1、 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 饥饿对黄姑鱼非特异性免疫及消化道粘液细胞的影响 学 院： 学生姓名： 专 业： 水产养殖 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 0 目录 中文摘要 . 1 英文摘要 . 2 1.前言 . 3 2实验材料和方法 . 4 2.1 实验材料 . 4 2.2 实验设计 . 4 2.3 取样测定 . 4 2.4 分析方法 . 5 3. 结果 . 10 3.1 饥饿前后 非特异性免疫因子 的变化 . 10 3.2 饥饿前后消 化道粘液细胞的变化 . 错误 !未定义书签。 4.讨论 . 错误 !未定义书签。 4.1 饥饿对黄姑鱼非特异性免疫的影响 . 错误 !未定义书
2、签。 4.2 饥饿对黄姑鱼消化道粘液细胞的影响 . 错误 !未定义书签。 小结 . 15 致谢 . 15 参考文献 . 16 1 饥饿对黄姑鱼非特异性免疫及消化道粘液细胞的影响 摘要 本文通过测定饥饿处理 0-30 天前后，黄姑鱼溶菌酶活力，补体 C3， C4 含量及其消化道粘液细胞的变化，以此来研究饥饿对黄姑鱼非特异性免疫及消化道粘液细胞的影 响。结果显示：结果显示：短期饥饿 (0-20d)不但不会影响黄姑鱼的免疫力 ,反而能使其免疫力有所增强。但是，随着饥饿时间的延长（ 20-30d），会使其免疫力有所下降；饥饿也会对黄姑鱼的消化道粘液细胞造成明显破坏。本实验结果既可丰富黄姑鱼非特异性免疫
3、机能和消化道粘液细胞的研究，也可为黄姑鱼的养殖和病害防治提供理论依据。 关键词 饥饿 黄姑鱼 非特异性免疫 消化道粘液细胞 2 The effects of starvation on non-specific immunity and the digestive tracts mucous cells of Nibea japonica Abstract By detecting the change of lysozyme activity,content of complement C3,C4 and digestive tract of mucous cells in Nibea ja
4、ponica after 0 to 30 days starvation,it showed the effects of starvation on non-specific immunity and digestive tract of mucous cells of Nibea japonica. The result showed that the non-specific immunity of Nibea japonica would increase in 0 to 20 days starvation, but would decrease in 20 to 30days st
5、arvation,and the digestive tracts mucous cells would be destroyed significantly during the starvation. The result could not only rich the study on the non-specific immunity and digestive tracts mucous cells,but also contribute to the aquaculture and disease control of Nibea japonica. key words Starv
6、ation Nibea japonica Nonspecific immune Gastrointestinal mucosal cells3 饥饿对黄姑鱼非特异性免疫及消化道粘液细胞的影响 1.前言 在自然界中，鱼类经常会在其生命周期中遭到饥饿的胁迫。不同的种类对不同饥饿环境的耐受程度也不同。由于环境剧变，季节更替或食物在空间分布上的不均匀等原因而受到饥饿的影响，特别是在人工养殖条件下，由于饲养密度过大 ,投饲不均匀等原因 , 鱼类经常出现饥饿现象。饥饿是 影响鱼类生理生态的重要因子之一。研究显示， 饥饿 不但 可以影响鱼类生长代谢、组织结构 和 酶活性等，还可影响血液常规指标以及鱼体的免疫
