with
6、 S. tuberosum杂交 （ Rokka等， 1995年 ； Rokka， 1997年 ） 。用这种方法 , somatohaploid都是由另一个种间体细胞杂交栽培产生的。然后体细胞单倍体可以用马铃薯块茎原生质体中的双单倍体组来杂交变形。使用这个方案 ,编入令人满意的性状从野生马铃薯物种和可栽培的马铃薯基因库的方法 可能比通过有性的回交更有效率。这是因为体细胞间杂交生育力低 下。 其次，在回交方面减少有价值的特质是经常发生且常出现缺乏同源染色体配对。我们报告了成功的成果关于杂交航线从六倍体体细胞种间杂交从遗传学角度利用花药培养和解释单倍体育种 。 单倍体育种也极耐马铃薯卷叶病毒 （ P
7、LRV） 。 不幸的是 ， 他们的块茎不类似于体细胞杂交的亲本 （ Rokka等， 1994年 ） 。在目前的研究中 ， 原生质体融合是如何进行的在三倍体和双单倍体马铃薯块茎育种之间。参与研究的共 265种 “ 第二代 ” 体细胞杂种取得了他们具有调征性的遗传组成 ， 植物形态学，块茎 性状和抗病能力。 材料和方法 l strategy was recently suggested to “backcross“ T 植物材料和原生质体融合 ： 原生质体融合是为单倍体育种线做准备来自先前描述的 S. brevidens CPC2451克隆和双单倍体马铃薯块茎栽培育种方式。这两种马铃薯线条的原生质
8、体被栽培在试管内以隔离和实现预先描述 （ Rokkaet等 ，1994年 ） 。叶片材料是一种消化酶解液被 Carlberg等人 （ 1983年 ） 描述，除了 0.45M甘露醇是用来代替 0.4M蔗糖之外。叶圆片经单倍体育种 被消化的 1%（ w / v） 纤维素酶和 0.1%（ w / v） 离析酶和叶圆片经双二倍体 Van Gogh育种与 1.5%（ w / v）纤维素酶和 0.15%（ w / v） 离析酶。分离的原生质体以 1:1混合溶液 ， 混合后的使用电融合而后沿着拟定的方案栽培 。 融合后的原生质体栽培在三个不同的原生质体栽培媒介中（表 1），含有 V-KM基础的成分原生质体培
9、养 （ Bokelmann和 Roest，1983年 ） 基含琼脂糖。促进生长调节的媒介含： V-KM I的中间物含 1 mg 1-1 of NAA 和 0.4 mg 1-1 of BA， V-KM II 包含 0.2 rag 1-1 of 2,4-D， 0.5 mg 1-1玉米素和 1 mg 1-1 ofNAA ，以及 V-KM HI 含有 0.1 mg 1 -1 of NAA 和 0.5 mg 1-1玉米3 素 （ Puite等人 ， 1986年 ） 。 通过预定方案栽培嫩枝使组织更新获得愈伤组织 （ Rokka等， 1994年 ） 。 融合物杂种性的鉴定： 提取在体外生长再生植物树叶和它
10、们亲本性状的DNA，单倍体育种 0507.1.2.1.和双单倍体 Van Gogh11.dh.11.2.1。 通过 PAPD分析鉴定预定方案使杂交得意 实现，用两种不同的随机引物 ， 制造了一个放大双亲性状中特殊的一种结果。引物 OPB-08（ 5GTC CAC ACG G3的 ） 从单倍体育种方式产生了一种产物特性 ， 然而引物 OPK-08（ 5 GAA CAC TGG G3） 产生一种特定于双二倍体性状 Van Gogh（ 图， 1） 。实现 PCR扩增进行研究 PTC-100 PCR 温度循环器用了 35个周期的 30 s 以 95C， 30 s以 35C和 1min 10 s以 72
11、c， DNA变性的步骤在 3 min 30 s以 95 C。 图 1 通过 RAPD标记鉴定 11.dh.11.2.1. of Solanum tuberosum cv. Van Gogh与 单倍体0507.1.2.1.S. brevidens and S.tuberosum 杂交的再生杂种 引物 OPB-08（ 1-10） 引物 OKP-08（ 11-20） 染色体数量和 DNA水平 （ 流动细胞 ） ： 把嫩枝体外培养生长中的根尖细胞4 的染色体计算在内 （ Rokka等 ， 1995年 ） 。 使用流式细胞分析仪细胞核分离体外生长的核 DNA含量 （ 2C值 ） 进行了分析。鸡血红细胞
