1、 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 密度胁迫对皇姑鱼幼鱼生长、代谢及非特异性免疫的影响 学 院： 学生姓名： 专 业： 水产养殖 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 目录 中文摘要 . 错误 !未定义书签。 英文摘要 . 错误 !未定义书签。 1. 前言 . 错误 !未定义书签。 2. 实验材料与方法 . 3 2.1 材料 . 3 2.2 实验 设计 . 3 2.3 样品采集 . 4 2.4 分析方法 . 4 2.5 数据处理及统计分析 . 4 3. 结果与分析 . 5 3.1 密度胁迫对皇姑鱼幼鱼生长性能的影响 . 5 3.2 密度胁迫对皇姑鱼幼鱼血清 补体 C3、 C4 含量 的影响
2、 . 5 3.3 密度胁迫对皇姑鱼幼鱼血清溶菌酶活性的影响 . 6 3.4 密度胁迫对皇姑鱼幼鱼血清代谢酶活性的影响 . 7 4. 讨论 . 8 4.1 密度胁迫对皇姑鱼幼鱼生长性能的影响 . 8 4.2 密度胁迫对皇姑鱼幼鱼血清代谢酶的影响 . 8 4.3 密度胁迫对皇姑鱼幼鱼菲特异性免疫的影响 . 9 5. 结论 . 9 致谢 . 9 参考文献 . 10 1 密度胁迫对黄姑鱼幼鱼生长、代谢及非特异性免疫的影响 摘要 为了 研究密度胁迫对黄姑鱼幼鱼生长、代谢及非特异性免疫的影响，分别设置 4 个养殖密度，每缸分别放养 15 尾 、 30 尾 、 45 尾 、 60 尾 幼鱼 ， 密度相当于
3、1.49 kg/m3、 3.00 kg/m3、4.84 kg/m3、 5.81 kg/m3， 并分别标记为 G15、 G30、 G45、 G60， 每组设 3 个重复 ， 养殖 30 天后对幼鱼进行生长性能 、 饲料系数 、 血清代谢酶及非特异性免疫指标的分析 。 结果表明 : 1) G30组的增重率最高并显著高于其它各组 （ p 0.05） ， G45 组最低， G45 组和 G60 组之间差异不显著（ p 0.05） ， G45 组、 G60 组增重率显著低于 G15 组、 G30 组 （ p 0.05） 。特定生长率具有与增重率相类似的变化规律。饵料系数随着养殖密度的增加呈现递增的趋势，
4、 G60 组的饵料系数最高显著高于其它三个组别 （ p 0.05） 。 2) 随着养殖密度的增大，血清溶菌酶活性呈现逐渐降低的趋势， G60 组血清溶菌酶活性最低并显著低于其它三组 （ p 0.05） 。 G30 组血清补体 C3、 C4含量均最高，密度胁迫对血清补体 C3、 C4 含量的影响均不显著 （ p 0.05） 。 3) G60 组乳酸脱氢酶活性最高并显著高于 G15 与 G30 组 （ p 0.05） ， G45 组与 G60 组差异不显著 （ p 0.05） 。随着养殖密度的增大，谷丙转氨酶活性有逐渐增大的趋势，但是各密度组之间谷丙转氨酶活性差异不显著 （ p 0.05） 。谷草
5、转氨酶活性具有与谷丙转氨酶相类似的变化规律， G60 组血清谷草转氨酶活性最高并显著高于其它三组 （ p 0.05） 。结果表明 ， 养殖密度过高或过低都会对黄姑鱼幼鱼的生长 、 代谢及非特异性免疫造成负面影响 ， 30-45 尾 /缸（ 3.00-4.84 kg/m3） 为较为适 宜的养殖密度 。 本研究旨在为黄姑鱼的工厂化养殖提供理论依据 。 关键 词 黄姑鱼 密度胁迫 生长 代谢 非特异性免疫 2 Effect of density stress on growth、 metabolism and non-specific immune functions of junvenile Ni
6、bea albiflora Abstract A thirty-day feeding trial was conducted to investige the effect of density stress on growth performance, feed coefficient, activies of related serum enzymes and non-specific immune functions of junvenile Nibea albiflora. Juveniles were reared in four different experiment grou