7、功能，严重时 会 诱发疾病， 最终 导致死亡。探讨饥饿对鱼类 非特异性免疫和消化道粘液细胞 的影响，分析鱼类受饥饿胁迫下 免疫系统和粘液细胞的 一系列反应 和变化 过程，揭示鱼类适应饥饿 影响 的生理对策，对于鱼类自然资源的保护、养殖生产、 育苗 等方面具有重要的指导意义。 黄姑鱼 ( Nibea japonica)，隶属于鲈形目（ Perciformes）、 石首鱼科（ Sciaenidae）、黄姑鱼属（ Nibea），俗名俗名：罗鱼、春水鱼、花蜮鱼、黄婆鸡、黄姑子、黄鲞等。黄姑鱼主要分布在中国沿海、朝鲜半岛及日本南部海域 1,2。 黄姑鱼体扁长；头钝尖， 吻微突出 ， 短 且 钝 ； 上颌
8、牙细小，下颌内行牙较大 ，两颌具有绒毛状牙带；体背部呈灰褐色，两侧呈灰黄色，腹部呈银白色；体两侧多为 黑褐色波状细纹斜向前方 ；头背侧呈灰褐色；胸鳍、腹鳍及臀鳍呈淡黄褐色；背鳍棘上部呈暗褐色，鳍条边缘呈黑色； 尾鳍呈楔形 3。 黄姑鱼有很多近种，朱元鼎等 4所述的黄姑鱼种类有黄姑鱼，日本黄姑鱼，双棘黄姑鱼，鮸状黄姑鱼，浅色黄姑鱼，半花黄姑鱼和尖头黄 姑鱼 7 种。 黄姑鱼为广温，广盐，暖水性鱼类，喜栖于近海中下层（水深约 70-80m），泥或沙泥底海域，具有发声能力， 特别是 处于 生殖 季节 （ 6 月下旬 -7 月） 。研究显示，黄姑鱼可以在 30-32的高温环境和 6-8的低温环境中存活
9、，盐度范围在 14 -34均可存活。黄姑鱼在水温低于14时，摄食量显著减少，生长速度变慢；当水温高于 16.5，生长开始明显加快 5。黄姑鱼最适宜的生长条件为：水温 20-28， PH 值 7.8-8.2，盐度 18 -30，溶解氧 6-8 mg/L3。 黄姑鱼的食性很广，幼鱼主要摄食对象 为多毛类和小型虾类，成鱼则主要以摄食小型鱼类、虾类和双壳类等底栖生物为食。黄姑鱼在生殖洄游或产卵时期摄食性很高，胃饱满度为1-4 级，以 2、 3 级为主 6。 黄姑鱼属于季节洄游性鱼类，生殖期期间具有较强的集群性，且雄鱼和雌鱼个体相差较大。 5-7 月份产卵，盐度 27 -31，产卵水温 13-29，产卵
10、水深 4-9 m。雌鱼怀卵量一般为 20-170 万粒，卵分批成熟排出。黄姑鱼的卵呈球形，属于浮性卵，卵径约 0.84 mm，有无色透明油球 1 个 7。在水温 22-22.5，盐度为 26.5条件下，大约 24 h 可以孵 化出仔鱼 8。 黄姑鱼营养丰富，肉质鲜美，深受广大消费者的喜爱，是我国传统渔业的主要捕捞对象。近些年，由于过度捕捞、环境的恶化等原因，野生黄姑鱼的自然资源遭到严重破坏，可捕捞量急剧下降，其种质资源的保护也越来越受到人们的重视，因此黄姑鱼的人工养殖逐渐兴起。由于日本黄姑鱼生长速度快 , 病害少 ,养殖周期短 ,所以易于养殖 ,经济效益可观 ,目前已成为我国海水网箱养殖中的重
11、要经济鱼类。开展黄姑鱼的养殖不仅能够满足市场需求，而且能够减少捕捞对现有自然资源的破坏。目前，黄姑鱼人工繁育技术已经突破，养殖技术也在逐步4 完善。作 为新兴的养殖鱼类在浙江、福建等地深受广大养殖户和消费者的喜爱，市场前景十分广阔。 近些年来，国内外许多学者对饥饿条件下再投喂对鱼类补偿生长及其对免疫系统的影响进行了深入的研究。董学兴等 9通过研究饥饿和再投喂期间银鲫血糖， MDA 含量及 SOD， ACP活性的变化，指出短期饥饿后再投喂可提高异育银鲫代谢水平和非特异性免疫机能。李石磊等 10通过血液中碱性磷酸酶、过氧化物岐化酶等指标的变化 ,确认长时间饥饿胁迫会严重破坏虾夷扇贝免疫机能。乔志刚
12、 11通过研究饥饿和再投喂期间鲇的红细胞数，血红蛋白，血糖浓度，甘油 三酯，总胆固醇， Na ， Cl ， Ca ， K 浓度和碱性磷酸酶活力的变化，指出饥饿对其各项生理生化指标均有不同程度影响，再投喂后各项生理生化指标有不同程度恢复。杨成辉等 12通过研究饥饿和再投喂期间哲罗鱼幼鱼的血液红细胞数，血红蛋白，白细胞数，血糖浓度，甘油三酯，总胆固醇，谷丙转氨酶，谷草转氨酶，碱性磷酸酶， Na， Ca， K，及 Cl 离子浓度的变化，指出在饥饿期间哲罗鱼幼鱼各项生理生化指标均有下降，而在再投喂期间，各项生理生化指标均有不同程度的恢复。楼宝等 13通过研究饥饿和再投喂期间花鲈肌肉脂肪，蛋白含量及 溶
13、菌酶，白细胞吞噬活性的变化，指出饥饿及恢复投饵也影响花鲈的非特异免疫水平。 Caruso G 等 14通过研究血液中溶菌酶、血凝素等指标的变化，指出饥饿 31 天后会显著影响狼鲈和黑斑小鲷的非特异性免疫功能。但是，上述研究没有涉及到饥饿对黄姑鱼非特异性免疫影响的报道。 上述研究都是通过血液生化指标的变化来评价鱼类的健康状况及其对环境的适应。粘液细胞能分泌多种活性物质 , 如粘多糖 , 糖蛋白等，在鱼类的免疫防御和营养物质的消化吸收等方面发挥着重要生理功能 15。因此，鱼类的粘液具有与血液相似的血清学反应，在鱼类的非特异性方面同样发挥着重要的作用 16。国外关于水产动物消化道粘液细胞的研究开展的
