1、 本科毕业论文 （ 20 届） 石首鱼科线粒体控制区序列结构研究 所在学院 专业班级 农业资源与环境 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目 录 中文摘要 .1 英 文摘要 .2 1. 前言 1 1.1 石首鱼科鱼类 的形态特征及分布 . 1 1.2 石首鱼科线粒体控制区研究现状及意义 2 2. 材料与方法 . 4 2.1 材料 . 4 2.2 方法 . 4 3. 结果和分析 6 3.1 五种石 首鱼科鱼类 线粒体 DNA 控制区分析 6 3.2 种间的遗传与进化分析 .1 6 4. 小结 18 参考文献 .1 9 摘要 本文通过对石首鱼科中白姑鱼（ Argyrosomus ar
2、gentatus）、黄姑鱼（ Nibea albiflora）、小黄鱼 (Pseudosciaena polyactis)、大黄鱼（ Pseudosciaena crocea）、黑腮梅童鱼（ Collichthys niveatus Jordan et Starks）这五种鱼类的线粒体控制区序列结构和遗传变异进行了分析，来探讨 石首鱼科的 控制区结构特征和种间系统发育关系。采用聚合酶链式反应 (PCR)技术对实验的五种鱼类 的 mtDNA 控制区全序列进行了扩增， PCR 产物经纯化后进行序列测定，五种鱼类的控制区序列长度变化较大，范围从 780bp 到 837bp 之间，控制区序列富含 A
3、和 T 碱基， A+T 平均含量达到 62.47%，而 G 碱基相对缺乏，平均仅为 14.88%。这说明控制区在碱基的组成 上具有明显的偏向性。通过 对 mtDNA 控制序列区的结构研究分析，以及同其他鱼类的控制序列区进行比较，发现五种鱼类 mtDNA 控制区包括三个主要识别区域：终止相关序列、中央保守序列区、保守序列区，在大致相同的保守区段： ETAS 结构， CSB-E、 CSB-2、GTGGG-box 结构很保守， 而 CSB-E、 CSB-F、 CSB-1、 CSB-3 种间存在多个或个别碱基的变异，而种内也发现个别碱基的变异。本文还 利用 MEGA 计算出不同个体间的遗传距离；利用
4、DNASP 软件计算出石首鱼科五种鱼的种间多态位点数 (S) 为 399，研究结 果表明，石首鱼科的 D-loop 基因序列种间变异程度较大； 并构建 NJ 系统树，将构建的系统树与之前的石首鱼科形态学分析结果比较发现，系统树构建结果与传统的形态学分类结果完全吻合，这说明了利用控制区序列研究石首鱼类的系统分类是可行的。 关键词 大黄鱼 小黄鱼 白姑鱼 黄姑鱼 黑鳃梅童鱼 mtDNA 控制区结构 Abstract In order to examine the structure of mtDNA control region, we amplified and sequenced comple
5、te control region from 3 individuals of Argyrosomus argentatus and 2 individuals of P. polyactis and a individual of Nibea albiflora,2 individuals of Pseudosciaena crocea,2 individuals of Collichthys niveatus Jordan et Starks,which were all belongs to the Sciaenidae.There was a bias of the content o
6、f A and T in the control region, coming up to 61.92%.The content of nucleotide G was the lowest, at average was only 15.47%. Compared with the control region of other fishes, we identified the three main regions in control region from the five species,including: the termination of related sequences,