7、ps : G15(15ind/tank, 1.49 kg/m3)、 G30(30ind/tank, 3.00kg/m3)、 G45(45ind/tank, 4.84 kg/m3)、 G60(60ind/tank, 5.81 kg/m3). The result showed: (1) weigh gain (WG) of G30 was the highest and significantly higher than other experimental groups（ p 0.05） . WG of G45 was the lowest. WG of G45 and G60 were si
8、gnificantly lower than G15 and G30（ p 0.05） . The trend of specific growth rate (SGR) were similar to that of WG amony the experimental groups. Feed conversion rato (FCR) increased with the increase of density. (2) The lysozyme activity in serum decreased with the increase of the stocking density. T
9、he lysozyme activity of G60 were significantly lower than other experimental groups（ p 0.05） . Complement of C3 and C4 were not affected by the stocking density significantly（ p 0.05） . Complement of C3 and C4 of G30 were the highest. (3) Lactic dehydrogenase (LDH) activities of G60 was the highest
10、and significantly higher than other experimental groups（ p 0.05） . There was no signigicantly differenec between G45 and G60（ p 0.05） . Glutamic pyruvic transaminase (GPT) activities increased with the increase of the stocking density, but there was no significantly difference amongy experiment grou
11、ps（ p 0.05） . Similar trend was found in glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) activities. GOT activities of G60 was significantly higer than other groups（ p 0.05） . Hence, too high or to low stocking density would affect the growth perfomance, metabolism and non-specific immune functions of junve
12、nile Nibea albiflora. 30-45ind/tank （ 3.00-4.84 kg/m3） was considered to be a suitable stocking density. Key word Nibea albiflora; density stress; non-specific immune functions 3 密度胁迫对黄姑鱼幼鱼生长、代谢及非特异性免疫的影响 1. 前言 黄姑鱼 Nibea albiflora(Richardson)隶属于鲈形目、石首鱼科、黄姑鱼属，是我国重要的海水经济鱼类 ,主要分布于中国沿海、朝鲜半岛及日本南部沿海。黄姑鱼体延