14、较早 17-19, 国内关于大菱鲆 20、胡子鲶 21、哲罗鱼 22等消化道粘液的类型及分布也做了研究。但是，上述研究主要涉及到某一时期鱼类粘液细胞的类型及分布 , 而在粘液细胞的发生、发育及理化因子对其影响等方面研究较少，关于饥饿胁迫对鱼类消化道粘液细胞的影响尚未见报道。 2. 实验材料和方法 2.1 实验材料 试验鱼均来自于浙江省海洋水产研究所西轩岛试验场，体重 1208.0g ，无缺鳞，无损伤，共 30 尾（ 10 尾备用） 。将实验鱼在塑料圆形养殖池（直径 3m，水深 0.5m）中暂养一周后正式开始饥饿实验。 2.2 实验设计 实验鱼共分为 4 组，每组从 10 尾中随机各取 5 尾，
15、分为对照组 S（ 0）（饥饿 0d）、实验 S（ 10）组（饥饿 10d）、实验 S（ 20）组（饥饿 20d）、实验 S（ 30）组（饥饿 30d）。饥饿期为0-30d，实验用水为经过沉淀和砂滤后的自然海水，要求盐度控制在 26 0.5，温度 25 0.5，每天上午和下午分别全部换水一次，并记录水温。每天 24h 充气，溶解氧保持在 5mg/L，采用自然光照。 2.3 取样测定 分别于 0d， 10d， 20d， 30d 的样本中，各从中随机取出 5 尾，对实验鱼进行尾动脉采血，所采血液于 4放置 6h，经 3000 r/ min 离心分离 10min 得到血清样本， 将血清置于冰盒中5 带
16、回实验室 -80冰箱保持。 在采血后迅速将实验鱼于冰板上活体解剖，分别取口咽部、食道、胃体、前肠、中肠及后肠，然后迅速用 Bouin.s 液固定组织块，每隔 24h 后更换一次固定液，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，纵切，切片厚度为 7m，阿利新蓝（ AB， pH2.5）和过碘酸希夫氏 (PAS)反应染色 23。 分别取消化道各组织块切片，每个切片随机取 10 个 200 倍视野进行观察（使用 NIKON Eclipse 50i 显微镜进行观察），计算出每 0.01 平方毫米的粘液细胞数量（使用接目网格测微尺进行计数）。 2.4 分析方法 2.4.1 溶菌酶活力的测定： 以溶壁微球菌冻干粉为底
17、物，血清溶菌酶活性采用试管比浊法测定。 样本前处理 : 取样 200 l 用于测定。 操作步骤： （ 1） 将 待 检测样本，配制的应用菌液 和 标准应用液 在 37 的 水浴箱 内 预温 5 分钟以上 ， 使检测样本，菌液 和 标准液温度 都 达 37 。 （ 2）待 检测的样本数（ n）加上标准管 和 空白管，取试管 n+1+1 只， 置于 37 水浴箱 内水浴 ，在试管中各加应用菌液 2ml， 继续水浴。 （ 3）取 2只以上 1cm光径的比色皿， 于 可见光分光光度计 的 530nm处，用蒸馏水调透光度 100%，随后 倒掉蒸馏水。 （ 4）将待测样本 和 标准应用液 0.2ml 分别
18、加入 已清洗 的比色皿底部， 随 后 迅 速将 37 水浴箱中 的 预温试管里 的 2ml 应用菌液迅速倒入装有 0.2ml 样本的比色皿 内 （也可用 5ml 大加样器吸取已 经过 37 预温的应用菌液 并 加入比色皿 内 ）。在将 1ml 已 37 预温 过 的应用菌液倒入比色皿 的 同 时 按下秒表计， 在 反应 5 秒时读出 ， 记录下透光度 T0 值，比色皿不要取出，在 2分零 5 秒时，再读一次透光度值并记录下 T2 值。 注意：用同一比色皿每检测一个样本后均要用蒸馏水冲洗干净，才可以再放第二个样本或溶菌酶标准品应用液。 计算公式： 52134 20/ 2 0 0 /U T U T
19、g m l U m lS T S T 注注注注注溶菌酶含量 样本测试前标准管浓度测定管透光度 测定管透光度（ ） 稀释倍数（）标准管透光度 标准管透光度 注 1 UT0 为测定管加应用菌液反应 5 秒时 所得的 透光度 。 注 2 UT2 为测定管加应用菌液反应 2 分零 5 秒时 所得 的透光度。 注 3 ST0 为标准管加应用菌液反应 5 秒时 所得 的透光度。 注 4 ST2 为标准管加应用菌液反应 2 分零 5 秒时 所得 的透光度。 检测结果： 6 序号 样本编号 T0 T2 LZM 活力 （ U/ml） 标准 13.2 16.0 1 1 10.9 15.9 357.1429 2 2
20、 12.0 17.1 364.2857 3 3 11.7 14.2 178.5714 4 4 11.6 23.6 857.1429 5 5 10.8 15.9 364.2857 6 0-1 11.7 19.1 528.5714 7 0-2 11.1 19.4 592.8571 8 0-3 11.1 17.5 457.1429 9 0-4 11.2 17.7 464.2857 10 0-5 11.4 21.3 707.1429 11 1-1 11.8 25.7 992.8571 12 1-2 10.9 18.1 514.2857 13 1-3 11.6 32.0 1457.1429 14 1-4