7、 the central conserved sequence areas, a conservative sequence areas, similar to the conservative section: the sequence of ETAS,CSB-E,CSB-2,GTGGG-box were very conservative,but CSB-1 and CSB-3 have some variations, and also found some variations in the species. The pairwise genetic distances among f
8、ive species were computed by MEGA, the NJ phylogenetic tree were obtained based on the pairwise genetic distance. As estimated by DNASP, the number of polymorphic sites(S) is 399. As a result, we can see that the variability of the D-loop gene in Sciaenidae have a greater degree.And construct phylog
9、enetic tree,then made it compared with the results of traditional morphological classification in Sciaenidae,we fond that they were consistent.It indicate that the use of control region sequences is useful to classify the Sciaenidae . Keywords Pseudosciaena crocea Pseudosciaena polyactis Argyrosomus
10、 argentatus Nibea albiflora Collichthys niveatus structure of control region 1. 前言 1.1 石首鱼科鱼类的形态特征及分布 石首鱼科（ Sciaenidae）隶属于脊索动物门、硬骨鱼纲、鲈形目。石首鱼科 ( Sciaenidae)鱼类 , 在我国沿海种类颇多 , 共有 13 个属 37 种 , 居世界首位，是中国海洋经济鱼类中产量最大的群类 , 是中国首要的海洋经济鱼类 1，包括常见的大黄鱼、小黄鱼、白姑鱼、鮸鱼和 叫姑鱼等。石首鱼科鱼类体型大多是侧扁而长，吻部圆钝，背鳍长，有一个较深的凹刻将硬棘和软条两个部分分开
11、，侧线明显并且延伸到尾鳍后缘，吻、颊部常会有一些孔洞。体侧扁而长，头大，头部被 鳞 ，颊部有粘液小孔， 耳石 大，石首鱼就因此得名，鱼鳔大且特殊，能够 发声。上颌骨被眼前骨所覆着些许，下颌没有 触须 。或偶尔有 1 条单独短须。下咽骨不结合。腭通常无齿，有的 胸鳍 还具备 腋 鳞 。主要栖息在热带和亚热带底质为沙泥的陆棚区，口小而下位的，多数的食物是沙泥中的无脊椎动物，它们的咽头处有大型的臼状齿可以咬碎带壳的无脊椎动物；口大而斜裂的个体，游泳速度则很快，大多数以追捕小型鱼类或其他游泳性甲壳类为生。主要分布于大西洋两岸、印度洋东非南部、太平洋北部和东南部和印度近海泥沙地质及其河口的邻近水域，除了
12、少数的种类以外，它们大部分都具有显著的种属地理分布局限性 2。 石首鱼科鱼类易聚集成群，一般来说它们的鳃都特别发达，能伸缩振动并且发声，所以被称之为“鼓鱼 (orumfishes)”或“鸣鱼 (Croakers)”，渔民常借此来识别鱼群栖息的水域和范围 21。一些石首鱼类对使用音响来威胁它们特别敏感，渔民容易利用声响驱逐并且围捕它们，它们极易遭受过度捕捞的威胁。近年来，随着沿海地区迅速膨胀的人口，以及飞跃发展的经济，海洋渔业环境日益恶化，鱼类栖息地破碎化加剧以及酷渔滥捕现象突出，导致了石首鱼类种群结构简单化，性早熟和个体小型化，遗传背景单一等严重的种质资源衰退现象。 石首鱼科种类，尤其是大黄鱼