13、长，侧扁；尾柄细长，亦侧扁；头较尖突，吻钝尖，前端有二横行小孔。 黄姑鱼为暖水近海中下层的广温、广盐性鱼类。黄姑鱼的最是生长条件为：水温 2028，盐度为 18 30 ， PH 值为 7.88.2，溶解 氧 68mg/l. 黄姑鱼为肉食性鱼类 ,摄食凶猛 ,幼鱼主要摄食小型虾类、幼鱼和多毛类，成鱼以小型鱼类、虾类和双壳类等底栖生物为主。仔鱼期浮游生活于水表层 ,主要摄食轮虫等微小浮游动物及其卵粒等 ,稚幼鱼期随其生活空间向底层转移 ,其食性相应转换 ,主要摄食桡足类、糠虾、磷虾等 ,随个体增长 ,还可捕食甲壳类 (虾、蟹等 )、小鱼和其他动物 ,生殖期摄食量相对降低。黄姑鱼喜栖息于水深 708
14、0 m 泥或泥沙底海域。黄姑鱼为洄游性鱼类，生殖期间具有较强的集群特性。 因其肉质鲜美、营养丰富，是我国传统捕捞业的主要对象。然而，由于过度 捕捞造成自然资源的逐步衰退，黄姑鱼的人工养殖应运而生。养殖密度高、单位面积产量高是工厂化养殖的主要特征。然而，高密度养殖可最大限度地利用水体，提高单位鱼的产量，但同时 存在着因养殖密度过高而造成的胁迫应激反应，若鱼体长时间处于这种状态，机体的免疫防御功能会受到抑制，导致鱼体对各种病原敏感性升高 1。而过低的密度又会造成能源和水体的浪费。许多学者针对高密度养殖对鱼类生长、存活、摄食以及新陈代谢、免疫功能等的影响进行了研究 2,3。目前国内外关于黄姑鱼幼鱼对
15、密度胁迫的适应机制研究还不多见。本研究探讨了不同养殖 密度对黄姑鱼幼鱼生长性能、代谢及非特异性免疫的影响及其适宜的养殖密度，以期为进一步探讨黄姑鱼在密度胁迫环境下的适应机制提供参考，并为工厂化养殖黄姑鱼提供理论依据。 2. 实验 材料与方法 2.1 材料 试验于 2011 年在浙江省海洋水产研究所西轩岛试验场进行。试验用鱼为同一批次受精卵经人工繁殖获得的 63 日龄黄姑鱼幼鱼，随机挑选健康无伤、体重为 10.0-10.7g 的实验鱼。试验用容器为 64.5cm44.5cm32.3cm的实验缸，试验用水为经砂滤过的自然海水，水温 250.5，盐度为 260.5。 2.2 实验设计 试验共分为 4
16、 组 （ 记为 G15、 G30、 G45、 G60），初始养殖密度分别为 1.49 kg/m3、 3.00 kg/m3、4.84 kg/m3、 5.81 kg/m3（即在每一个实验缸中分别放入 15、 30、 45、 60 尾黄姑鱼），每一个组设 3 个平行。试验期间每天在 8:00 和 16:00 各投喂饵料一次，采取缓慢投喂的方法，直到实验鱼不摄食停止投喂，记录每天各个组别实验鱼的摄食量，每次投饵后 30min 将泡沫箱中的粪便吸出。实验共进行 30d，期间 24h 连续充气，溶解氧水平保持在 5mg/l 以上。采用 24h 微流水的方式，保证试验期间的养殖水指标在安全阈值内。实验期间如
17、果出现实验鱼跳出或死亡的情况，则及时将死亡幼鱼取出并称量质量，然后取体质量相同的健康幼鱼放入泡沫箱中4 以保持各组密度不变。 2.3 样品采集 实验结束时，每个实验缸中随机取出 5 尾鱼测定体长、体重，尾静脉采血，置于 4冰箱中静置 6h， 3000r/min 离心 10min 后取血清，并将血清置于冰盒中带回实验室 -80冰箱保持。采样前将鱼置于 200mg/L 的 MS-222 中做深度麻醉，避免采样时对鱼的人为因素刺激。 2.4 分析方法 2.4.1 生长性能的测定 分别在实验开始和结束时测定黄姑鱼的体重，计算出平均体重，然后根据公式计算增重率 (WG)和特定生长率 (SGR)。计算实验
