1、 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 黄姑鱼消化道粘液细胞的组化研究及饥饿对其类型和分布的影响 学 院： 学生姓名： 专 业： 水产养殖学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 1 目录 中文摘要 . 1 英文摘要 . 2 1. 前言 . 3 2 材料与方法 . 4 2.1 实验材料 . 4 2.2 方法 . 4 3 结果与分析 . 4 3.1 口咽部粘液细胞 . 5 3.2 食道粘液细胞 . 5 3.3 胃部粘液细胞 . 6 3.4 前肠粘液细胞 . 6 3.5 中肠粘液细胞 . 6 3.6 后肠粘液细胞 . 7 4 讨论 . 9 4.1 粘液细胞的分型 . 9 4.2 粘液细胞的发育 .
2、 9 4.3 饥饿对粘液细胞的影响 . 10 致谢 . 11 参考文献 . 11 1 黄姑鱼消化道粘液细胞的组化研究及饥饿对其类型和分布的影响 摘要 以体重为 8.50.5g 的 2 月龄幼鱼及 1208.0g 的 12 月龄成鱼为研究对象，采用阿利新蓝 -过碘酸希夫氏（ AB-PAS）反应染色方法 , 研究黄姑鱼幼鱼和成鱼消化道粘液细胞中的类型及分布，以及饥饿胁迫 30d 对黄姑鱼成鱼消化道粘液细胞的影响。结果表明：黄姑鱼成鱼消化道各部位粘液细胞总数目均显著大于幼鱼；幼鱼和成鱼口咽部、食道及胃体均以含有中性和酸性混合粘液性物质的型或型粘液细胞为主，且型粘液细 胞在成鱼消化道口咽部、食道及胃体
3、的数目均显著大于幼鱼；成鱼和幼鱼前肠、中肠及后肠中，仅发现含混合性粘液物质的型粘液细胞的数目显著大于幼鱼。饥饿会导致黄姑鱼消化道各部位型、型及型粘液细胞均显著降低，其中型粘液细胞受影响的程度最严重，饥饿 10d 后就会导致型粘液细胞在食道、胃及肠道中消失；饥饿胁迫会导致以中性粘多糖为主型粘液细胞在消化道各部位显著升高。搞清楚饥饿胁迫对成鱼消化道粘液细胞的影响机制，可以为研究鱼类的粘液免疫机能提供理论依据。 关键词 粘液细胞 类型 分布 饥饿 影响 2 Yellow croaker digestive tract of mucous cells in the group research and
4、 the hunger of its type and distribution Abstract Weight 8.5 0.5g 2-month-old juveniles, and 120 8.0g of the 12-month-old adult fish as the research object, the use of alcian blue - periodic acid Schiffs (AB-PAS) reaction staining method to study yellowthe type and distribution of the croaker juveni
5、le and adult fish gastrointestinal mucus cells, and starvation stress 30d yellow croaker as the fish gastrointestinal mucus cells. The results show that: the total number of yellow croaker as the fish digestive tract of various parts of the mucous cells were significantly larger than juveniles; juve
6、nile and adult fish of oropharyngeal, esophageal and gastric body are to contain the type of neutral and acidic mixed mucinous material III or mainly of type IV mucus cells, and type IV mucus cells in the number of adult fish digestive tract of oropharyngeal, esophageal and gastric body were signifi
7、cantly larger than juveniles; adult fish and juveniles of the foregut, midgut and hindgut, only type mucous cells with mixed mucinous substances was significantly greater than in the number of juveniles. Hunger can cause yellow croaker gastrointestinal all parts of type , type II and type mucous cel