12、（ CRBC） 添加了一个内部DNA作为标准 （ 2C值 = 2.33 pg； Galbralth 等， 1983年 ） 。 植物形态和块茎产量： 温室种植培养植物的形态关于叶、茎、花、雄性生育能力被记录描述。 1996年夏，将二代体细胞杂种生长在 15厘米直径的塑料罐内，记录块茎形态和产量为 97。一些二代体细胞杂种依旧生长在田间。 抗病毒性： 作为此前的一项研究 （ Valkonen 等， 1994年 ） ，植物嫁接灌输同一分离出的马铃薯叶卷病毒 （ PLRV） 和马铃薯病毒 Y（ PVY -UK）。 DAS-ELISA使用从宝灵曼公司 （ Mannheim， Germany） 获得的多克
13、隆抗体 （ Valkonen 等 ，1994年 ） 使病毒检测的方法得以实现。通过 2个实验分别对 1和 3植物的每个土豆基因型进行测试。取样酶联反应吸附测定 28天后的充分扩张的叶子。估计样本中病毒测定量与连续稀释从 cv. Pito传染 PVY 或者 PLRV提取的树液相比。 欧文氏菌软腐病抵抗力： 马铃薯块茎栽培的四个标准 （ Glada， Grot， Irys，Sokol）， 一号六倍体体细胞在 S.tuberosumS.PI 203900 和 S.brev/dens PI 218228 杂交。细菌被生长在封闭的肉汤培养基里， Miller （ Sigma， L1900年 ； Vayd
14、a等 ，1992年 ） 。以 25c孵化 24小时后，细菌以无菌水清洗和调整浓度。块茎无机械损伤和结节病的症状 ， 需要用水洗使条件在 18 20 C下 24小时 ， 喷洒 70%（ v / v）酒精和干燥。刺空 每个块茎中央部分加无菌聚丙烯 （ 200L）， 然后接种 细菌（ Zimnoch， Guzowska 等， 1996年 ） 。每个块茎用移液管点接种两种聚丙烯含50微升细菌悬浮液。关键是将块茎压缩成深度达 8 10毫米保持在原处在一个黑暗的 27 C和 95%的相对湿度雾室 72小时。孵化之后块茎通过切成薄片接种在腐烂的组织，对接种点和广度进行测量。 对块茎重复接种 3次实验， 10
15、、 12和 14星期后分别在温室收获。 在每一个测验中 ， 3 5块茎的每个基因型被遗传接种。第二代的体细胞杂种仅够块茎做一次测试。 结果 原生质体再生和菌种鉴 定 ： 原生质体融合的 05071.2.1. 三倍体单倍体杂交和双单倍体 S. tuberosum Van Gogh ll.dh.ll.2.1.是通过三种不同媒介栽培。 愈伤组织诱导利用媒介 V-KM I和 V-KM 比使用中间的 V-KM 更好（表 1）。原生质体栽培使用中间的 V-KM II 比中间的 V-KM I极板效率更高和再生速度更快（表 1）。没有媒介 V-KM III的愈伤组织能使嫩枝再生（表 1）。一共有 165和 1
16、00枝条组织5 分别从最初的愈伤组织通过媒介 V-KM II和 V-KM I得以再生。平均每个愈伤组织再生 4到 5个嫩枝。所有再生嫩枝显示核杂种性在单倍体育种和双单倍体块茎栽培育种融合物已被证实通过 RAPD标记双亲性状 （ 图 1） 。 表 1 以三种不同的媒介原生质体栽培愈伤组织和再生嫩枝的成果 染色体数量和 DNA水平 ： “ 第二代 ”体细胞杂种五倍体 （ 2n=5x） 是通过三倍体 somatohaploid（ 2n=3x） 和双单倍体 （ 2n=2x） S. tuberosum融合产生的。然而 ， 只有一些 “ 第二代 ” 体细胞杂种染色体数目是预期的 5658条 ， 这是山姆染
17、色体以单倍体融合物 （ 3234条染色体 ） 和二单倍体马铃薯块茎融合物 （ 24条染色 体 ）（ 表 2） 。几个杂种染色体数量有较低的 （ 51-56条 ） 或更高 （ 高于 58条 ） ，已经超过预期。许多第二体细胞杂种的染色体数量是内在可变因素，也就是同一植株体细胞在有丝分裂过程中也有不同的染色体数 （ 表 2） 。 二代体细胞杂种的核 DNA总量 （ 2C值 ） 在 4.43pg和 33.6 pg之间 （ 图 2） 。染色体数和 2C值之间并不完全相关 （ 见表 2）， 但例如二代体细胞杂种 27010113拥有最低的染色体数 （ 51） 同时也具有最低的 DNA含量 （ 2C =
18、33.6 pg）（ 表 2） 。杂种品种 27010609具有最高的染色体数目 （ 6465条 ） 同时也有最高的 DNA含量 （ 2C = 4.43pg） 。从混数性方面 ,通过流式细胞计数发现在两个杂交品（ 2701-0503） 和 （ 2701 -1713） 的叶内细胞核 ， 通过染色体计数不能发现根尖细胞，同时所有细胞含有相同的染色体数。在另一方面 ,通过染色体计数并没有发现一杂种产品 （ 2701-0116） 其对叶片细胞核 DNA含量进行评价（表 2）。 6 图 2 流式细胞计数原生质体融合双亲 （ somatohaploid和 dihaploid S. tuberosum)的核