18、期间各组别摄食饵料的总质量，然后根据幼鱼的体重计算饵料系数（ FCR）。 2.4.2 血清代谢酶活性的测定 乳酸脱氢酶 (LDH)活性单位定义为： 1000ml 血清在 37与基质作用 15 分钟，在反应体系中产生 1mol 丙酮酸为 1 单位。 谷丙转氨酶 (GOT)和谷草转氨酶 (GPT)活性采用微量酶标法测定，设置测定组和对照组，分别加入 25 lGOP 或 GPT 基质液，在测定组中加入 5 l 血清样本混匀，在 37水浴 30 分钟后分别加入 25 l2.4 一二硝基苯肼，并在对照组中加入 5 l 血清样本混匀，在 37水浴 30分钟后各加入 250 l0.4mol/L 氢氧化钠混匀
19、，室温放置 15 分钟，测定在 510nm 波长下酶标仪各孔的 OD 值，以绝对 OD 等于测 定孔 OD 减去对照孔 OD，查标准曲线，求得相应的 GOT 或GPT 活力。 实验中测定血清代谢酶活性所用的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。 2.4.3 血清溶菌酶及补体 C3 和 C4 测定 血清溶菌酶活性采用试管比浊法测定，以溶壁微球菌冻干粉为底物，按照 南京建成生物工程研究所生产的试剂盒所提供的使用说明书进行 。 补体 C3 或 C4 的含量采用免疫浊度法测定，分别按照 南京建成生物工程研究所生产的试剂盒要求加入各种试剂及血清后，在 37孵育 5 分钟，测定紫外分光光度计在 340nm
20、波长下的吸光度，按照公式求出绝对吸光度，查标准 曲线，求得相应的 补体 C3 或 C4 的含量。 2.5 数据处理及统计分析 体重增重率（ WG_）、特定生长率（ SGR）和饲料转化率（ FCR）的计算参照以下公式 4：WG(%)=100*(Wt-Wo)/ Wo； SGR=100*（ InWt-InWo） /t； FCR=Wf/n(Wt-Wo)；其中， n 为实验个体数量 ， Wf 为饲料总摄食量 ， t 为实验天数 ， Wt 为实验开始时实验鱼的平均体质量 ， Wo为实验结束时实验鱼的平均体质量 。 实验数据采用 SPSS13.0 统计软件，用单因子方差分析和 Duncans 多重比较进行差
21、 异显著5 性检验，实验结果用平均值标准误 （ x SE） 来表示。 3. 结果与分析 3.1 密度胁迫对黄姑鱼幼鱼生长性能的影响 各实验组黄姑鱼幼鱼生长性能的变化如表 1 所示。实验开始前各组初始体质量无显著差异，经过 30d 的实验， G30 组的终末体质量最高， G15 组最低，但各组终末体质量并无显著性差异 （ p 0.05） 。 G30 组的增重率最高， G45 组最低， G45 组和 G60 组之间增重率差异不显著 （ p 0.05） ，但 G15 组、 G30 组与 G45 组、 G60 组差异非常显著 （ p 0.05） 。特定生长率具有与增重率相类似的变化规律， G15 组、
22、 G30 组显著高于 G45 组、 G60 组 （ p 0.05） 。饵料系数随着养殖密度的增加呈现递增的趋势， G60 组最高，并且 G60 组的饵料系数显著高于其它三个组别 （ p 0.05） 。实验期间各组幼鱼并没有出现死亡情况，仅 G60 组的一个平行组中极少量个体在密度胁迫 26 天后体表出现白斑，取样镜检为淀粉卵甲藻。 根据测定资料运用逐步引入法（ Stepwise）进行逐步多元回归分分析 ，最终 建立以全长 和体重 估计 黄姑鱼幼鱼覆盖面积的 回归方程： Y=0.927X1+0.711X2+4.805，注： X1 代表全长， X2代表体重。通过回归方程计算出各密度组的覆盖率，经过
23、 30d 的实验， G15 组、 G30与 G45 组、G60 组的底面积覆盖率依次是 21.53%、 44.38%、 66.53%和 86.66%。 表 1 密度胁迫对黄姑鱼幼鱼体质量、增重率、特定生长率和饲料系数的影响 Tab.1 Effect of density stress on body weight, weight gain, specific growth rate and feed conversion ratio of juvenile Nibea albiflora 组别 groups G15 G30 G45 G60 初始体质量 /g Average initial bo
