1、细胞微生物学研究方法,前言,人们仅确知一小部分细菌可导致人类疾病。这些细菌一般可分为两类：致病菌和条件致病菌。医疗手段不断提高，抗生素的研制也在不断发展，但由各种病原体所导致的疾病仍有很高的发病率和致死率 。越来越多耐药性病原体的出现可能使我们很快进入一个“后抗生素期” 。更好地理解病原体的毒力机制和疾病中病原宿主相互作用可为治疗疾病确立新的靶。我们应该发展更多的新的分子生物学技术来研究细菌的各个组分，确定细菌的毒力因子。,Kochs Postulates,1890年, Koch: 要想确定一种疾病是由于某种微生物的感染所引起，必须满足4项条件：一、每一例病人体内都可以分离到该病菌。二、该病菌
2、可以在体外培养数代。三、培养了数代的细菌可以使实验动物引发同样的疾病。四、被接种的动物中可以分离到同样的病菌。,Molecular Kochs postulates,基因可以在有确定毒力表型的菌株中发现；基因突变后表型丧失；再导入该基因将在突变株中重建该表型。,Stanley Falkow. Molecular Kochs postulates applied to microbial pathogenicity. Rev Infect Dis. 1988. 10 S2:S274-6,常用的体外微生物实验技术常用的体内微生物实验技术,DNA 突变重组差异表达研究技术Microarray 基因芯
3、片,常用的体外微生物实验技术,突变分析,突变(Mutation)：细菌的基因结构发生偶然的改变。 细菌的自然突变率与其生物的自然突变相同，每106108次细胞分裂发生一次。细菌每2030分钟分裂一代，故突变株相对较多。 细菌中点突变较多见。当突变发生在DNA一对或少数几对碱基引起改变时，称为点突变。,突变分析,1. 定向突变 （directed mutation） 是用于评价特异细菌基因产物毒力分布的最广泛技术。在一种称为“反向遗传学”的技术中，编码假定毒力因子的基因被插入灭活或基因替代所破坏，然后比较同源突变株与亲代株的毒力。这一技术需要将DNA介导入病原体内，还需要合适的选择性标记以及同源
4、重组的天然能力。,在定向突变中，抗生素耐受标记或其他选择性标记连于靶基因克隆复制物的编码序列内，这就破坏了基因的正常转录和翻译，并为选择重组子提供了标记。接着，重组子被介导入靶病原体，并与细菌染色体的同源区进行重组。如果耐受标记两侧是染色体特异序列，就会发生双重交叉（double crossover），标记基因整合入染色体序列，而载体序列不整合 。,定向突变,蔗糖敏感标记在H.pylori vacA基因中导入突变的方法,PCR：H.pylori flaA启动子区、无启动子的sacB基因， 卡那霉素耐受基因（kan）,构建kan-sacB cassette,插入pEK，得到pEnKSF,1.95
5、kb的vacA基因（EcoR-Kpn）克隆入pBluescript KS载体，构建pEK,与细菌染色体的同源区进行双交换重组,突变的VacA菌株,定向突变,随机突变,传统的方法使用UV或化学试剂在细菌基因组内造成核苷酸的改变，导致基因表达的变化 。缺点：没有合适的方法来筛选减毒株和突变的基因细菌转座子(transposon)转座子是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位，常通过产生插入突变影响基因的调控与表达，导致细菌生物学性状或毒力等的改变。转座子诱变技术已被广泛用于细菌分子遗传学研究，包括3个步骤：将转座子插入靶基因；筛选感兴趣的突变体，并证实该突变是由转座子插入引起的；确定并克隆
6、靶基因。 优点：不需要鉴定待测基因的产物，只要转座基因插入可引起表型发生变化的基因均可用此法分离鉴定。,二、差异表达研究,分离微生物差异表达基因mRNA 差异显示技术差减杂交和抑制差减杂交cDNA代表性差异分析基因鉴定集成法,二、差异表达研究,1. mRNA 差异显示技术DD-PCR mRNA differential display reverse transcription PCR 是建立在基因差别表达的基础上，通过比较不同的个体之间mRNA的差异，应用反转录PCR技术而发展起来的一种分离未知基因的方法。 缺点：重复性差、假阳性高、差异片段短小等。,2、差减杂交和抑制差减杂交,差减杂交(s
7、ubtractive hybridization，SH） Straus等于1990年首次用于微生物研究：野生株酵母与变异株酵母进行消减杂交。抑制差减杂交 （suppression subtractive hybridization, SSH） 1996年Diatchenko在SH基础上进一步改善。,差减杂交的原理：,提取待比较的两种基因组DNA,待于寻找差异DNA的称为实验株（tester）,另一方作参考，称为驱动株（driver）,在杂交前连接接头和tester DNA，并用生物素标记driver DNA 。,保证tester DNA序列较短,杂交,杂交后，含有driver DNA的杂合子可