21、 11.7 24.1 885.7143 15 1-5 10.8 16.8 428.5714 16 2-1 11.8 19.7 564.2857 17 2-2 12.2 17.9 407.1429 18 2-3 11.5 18.5 500.0000 19 2-4 11.9 16.9 357.1429 20 2-5 11.7 20.4 621.4286 2.4.2 补体 C3 的测定： 采用免疫浊度法进行测定 操作步骤： （ 1） 样本前处理：取样 8 l 测定。 （ 2） 测定表： 空白 标准 测定 蒸馏水（ l） 8 校准品（ l） 8 待测样本 （ l） 8 R1（ l） 900 900 9
22、00 混 匀， 37 度孵育 3-5 分钟，波长 340nm， 0.5cm 光径，水调零测吸光度 A0 R2（ l） 300 300 300 标准曲线的制备： 7 检测结果 : 序号 样本编号 A0 A1 绝对 OD 补体 C3 含量 （ g/L） 1 1 0.038 0.109 0.071 0.1903 2 2 0.031 0.104 0.073 0.2005 3 3 0.032 0.105 0.073 0.2005 4 4 0.033 0.105 0.072 0.1954 5 5 0.039 0.107 0.068 0.1749 6 0-1 0.035 0.110 0.075 0.2107
23、 7 0-2 0.042 0.111 0.069 0.1801 8 0-3 0.041 0.109 0.068 0.1749 9 0-4 0.044 0.116 0.072 0.1954 10 0-5 0.039 0.111 0.072 0.1954 11 1-1 0.036 0.107 0.071 0.1903 12 1-2 0.045 0.111 0.066 0.1647 13 1-3 0.041 0.109 0.068 0.1749 浓度 (g/L) A0 A1 绝对 OD（ A） 0 0.028 0.066 0.038 0.475 0.031 0.151 0.120 0.95 0.03
24、5 0.233 0.198 1.9 0.046 0.338 0.292 3.8 0.071 0.511 0.440 补体 C3 标准曲线y = a + b x ( 2 . 5 ) + c x / l n x + d e ( - x )r 2 = 0 . 9 9 9 8 5 6 4 4 D F A d j r 2 = 0 . 9 9 9 4 2 5 7 7 F i t S t d E r r = 0 . 0 3 5 9 9 4 4 9 6 F s t a t = 2 3 2 1 . 6 2 1 5a = 1 4 . 3 7 8 7 5 2 b = 9 5 . 6 9 0 2 9 8 c = 2
25、5 . 0 6 8 6 5 6 d = - 1 4 . 6 4 8 0 2 9 0 0 . 1 0 . 2 0 . 3 0 . 4绝对 OD 值00 . 511 . 522 . 533 . 54标准浓度（g/L）00 . 511 . 522 . 533 . 54标准浓度（g/L）8 14 1-4 0.041 0.112 0.071 0.1903 15 1-5 0.049 0.117 0.068 0.1749 16 2-1 0.039 0.111 0.072 0.1954 17 2-2 0.036 0.107 0.071 0.1903 18 2-3 0.041 0.110 0.069 0.180
26、1 19 2-4 0.040 0.111 0.071 0.1903 20 2-5 0.040 0.111 0.071 0.1903 2.4.3 补体 C4 测定： 采用免疫浊度法进行测定 操作步骤： （ 1） 样本前处理：取样 8 l 测定。 （ 2） 测定表： 空白 标准 测定 蒸馏水（ l） 8 校 准品（ l） 8 待测样本 （ l） 8 R1（ l） 900 900 900 混匀， 37 度孵育 3-5 分钟，波长 340nm， 0.5cm 光径，水调零测吸光度 A0 R2（ l） 300 300 300 标准曲线的制备： 浓度 (g/L) A0 A1 绝对 OD（ A） 0 0.028 0.079 0.051 0.09 0.031 0.104 0.073 0.18 0.035 0.141 0.106 0.36 0.049 0.195 0.146 0.72 0.08 0.273 0.193