24、dy weigh 10.008 1.952 10.135 1.732 10.745 1.758 10.288 1.989 终末体质量 /g Average final body weight 33.029 4.835 34.743 6.976 34.695 5.970 33.403 6.175 增重率 /% WG 230.03 45.13a 242.80 61.21b 222.89 56.78c 224.68 72.45c 特定生长率 /% SGR 3.98 0.28ab 4.11 0.38b 3.93 0.36a 3.91 0.42a 饵料系数 FCR 0.401 0.08a 0.688 0
25、.24b 1.12 0.28c 1.26 0.18c 成活率 /% Survival rate 100 100 100 100 覆盖率 /% Coverage rate 21.53 44.38 66.53 86.66 3.2 密度胁迫对黄 姑鱼幼鱼血清补体 C3、 C4 含量的影响 密度胁迫对黄姑鱼幼鱼血清补体 C3、 C4 含量的影响结果见 图 1，不同密度养殖 30 天后，6 G30 组血清补体 C3、 C4 含量均最高， G15 组（密度最低组）血清补体 C3 含量最低， G60 组（密度最高组）血清补体 C4 含量最低，但密度胁迫对血清补体 C3、 C4 含量的影响均不显著 （ p 0
26、.05） ，说明黄姑鱼的非特异性免疫系统的调节性能较好，耐受性、抗病能力较高，有较好的环境适应能力。 图 1 密度胁迫对黄姑鱼幼鱼血清补体 C3 和 C4 含量的影响 注：不同字母表示不同组别间差异具有显著性 （ P 0.05） 。 Fig.1 Effect of density stress on concentration of C3 and C4 of juvenile Nibea albiflora Note: Different letters indicate significant difference among groups（ P 0.05） . 3.3 密度胁迫对黄姑鱼幼鱼
27、血清溶菌酶活性的影响 密度胁迫对黄姑鱼幼鱼血清溶菌酶活性的影响结果见图 1，不同密度养殖 30 天后，随着养殖密度的增大，血清溶 菌酶活性呈现逐渐降低的趋势， G60 组黄姑鱼血清溶菌酶活性显著低于其它三组 （ p 0.05） 。但是，密度胁迫对 G15 组、 G30 组与 G45 组血清溶菌酶活性的影 响并没有达到显著水平 （ p 0.05） 。 7 图 2 密度胁迫对黄姑鱼幼鱼血清溶菌酶活性的影响 注：不同字母表示不同组别间差异具有显著性 （ P 0.05） 。 Fig2 Effect of density stress on the lysozyme activity of juveni
28、le Nibea albiflora Note: Different letters indicate significant difference among groups（ P 0.05） . 3.4 密度胁迫对黄姑鱼幼鱼血清代谢酶活性的影响 密度胁迫对黄姑鱼幼鱼血清代谢酶活性的影响如图 3 所示。不同密度养殖 30d 后，随着养殖密度的增大，谷丙转氨酶活性有逐渐增大的趋势。其中， G60 组谷丙转氨酶活性最高，G15 组最小， G45 组与 G60 组显著高于 G15 组与 G30 组 （ P 0.05） 。谷草转氨酶活性具有与谷丙转氨酶相类似的变化趋势， G60 组血清谷草转氨酶 活性
29、最高并显著高于其它三组 （ P 0.05） ，G15 组活性最低，但是 G15 组与 G30 组、 G45 组之间谷草转氨酶活性差异不显著 （ P 0.05） 。 血清乳酸脱氢酶活性 G30 组最低， G15 组与 G30 组之间较为接近，差异不显著 （ P 0.05） 。高 密度 组 G60 乳酸脱氢酶活性最高并显著高于其它三个密度组 （ P 0.05） 。 图 3 密度胁迫对黄姑鱼幼鱼血清代谢酶的影响 注：不同字母表示不同组别间差异具有显著性 （ P 0.05） 。 Fig.3 Effect of density stress on LDH, ALT and AST activies of