8、通过链亲和素的吸附作用而移去,接头序列为引物，用PCR扩增剩余的序列，也就是仅存在于tester DNA中的序列,重复一次,将PCR序列克隆入载体中，产生差减文库,抑制差减杂交技术（SSH）,将tester DNA分为两部分，各自在5端接上不同的接头,driver DNA杂交的序列应均被清除，只留下tester 特异的单链序列,用与接头序列结合的引物进行PCR扩增 * 抑制效应：两端含有相同接头的序列由于形成二级结构阻止了引物的退火，只有两端含有不同接头的e分子得以扩增。,单链 tester DNA,双链tester DNA,tester DNA和driver DNA形成的异源双链分子,dri
9、ver DNA单链及自身退火的双链分子,第二轮杂交。将两份杂交产物混合并进行第二次杂交，产生第5种新的双链分子e，它的两个5端连有两个不同的接头，两条链均为tester DNA特异链,将PCR序列克隆入载体中，产生差减文库,SH在微生物研究中的应用,检测毒力岛，寻找毒力有关基因。检测不同菌株表达的不同；同一株菌在不同条件下表达的不同。 检测有毒株与无毒株的基因差异，研究毒力的改变如黏附性、侵袭性。2000年用SH方法检测有毒株TB和无毒株TB表达的不同，或高表达的基因。发现了devR和devS与毒力有关。 B组链球菌主要分为III-1,2,3株，其中III-3最易感染新生儿，说明毒力最强，用S
10、H将它与III2、1进行杂交，发现9个短特异序列，可能与毒力有关。,SH技术的缺陷,表达量很低的差异mRNA也很难被扩增。所以一些量少的基因不作为SH的检测对象，如转录因子，细胞因子，受体等。要检测出表达量的不同要高于5倍才行。一些重要的差异基因可能会漏过。SH主要检测在G+C丰富的菌中G+C含量低的区域。SH无法将两个菌的不同基因都测出，得到的产物不全是差异基因。要考虑用其他技术补充。,3、cDNA代表性差异分析 cDNA RDAcDNA Representation difference analysis,综合了差减杂交和差别显示两项技术的优点，并充分利用PCR反应的特性，达到特异性扩增目
11、的基因的目的。 原理：每次对两个cDNA 代表群进行差减杂交前都更换特定的接头和引物,利用PCR以指数形式扩增双链模板（带有特定接头的tester DNA），而仅以线性形式扩增单链模板这一特性，从而使得只有差异表达的基因片段得到高度富集。,cDNA RDA,4、基因鉴定集成法( IPGI) cDNA Representation difference analysis,是对以往各种相关技术的一种有效的综合。在目前表达序列标签( Expressed Sequence Tags , ESTs) 计划发展的基础上，总结了现有的各种基因差别表达分析技术的优缺点，将 DD-PCR、SSH、SAGE和基因
12、数据库技术进行了有机结合。 特点：tester有两种不同的接头，在差减杂交中只有代表稀有拷贝基因且两端带不同接头的cDNA 片段才能以指数扩增，使得目的序列得以高度富集；只回收3 cDNA，从而最大限度地利用ESTs数据库。,三、基因芯片,基因芯片是指通过微加工技术将大量的DNA以预先设计的排列方式有序地固定在载体表面，形成储存有大量信息的DNA阵列。检测时，首先用不同条件下培养的细菌的RNA为模板，以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物反转录合成cDNA。再用所得cDNA与DNA芯片进行杂交，然后通过计算机对结果进行判读和处理，这样就可以找到条件变化时基因表达的情况。,基因芯片应用,微生物
13、比较基因组学研究微生物基因表达谱研究微生物检测鉴定研究,Microarray 特点,规模化检测PCR基础的microarray 不能检测到点突变和嵌合基因存在一定假阳性率和假阴性率，需用其他方式验证,问号钩体基因组DNA芯片的组成,钩体赖株在GenBank中共注释了4727个基因，钩体DNA芯片上共包含了3528个ORFs，每个ORF在芯片上有三个重复。每张芯片还包含了相应的阳性对照点（钩端螺旋体代谢相关基因）及阴性对照点（棉花和人的基因）。,STMIVETDFIIVEATGAMBIT,常用的体内微生物实验技术,体内诱导基因 in vivo-induced gen，ivi gene,仅在微生物
14、进入宿主体内后才被诱导表达在体外生长时不表达的独特基因。往往能增强其在宿主体内的生存能力，致病性甚至决定着细菌毒力强弱，极有可能是病原菌在宿主体内生长、繁殖及致病的关键基因，也是潜在的抗生素作用靶点、诊断抗原以及疫苗候选者，具有重要的研究价值。随着分子生物学技术及分子遗传学研究手段的发展，依赖动物模型的IVET、DFI、STM 以及不依赖感染动物模型的IVIAT 等研究方法的发明及成功运用使得针对微生物 ivi gene 的研究成为可能。,是一种基于转座子的突变技术。是由Holden 及其同事于1995 年在研究伤寒鼠沙门氏菌时建立起来的，用来鉴定能使病原体在宿主体内成功存活和繁殖的决定性基因