19、（ 2a和2b） 以及他们的二体杂种 :（ 2c） 五倍体杂种 ， （ 2d） 混倍体杂种。鸡红细胞 （ CRBC） 作为一种内在的标准。 二代体细胞杂种的形态： 对 97个二代杂种中的 5个进行分析，他们的综合活力被认为是虚弱的，然而其余的是正常的。 双单倍体 Van Gogh融合物有淡绿色叶子，单倍体融合物有中度绿色叶子，二代体细胞杂种具有任何一种淡绿，中度，深绿色或者蓝绿色的叶子（图 3）。双单倍体 Van Gogh在茎上有色素沉着过的痕迹 ,然而单倍体融合物全部覆盖着色。 二代杂种的色素沉淀具有内在因素包括天然颜色，全部着色的深浅。双单倍体 Van Gogh是白色花冠，单倍体是浅紫色花
20、7 冠，然而二代杂种是浅紫色花冠或花冠上存在微量紫色（图 4）。分析 “ 第二代 ”体细胞杂种是雄性不育也可能是女性不育 ， 因为使四倍体土豆栽培种授粉杂交或自交授粉他们没有发现果实。 表 2 二代杂种流式细胞计数 DNA含量分析和染色体计数 把 97个二代杂种在温室里进行无性栽培结果 18（ 19%）产生块茎 ， 然而栽培在室外的有 51（ 53）长出块茎。块茎的形状在克隆中有很多变量因素，一些克隆会出现长的，弯曲的块茎，但 是有少数克隆与双单倍体土豆形状近似（图 5）。然而 ， 在田间条件下 ， 块茎形成能力较差。大多数克隆中没有块茎 ， 而他们中的一些产生畸形的块茎在储存期变干。 8 图
21、 3 温室种植株形态 ： dihaploid S.tuberosum 融合物 （ 左 ）， 二代杂种 （ 中 ）， somatohaploid融合物 （ 右 ） 图 4 二代杂种花瓣特征 9 图 5 五种二代杂种复制品的块茎形状 抗病毒能力： 对马铃薯卷叶病毒滴定发现在 Van Gogh 简述中比 Pito中的低，但是对于双单倍体的马铃薯卷叶病毒含量测定来自于 Van Gogh比 Pito中的高。感染马铃薯卷叶病毒在叶片上部所有的基因型表现为泛黄。与之形成对比的是 ， 单倍 体性状成熟没有任何症状和低含量的马铃薯卷叶病毒近似与双单倍体参考于 Pito。 二代杂种对马铃薯卷叶病毒的抵抗能力近似与
22、单倍体性状。 他们含有少量的马铃薯卷叶病毒没有表现出症状（表 3）。 表明对感染马铃薯卷叶病毒的耐受性可以表示没有症状，对抵抗马铃薯卷叶病毒可以表示成只有低含量的物质。 这些特性是从单倍体融合物成功的遗传到了二代杂种。 在 Pito and Van Gogh简述中 四倍体马铃薯和他们的双单倍体在接种 PVY 和少量 PVY 在他们叶子顶部四周后，通过酶联免疫吸附测定发现他们都有严重的症状。相比之下单倍体融合 物仅有少量 PVY，成熟没有症状。 “ 第二代 ” 体细胞杂种没有症状 ， 这相似于单倍体融合物。 因此对 PVY的耐受性从单倍体融合物转移到二代杂种中。 二代杂种 PVY的浓度测定高于单
23、倍体融合物但低于双二倍体Van Gogh融合物（表 3）。 这些数据表明：在单倍体融合物中含有很少的 PVY，其对 PVY具有抗性，但只有部分抗性基因转移到二代杂种。 10 表 3 酶联免疫吸附测定嫁接卷叶病毒（ PLRV） 和病毒 Y（ PRY）植株的吸光度平均值（及标准误差） 欧文氏菌软腐抗性测试： 体细胞杂种拥有比标准栽培土豆和双单倍体 S. tuberosum更高的抗软腐病块茎归因于 Erwinia carotova ssp. Atroseptica。 马铃薯的抗性是相对的，在 Grot和 Glada简述中他们的抵抗力比体细胞杂交在 S. tuberosum. P. Dell和 S. brev/dens之间以及二代杂种更低劣。 s .tuberosum PI203900与 s . brev/dens# 249杂交在早些时候发现对软腐病有抵抗作用 （ Austin等 ， 1988；Zimnoch， Guzowska 和 Lojkowska， 1993年 ） ， S.tuberosum P. Den和单倍体 S. brevidens有相同的软腐抗性。 在二代杂种品种 2701-0105和 2701-0107中发现了最强抗病性。因为测试不能被重复由于这些杂种没有块茎，结果应当被作为初步的。（表 4）