30、 juvenile Nibea albiflora Note: Different letters indicate significant difference among groups（ P 0.05） . 8 4. 讨论 4.1 密度胁迫对黄姑鱼幼鱼生长性能的影响 养殖密度是影响野生或养殖鱼类生长和性成熟的一个重要因素，关于密度胁迫对养殖对象生长的影响前人已做过大量的研究。但是养殖密度对养殖对象生长的影响还存在一定的争论，不同的学者有不同的看法。有的学者认为养殖密度对 养殖对象影响较小或几乎没有影响，如大眼梭鲈 Stizostedion vitreumvitreum5、俄罗斯鲟 6等；而
31、有的学者则通过对史氏鲟 7和大鳞大麻哈鱼 8、白斑狗鱼 9、斑点叉尾 鮰 10、溪红点鲑 11等的研究发现，低密度时鱼类生长与密度呈正相关，但当种群达到高密度时生长与密度则呈负相关。本实验中， G30 组的增重率和特定生长率显著高于其它三组，这可能是由于黄姑鱼具有集群性，养殖密度过低反而不利于其生长，另一方面，本实验是在 24h 流水养殖系统中进行的，克服了高密度养殖容易造成水质恶化等 问题，因此， G60 组并没有出现因为高密度而生长显著降低的现象，密度较高的 G30 组反而生长最快。 G45 组和 G60 组的增重率和特定生长率要低于 G30 组，说明高密度养殖仍然会对黄姑鱼幼鱼的生长产生
32、一定的抑制作用。逯尚尉等 12在研究密度胁迫对点带石斑鱼幼鱼生长的影响是发现，过低或过高的养殖密度都会对群体产生一定的抑制作用。随着黄姑鱼养殖密度的增大，饵料系数也逐渐变大。 G45 组和 G60 组的饵料系数显著高于两个较低密度组（ G15组与 G30 组），这可能是由于在高度胁迫下，黄姑鱼幼鱼对饲料的转化率比较低，进而造成饵料系 数较大。另一方面，也有可能由于高密度组养殖个体，在有限的养殖空间内，养殖对象对食物、生存水体空间和水中溶解氧而产生竞争，消耗掉用于生长的部分能量，因而影响了鱼类的生长，而表现为饵料系数较大。因此，从生长性能和成本的角度，在 3.00 kg/m3（ 30尾 /缸 ）
33、 的养殖密度下养殖黄姑鱼幼鱼比较适宜。同时要认识到密度胁迫对黄姑鱼的影响与鱼体规格密切相关，不同生长阶段的黄姑鱼的最适养殖密度也不同。 Bjrnsson7(1994)评估拟鳙鲽理想的密度为覆盖池底 100%-200%之间，马爱军等 13在研究饲 养密度对大菱鲆生长性能的影响是，通过 SGR 和养殖效率好的密度组确定大菱鲆鱼体池底覆盖率为 75%-150%。本实验通过建立覆盖面积对全长和体重的多元回归方程，求出各个密度组的池底覆盖面积。通过对比较各密度组实验鱼的 SGR 和 FCR，由 G30 组和 G45 组确定黄姑鱼养殖较适宜的池底覆盖面积为 40%-70%之间。 另外，本实验中各组都没有发
34、生实验鱼死亡的情况，这可能是由于实验中进行连续充气并采用 24h 流水养殖模式保证了较好的水质条件，高密度胁迫尚不能导致实验鱼死亡，这为开展黄姑鱼工厂化集约化养殖提供了可能性。 本实验中高密度组 G60 组在密度胁迫 26 天后出现了少量个体体表带淀粉卵甲藻病，因此，在黄姑鱼的集约化养殖中要注意养殖个体疾病的预防，可以通过定期全池泼洒药物来预防疾病的发生。 4.2 密度胁迫对黄姑鱼 幼鱼 血清代谢酶的影响 在集约化养殖过程中，养殖密度一直被认为是一项关键性的管理因子，原因在于它是一个潜在的慢性胁迫因子，可导致养殖鱼类生理生化指标及其行为学的变化 14。在胁迫环境下，氨基酸是鱼类进行糖异生作用的优先替代物，鱼类会消耗蛋白质和脂肪等来满足能量的需求，同时相关酶活性也显著提高 15。 Vijayan 等 16在研究密度胁迫对溪点红鲑代谢的影响时发现，鲑鱼在密度胁迫下糖异生作用明显加强。本实验中， G60 组的 AST 活性显著大于其它各组，并且 G45 组和 G60 组的 ALT 活性要大于 G15 组与 G30 组，这就可能是由于高密度组的实验鱼受到胁迫作用后，糖异生作用加强，消耗自身的丙氨酸和天冬氨酸等来产生葡萄糖来满足机体的需要，这与 Tejpal 等 17的研究结果相一致。另外，由于 ALT 在四个密度组胁迫 30d 后并没有