15、。在病原体的基因组中随机插入特异性信号标签，与病原体致病有关的毒力基因中由于插入转座子而失活，无法在宿主体内生存、繁殖。通过突变体库感染宿主，然后对未存活的突变体进行负筛选就可筛选出毒力基因失活的突变体菌株。,信号标签诱变（STM） Signature-tagged mutagenesis,STM技术tags的构建：可变区40bp，由4个碱基随机排列而成，理论上可形成1012种不同DNA片段。,STM 的特点,通过联合转座子插入诱变技术和体内负筛选原则使筛选策略由原来针对单个突变株的逐一鉴定转变为针对复杂突变体群的系统筛选，筛选过程更为快捷与系统；特异性DNA 序列对突变体的逐一标记也能轻易地
16、鉴定出被突变的基因，将工作量和实验动物用量降到最低。,STM 的局限性,一是插入性诱变实验存在的共同局限性，如插入事件存在随机性，使得某些较小基因片段(400 bps)的插入性转座诱变较难实现；某些基因区域本身为体内转座或重组的热区或冷区也影响着转座诱变作用的成功率；需要建立能方便地从其感染器官组织中回收尚且存活的细菌突变株的合适动物模型等。 另一方面的局限性则为STM 技术所特有，包括：标签信号衰减的影响；众多突变体株同时收集并实验可能导致其中某些单一信号的削弱，从而影响结果可靠性；另外，由于多个突变株同时存在并共同作用，突变株之间的缺陷代偿可能导致某些突变基因不能被筛选与鉴定，出现假阴性结
17、果等。,体内表达技术In vivo expression technology，IVET,利用病原基因组随机片段与缺乏启动子的报告基因构建融合载体（启动子诱捕文库），在动物体内重组到细菌基因组中而使报告基因表达，筛选病原菌感染过程中表达基因的方法。 采用常规的分子生物学技术即能进行筛选，不需要昂贵的仪器设备，优势明显；不需要对目标病原菌的基因组特性进行深入详细的认识即可对细菌在宿主环境条件下的基因表达情况进行分析研究。,Example: 鼠伤寒沙门菌purA缺陷型模型purA基因作为可选择的报告基因；lacZ基因（编码-半乳糖苷酶）供体外选择。,差异荧光诱导（DFI）,以GFP为报告基因来监测
18、启动子活性。 将GFP 编码基因置于目标病原菌启动子文库的下游，采用荧光激活细胞分选术对包含有启动子-GFP融合活性的菌落与不能表达GFP 的菌落进行分离，通过对体内及体外环境中荧光细胞的连续分离与比较以确定仅在体内环境中存在的细胞及相应的突变基因。,gfp基因 编码一种水母蛋白-绿色荧光蛋白（GFP），在受到蓝光激发后会发出绿色荧光。GFP的一个重要特征是它的荧光信号能通过FACS来检测，这意味着含有与gfp基因融合的启动子库的细菌可自动筛选出活化的启动子，这样成千上万的启动子可在数分钟内被分离。FACS还能分选表达GFP的细菌粘附或内在化的真核细胞，使检测由于和宿主细胞相互作用而激活的细菌
19、基因成为可能。,将荧光激活细胞分选术和基因组学研究进行整合，对微生物基因表达情况进行高通量的半自动筛选，操作简单、迅速、实验重复性高；具有荧光性质稳定，无细胞毒性，不干扰细菌在宿主体内的侵袭、扩散和增值过程，可直接用于活细胞测定等优点。GFP 的运用使研究者能对基因的表达情况及单细胞水平的启动子活性进行客观观察与分析，并可通过简单改变荧光阈值来调节选择敏感性。,DFI的特性,不能检测需要转录后调节的基因；需要构建和分析目标基因突变株以评估靶基因在天然感染中的作用；细菌的聚集与粘附可能影响流式细胞分类与检测分析；研究环境的pH 变化、氧气供给情况以及缺乏信号放大效应等也会影响GFP 的使用；由于
20、荧光为非线性信号，每次实验时都需要对信号的线性范围进行检测和校准以确保准确量化基因的表达情况；采用细胞模型，不适用于动物模型的筛选，因此筛选结果不够全面，不能反映致病菌感染的全部环节。,DFI的缺陷,体内诱导抗原技术 IVIAT （in vivo induced antigen technology）,直接从“蛋白”角度入手筛选毒力基因 Handfield及其合作者于2000年在研究口腔病原菌时设计提出，通过对表达文库进行免疫筛选得到病原菌的体内诱生基因。 作为一种简单有效的筛选技术，IVIAT 已被成功用于多种病原微生物ivi gene 的研究中，如猪链球菌、炭疽杆菌、伤寒沙门氏菌以及白色念
21、珠菌等等。,体内诱导的抗原技术,取感染过所研究病原体的多个病人的血清，用体外生长的该病原细胞将相应抗体全部吸收，只留下仅在体内表达的抗原的相应抗体。,在合适的宿主中建立该抗原DNA的表达库,用吸收后血清探测这些克隆,有反应的克隆即产生自然感染而非体外培养过程中表达的抗原，通过纯化、测序，即可鉴定体内诱导的抗原基因。,将这些抗原纯化，用于证实IVI抗原确由病原体在感染过程中表达。,IVIAT的特点,IVIAT不依赖于动物模型，而是以急性感染患者的恢复期血清为探针筛选病原菌的 ivi gene，应用范围广泛，可真实全面地反映病原菌与人类感染宿主之间的相互作用。 仅使用简单的免疫学和常规基因组克隆技