8、ls were significantly lower in type II mucous cells to be affected the most, after hunger 10d, will lead to type II mucous cells in the esophagus, stomach and intestinal disappear; hunger stress can cause the mucus type III cells were significantly increased in various parts of the digestive tract m
9、ainly neutral mucopolysaccharide. Figure out the mechanism of starvation stress on the digestive tract mucus cells of the adult fish, and can provide a theoretical basis for the study of fish mucus immunodeficiency. Key words Mucus cell type distribution of hunger impact3 1. 前言 鱼类的消化道是鱼类与外界进行物质交换的重要
10、场所 , 分布着大量的粘液细胞 1. 粘液细胞能分泌多种活性物质 , 如粘多糖 , 糖蛋白 ,水解性酶类等 , 在鱼类的免疫防御、营养物质的消化吸收等方面发挥着重要的生理功能 2. 国外关于水产动物消化道粘液细胞的研究开展的较早 1-3, 国内关于大菱鲆、牙鲆、波纹唇鱼、哲罗鱼等消化道粘液的类型及分布也做了 研究。但是，上述研究主要涉及到某一时期鱼类粘液细胞的类型及分布 , 而在粘液细胞的发生、发育及理化因子对其影响等方面研究较少 . 鱼类经常会面临食物的缺乏而受到饥饿胁迫 , 饥饿对鱼类的影响研究主要集中在生化组成 ,消化生理 ,补偿生长等方面的影响 【 5-6】 。近年来，饥饿与鱼体抗病免
11、疫力的关系成为研究的热点 . 李石磊等通过血液中碱性磷酸酶、过氧化物岐化酶等指标的变化 ,明确长时间饥饿胁迫会严重破坏虾夷扇贝免疫机能。 Caruso G 等通过研究血液中溶菌酶、血凝素等指标的变化，指出饥饿 31 天会显著的影响狼鲈和黑斑小鲷的非 特异性免疫功能。以上研究都是通过血液生化指标的变化来评价鱼类的健康状况及其对环境的适应。鱼类的粘液具有与血液相似的血清学反应【 7】，在鱼类的非特异性方面同样发挥着重要的作用。关于饥饿胁迫对鱼类消化道粘液细胞的影响尚未见报道。 黄姑鱼是我国重要的海水经济鱼类，主要分布于中国、朝鲜半岛和日本南部沿海。近年来，随着黄姑鱼自然资源的逐渐枯竭，黄姑鱼的人工
12、养殖逐渐兴起。本实验室已经对黄姑鱼的人工育苗、补偿生长及投喂频率进行过报道。迄今为止，尚未见有关黄姑鱼消化道粘液细胞的分型及饥饿胁迫对其影响的研究。为此，笔者运用组 织学和组织化学的方法，研究了幼鱼和成鱼期黄姑鱼消化道粘液细胞的分布及类型，并且分析了饥饿胁迫对黄姑鱼成鱼消化道粘液细胞的影响。对黄姑鱼粘液细胞的研究，旨在为深入研究黄姑鱼消化生理、免疫机能等方面的研究积累基础材料，同时对其养殖生产和病害防治也具有一定的指导意义。 2 材料与方法 2.1 实验材料 试验用鱼均来自于浙江省海洋水产研究所西闪岛试验场，为同一批受精卵繁育而来的 2月龄幼鱼（ 8.50.5g）及 12 月龄成鱼（ 1208
13、.0g）。将 12 月龄成鱼在塑料水缸（直径 1m，水深 1.5m）中暂养一周后正式开始饥 饿实验，每个水缸中放养 10 尾黄姑鱼成鱼，每组设三个平行重复水缸。暂养期间每天投喂两次，分别在 8:00 和 16:00 投喂人工配合饵料。实验4 鱼共分为 4 组，分别为对照组（饥饿 0d）、实验 1 组（饥饿 10d）、实验 2 组（饥饿 20d）、实验 3 组（饥饿 30d）。饥饿期为 0-30d，每天换水 1/3 并记录水温。每天 24h 充气，溶解氧保持在 5mg/L。 2.2 方法 将实验鱼于冰板上活体解剖，分别取口咽部、食道、胃体、前肠、中肠和后肠，然后迅速将组织块放入 Bouin.s
14、液中固定，间隔 24h 后更换固定液一次，乙醇脱水，二甲 苯透明，石蜡包埋，纵切，切片厚度为 7m，阿利新蓝（ AB， pH2.5）和过碘酸希夫氏 (PAS)反应染色 15。 分别取消化道各组织块切片，用 NIKON Eclipse 50i 显微镜观察切片，每个切片随机取10 个 200 倍视野进行观察，对粘液细胞的类型及数目用接目网格测微尺对粘液细胞进行计数，计算出每 0.01 平方毫米的粘液细胞数。实验数据采用 SPSS13.0 统计软件，用单因子方差分析和 Duncans 多重比较进行差异显著性检验，实验结果用平均值标准误 （ x SE）来表示。 3 结果与分析 粘液细胞的分类按安利国
15、16及 尹苗 7的方法，根据 AB-PAS 染色结果的不同将黄姑鱼消化道粘液细胞分为 4 型：红色、蓝色、蓝紫色、紫红色。型， AB-PAS 染色为红色，含有 PAS 阳性的中性粘多糖；型， AB-PAS 染色为蓝色，含有 AB 阳性的酸性粘多糖；型，AB-PAS 染色为紫红色，主要含有 PAS 阳性的中性粘多糖，同时含有少量 AB 阳性的酸性粘多糖；型， AB-PAS 染色为蓝紫色，主要含有 AB 阳性的酸性粘多糖，同时含有少量 PAS阳性的中性粘多糖。在 pH2.5 阿利新蓝溶液染色时酸性粘液蓝色， pH1.0 阿利新蓝溶液染色仅 显示弱的和强的硫酸化酸性粘液蓝色。 3.1 口咽部粘液细胞