13、、小黄鱼，是中国沿海大陆架最重要的近海经济渔获，出产质量都相当高，其中大黄鱼每的年产量曾经高达 5 万吨左 右 2。 绝大多数石首鱼科鱼类肉味鲜美、经济价值高，是海水养殖业和海洋渔业的重要养殖捕捞对象，如分布于大西洋沿岸水域的红拟石首鱼、波纹细须石首鱼以及点文犬牙石首鱼就是当地重要的海洋经济鱼类。石首科鱼类是中国首要海洋经济鱼类，是中国海洋经济鱼类中产量最大的群类，其中大黄鱼、小黄鱼占据着中国“四大海洋渔业”的“半壁江山”，黄姑鱼 (Nibea albiflora)、白姑鱼(Argyrosomus argentatus） 等都 也 是重要的海洋经济鱼类 ； 大黄鱼 （ Pseudosciaen
14、a crocea） 、双棘原黄姑鱼 (Protonibea diacanthus)、眼斑拟石首鱼 (Sciaenops ocellatus)(引进种 )为目前中国重要的海洋养殖鱼类 3。 小黄鱼 (Pseudosciaena polyactis)隶属于鲈形目、石首鱼科、黄鱼亚科、黄鱼属，俗称金龙、小鲜、花色、大眼、小春色、小黄瓜、古鱼、黄鳞鱼、厚鳞仔，也叫“黄花鱼”或“小黄花”。小黄鱼体形与大黄鱼相似，但比起大黄鱼来它的眼比较小，头比较长，尾柄更短且宽，鳞片比较大，椎骨 28 30 块，耳石比较大，体长有 20 厘米左右、腹部呈金黄色、体背呈灰褐色 4。 大黄鱼（ Pseudosciaena
15、crocea）隶属于鲈形目、石首鱼科、黄鱼亚科、黄鱼属，又名黄鱼、桂花黄鱼、金龙、大王鱼、大黄花鱼、大鲜、 红瓜、黄金龙、大仲、红口、黄瓜鱼。作为传统“四大海产”（带鱼、大黄鱼、小黄鱼、乌贼）之一，是我国近海的主要经济鱼类4。体侧扁，尾柄长为高的 3 倍多左右。头较大 ,下颌稍显突出，有发达粘液腔。具有 5658 个侧线鳞，背鳍起点到侧线间覆鳞 8 9 枚，具有 9 11 条背鳍鳍棘 ,鳍条有 27 38 条。臀鳍有 2 条鳍棘 ,7 10 条鳍条，第 2 鳍棘稍大于或等于眼径。体呈黄褐色，各鳍呈黄色 或灰黄色，腹面呈金黄色，唇呈橘红色。鳔较大，前端圆形，具有 31 33 对侧肢，每一个侧肢的
16、最后分出的前小枝和后小枝长度相等。头颅内有 2 块白色的矢耳石。 26 27 个椎骨 ,个别只有 25 个。分布于朝鲜西海岸及黄海中部以南至琼州海峡以东的中国大陆近海，偶尔在雷州半岛以西也有发现 4-5。大黄鱼在中国沿海可分为 3 个种群 :东海中部、北部群。分布在东海中部至黄海南部，包括如岱衢洋、猫头洋、吕泗洋、洞头洋至福建嵛山岛附近。闽、粤东群。主要分布在南海北部（嵛山岛以南至珠江口）、东海南部和台湾海峡。这一种群又可以分为两大群 体，为北部和南部。粤西群。主要分布在珠江口以西至琼州海峡的南海区。 黑鳃梅童鱼（ Collichthys niveatus Jordan et Starks ）
17、隶属于硬骨鱼纲，鲈形目，石首鱼科，梅童鱼属。又名梅童鱼、梅子鱼、梅子、梅同、丁珠、大头仔、吉头、大头宝、黄皮、蒙头。体侧扁，前宽后细，尾柄细长，头大而钝圆约占全身的三分之一，额头突起，故俗称“大头宝”，口裂大而斜，吻部宽圆，下颌长于上颌，枕骨棘棱显著，有前、后二个马鞍形的棘，粘液腔发达，内侧颏孔和中央颏孔为四方形排列。前鳃盖骨的边缘有细锯齿、鳍条与背 鳍棘部之间有一个凹刻，棘较细弱，尖形尾鳍。体被细、薄、小且易脱落的小圆鳞，体质软、身体上部呈灰褐色或金黄色、腹部呈白色、下腹侧呈金黄色 4-6。梅童鱼是我国近海小型经济鱼类之一，黑鳃梅童鱼的主要分布是在黄渤海河东海北部。渔汛旺季为每年的 4 6月
18、份和 9 10 月份。 白姑鱼（ Argyrosomus argentatus ）硬骨鱼纲，鲈形目，石首鱼科，白姑鱼属。又名白眼鱼、白梅、白姑子、白米子、白鳘子、白花鱼、白果子、画仔鱼。椭圆形体形，体重 200400 克、体长一般为 20 厘米左右、口大，下颌与上颌长度相等，上 颌牙齿细小，排列成带状向后弯曲，下颌牙齿分两行，牙较大、排列稀疏、锥形的为内侧，额部有 6 个小孔，没有颜须，体被栉鳞，鳞片大且疏松，腹部呈灰白色，体侧呈灰褐色，胸鳍及尾鳍的颜色均为淡黄色，呈楔形尾鳍 4-5。分布于太平洋西部和印度洋，我国沿海也有出产，主要渔场有舟山渔场、长江口外海、连云港外海、渤海的辽东湾、莱州湾及