22、术即可快速及时对病原菌基因组进行系统筛选，不需要对目的病原菌基本遗传学背景进行详细了解，尤其适用于一些新现病原菌的致病性研究。 所需生物学材料极少，仅需采集受染患者的恢复期血清或少量含有病原菌的受染组织或体液成分即可进行，血清库的建立使研究人员可以最大程度获得病原菌不同途径感染和感染不同阶段的抗原。,IVIAT的缺陷,仅适用于可培养病原微生物；具抗体反应依赖性；对于一些不具免疫原性或某些细菌在体内体外生存都必需的毒力基因表达产物不能很好鉴别；不能自动化操作；会受到免疫交叉反应的影响而造成假阳性，因此IVIAT 的阳性菌落需要经过多次重复筛选，还需用阴性感染血清为对照以确保免疫反应的特异性。,4
23、种细菌毒力基因筛选技术方法的比较,体外转座进行基因组分析和作图 GAMBIT Genomic Analysis and Mapping by In Vitro Transposition,鉴定基因组已经被测序的微生物中对于病原菌的生长(体内/体外)是必需的基本基因。,a. Strategy for producing chromosomal mutations by usingin vitrotransposon mutagenesis.,A specific region of the chromosome is amplified by extended- length PCR, and
24、subjected to in vitro transposon mutagenesis. The resultant pool of mutagenized DNA is then transformed into bacteria, which are then grown under selective conditions (e.g. on defined medium or in an animal). PCR is then performed on the post selection pool using a transposon-specific primer and a p
25、rimer to a known location on the chromosome. Subsequent analysis of the PCR products allows determination of which genes in that region of the chromosome are required for survival under those selective conditions.,b. Genetic footprinting for detection of essential genes.,GAMBIT提供了一种有力的手段在那些比体外丰富培养基环
26、境要严格得多的环境下鉴定病原生长或生存的必须基因，目前已经被成功运用于鉴定流感嗜血杆菌、酿酒酵母、肺炎链球菌等病原的基本基因。 GAMBIT虽然是应用在基因组水平的分析，它仍然可以针对某段感兴趣的特别的特定DNA元件或染色体区域进行操作，例如噬菌体和毒力岛等。,GAMBIT的特点,噬菌体展示技术 (phage display techniques,PDT）,噬菌体（Bacteriophage）：是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，部分能引起宿主菌的裂解，具有基因和结构单一性的特点。PDT是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术。它将外源基因插入到
27、噬菌体展示载体的信号肽基因和衣壳蛋白编码基因之间，从而使外源基因编码的多肽或蛋白质与外壳蛋白以融合蛋白质形式展示在噬菌体表面，被展示的外源肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。 探测蛋白空间结构、探索受体与配体之间相互作用结合位点、确定抗原表位、寻找高亲和力和生物活性的配体分子。,PDT原理,主要包括三方面内容：通过 DNA 重组的方法插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，同时保持外源蛋白的天然构象，不影响噬菌体的生活周期，也能被相应的抗体或受体所识别；筛选目的噬菌体，利用固定于固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选
28、出融合噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链 DNA测序推导出来。,PDT,PDT局限性,在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，大大限制了所建库的容量和分子多样性。不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。,