16、 根据 AB-PAS 染色结果显示（如表 1），幼鱼和成鱼口咽部粘液细胞均以型粘液细胞为主，幼鱼口咽部粘液细胞型型型型，成鱼口咽部粘液细胞型型型型。同幼鱼口咽部相比，成鱼口咽部、及型粘液细胞的数量均显著增加 (p0.05)。成鱼口咽部粘液细胞的总数显著的大于幼鱼口咽部 (p0.05)，饥饿 30d 后又显著下5 降 (p0.05)。饥饿 30d 内，型、型及型粘液细胞均没有在食道中观察到。 3.3 胃部粘液细胞 根据 AB-PAS 染色结果显示（如表 1），幼鱼胃体粘液细胞中以型粘液细胞为主（ 214.04 51.37），而成鱼胃体粘液细胞以型粘液细胞为主（ 357.89 67.35）。幼鱼胃
17、体中型和型粘液细胞的数量基本相同 (p0.05)，无型粘液细胞。成鱼胃体粘液细胞的数目型型型型。同幼鱼相比，成鱼胃体型粘液细胞变化不显著 (p0.05)，型粘液细胞显著增加（ 0： 35.09 10.32， p0.05)；饥饿 20d 内，胃体型粘液细胞呈现显著下降的趋势 (p0.05)。 3.4 前肠粘液细胞 根据 AB-PAS 染色结果显示（如表 1），幼鱼前肠粘液细胞以型粘液细胞为主，而成鱼前肠则以型粘液细胞为主。幼鱼前肠粘液细胞型型型型，成鱼前肠粘液细胞型型型型。同幼鱼相比，成鱼前肠型粘液细胞显著增加且增加的幅度最大 (p0.05)；成鱼型粘液细胞有小幅升高也不显著 (p0.05)。成
18、鱼前肠粘液细胞总数显著大于幼鱼 (p0.05)。成鱼中肠粘液细胞总数显著大于幼鱼 (p0.05)。 3.6 后肠粘液细胞 根据 AB-PAS 染色结果显示（如表 1），幼鱼后肠粘液细胞以型为主，成鱼后肠粘液细胞以型和型粘液细胞为主。幼鱼后肠粘液细胞型型型型，成鱼后肠粘液细胞型型型型。同幼鱼后肠相比，成鱼后肠型、型及型粘液细胞均显著增加 (p0.05)；饥饿 10d 后，成鱼后肠型粘液细胞显著下降 (p0.05)，然后又出现显著升高的趋势 (p0.05)。 表 1 幼 鱼和成鱼消化道粘液细胞的类型及分布 分布 粘液细胞类型 型 型 型 型 总数 口咽部 幼鱼 49.12 11.35 136.84
19、 42.49 114.04 30.24 178.95 39.31 478.95 116.28 7 成鱼 203.57 45.32 142.11 38.47 221.05 48.86 503.51 92.37 1070.24 195.87 食道 幼鱼 0 0 154.39 38.58 164.91 37.83 319.31 68.92 成鱼 0 0 0 421.05 95.78 421.05 95.78 胃体 幼鱼 24.56 6.73 0 214.04 51.37 24.56 7.29 263.16 57.24 成鱼 31.57 8.65 35.09 10.32 171.93 45.64 35
20、7.89 67.35 596.48 123.28 前肠 幼鱼 49.12 11.54 35.09 6.41 94.74 17.83 52.63 12.84 231.58 42.37 成鱼 326.31 64.32 15.79 3.52 80.70 15.66 66.67 9.49 489.47 86.42 中肠 幼鱼 56.14 7.83 57.89 10.53 129.82 14.89 92.98 17.83 336.83 46.78 成鱼 177.19 47.72 64.91 13.59 114.04 39.72 189.47 39.14 545.61 126.53 后肠 幼鱼 5.26
21、1.51 133.33 32.49 10.53 2.59 59.65 9.51 208.77 38.27 成鱼 180.70 48.29 63.16 14.52 98.25 18.53 177.19 34.17 519.3 114.01 8 图 1 饥饿对成鱼消化道粘液细胞类型及分布的影响 4 讨论 4.1 粘液细胞的分型 鱼类粘液细胞的分型是进行粘液细胞研究首先要解决的问题。在前人研究的基础上17,18，本研究选用 AB-PAS 染色方 法对黄姑鱼消化道粘液细胞进行分型。 AB-PAS 是一种粘液细胞特异的染色方法，将 AB 和 PAS 的染色结果相结合起来便能根据所显颜色较准确地反映粘液细
22、胞中酸性粘多糖和中性粘多糖的含量变化，从而达到区别不同类型粘液细胞的目的，比用传统的 HE 染色方法从形态上划分粘液细胞要更加准确 19。结果表明，黄姑鱼消化道各部位的上皮组织中均有粘液细胞分布，但不同部位粘液细胞的类型及密度各不相同，这可能与各部位的功能不同有关。 4.2 粘液细胞的发育 有关组织形态学资料显示，随着鱼的发育成熟，粘液细胞的数量是逐渐增多的。 Ottesen和 Olafsen20研究发现，大西洋比目鱼在发育成熟过程中粘液细胞的数量和成分都在发生变化，粘液细胞的数量随着鱼的发育成熟而不断增加。 Sinha21在研究野鲮属鱼的育苗、幼鱼和成鱼食管前、中、后部粘液细胞的变化时发现，鱼苗粘液细胞的数量最少，幼鱼居中，成鱼最多。本研究对黄姑鱼幼鱼和成鱼消化道各部位粘液细胞的数目进行对比，证明黄姑鱼成鱼消化道各部位粘液细胞总数目均显著大于幼鱼，这与上述观点相一致。黄姑鱼在摄食时，病原微生物会随着食物进入体内，粘液细胞分泌的糖蛋白、粘多糖等溶菌抗菌物质可能在 防