19、鸭绿江口一带 1。浙江、江苏等南方海区的渔期为 5 6 月份，辽宁、山东等北方沿海的渔期则为 8 9 月份。 黄姑鱼（ Nibea albiflora ）隶属于硬骨鱼纲，鲈形目，石首鱼科，黄姑鱼属 。又 名黄姑子、黄鲞、黄婆鸡、铜罗鱼、花蜮鱼、皮蜮、罗鱼、春水鱼。黄姑鱼外形与小黄鱼相似，体重 300 700 克，体长一般为 20 30 厘米。体长而侧扁，吻短钝、略微突出，头钝尖，无犬牙也无骸须，骸部有 5 个小孔，上颌牙细小，下颌牙内行部分较大。两侧呈浅黄色，体背部呈浅灰色，胸、腹及臀鳍的基部带有红色，有斜向前方的多条黑褐色波状细纹，楔形尾鳍4-6。为暖水性中下层鱼，具有发声能力，特别是在生殖
20、盛期（ 6 月下旬至 7 月）。主要是以底栖动物为食。黄姑鱼的越冬场在黄海南部及东海北部外海。在我国东、渤海、黄海及南海均有分布。性 成熟时间为 3 龄， 5 月上旬至 7 月为产卵期，产浮性卵。 1.2 石首鱼科线粒体控制区研究现状及意义 最早关于石首鱼系统发育的研究都只局限于形态分类学方面，主要是计数和解剖，比较形态、特征。我国著名鱼类分类学家朱元鼎根据鳔和耳石等形态进行了较为详细的研究 7。很多石首鱼科鱼类的形态非常相似，采用传统的形态学方法难以界定种、属的界限，如Fishbase 中存在的为数众多的同物异名及属名变更现象 8。 因为环境因素容易影响到形态学特征，比如形态上的趋同就可能是
21、由于相似的生境和行为而导致的。随着逐步进展的现代分子遗传学研 究，利用分子生物学技术在 DNA 物种的遗传本质的水平上进行分子系统学研究，对传统的分类和进化研究提供分子方面的佐证，已经成为一个系统学研究中新的热点 8。 近几年相关学者采用 DNA 分子标记开展了石首鱼科分子系统的研究，蒙子宁等以线粒体 16SrRNA 基因部分序列分析中国近海石首鱼科 6 属 8 个代表种，即大黄鱼、小黄鱼、棘头梅童鱼、黑鳃梅童鱼、鮸鱼、黄姑鱼、白姑鱼、叫姑鱼，分析结果认为叫姑鱼为最为分化的一支，其次为黄姑鱼和白姑鱼，而黄鱼亚科中的大黄鱼和小黄鱼、棘头梅童鱼、黑鳃梅童鱼和鮸鱼分化最晚，支持了传统的形 态分类处理
22、 9。陈泉梅测定了中国东南沿海 16 个种的 16SrRNA序列 , 并结合 GenBank上的部分序列构建了多种系统发育树进行分析 , 支持黄鱼属 ( Larimichthys)、梅童鱼属 ( Collichtys) 和鮸鱼属 (Miichthys)组成黄鱼亚科的传统分类处理 , 并提出了黄鱼属和梅童鱼属归为一属的可能性 8。童馨等将扩增所得浅色黄姑鱼 (Nibea coibor)线粒体 16SrRNA 序列与 GenBank 中石首鱼科 7 属 9 种 16SrRNA 序列进行同源序列比对 , 聚类分析显示黄姑 鱼与浅色黄姑鱼亲缘关系较近 , 与形态分类相符 10。田兰香等通过比较一段 3
23、81bP 细胞色素 b 基因序列，分析了 7 种石首鱼的系统发育关系，发现大黄鱼和棘头梅童鱼聚合，未与放鱼聚类 11。 Lakra 等基于 16SrRNA 和 COI 序列分析了印度 7 种石首鱼的系统发育关系 , 包括 : 居氏牙鱼 ( Otolithes cuvieri )、红牙鱼 (Otolithes ruber )、道氏叫姑鱼 (Johnius dussumieri )、长体叫姑鱼 (Johnius elongatus)、韦氏叫姑鱼 (Johnius weberi )、长吻拟牙鱼 ( Otolithoides biauritus ) 和双棘原始黄姑鱼 (P rotonibea diac
24、anthus)。聚类分析的结果与形态学分类相一致 , 并指出 16SrRNA 和 COI 基因序列可以作为石首鱼科分类的特征分子标记 12。 线粒体 DNA 控制区 (又称 D -loop 环区 , disp lacement loop region)是线粒体 DNA 中的一段非编码区 13,位于 tRNAPro 和 tRNAPhe 基因之间 ,是变化最大、最复杂、最有意义的区域 ,也是线粒体基因组进化 最快的部分，它分为 3 个区段 :终止序列区、中央保守区和保守序列区。其序列的变异不仅有核苷酸之间的替换 ,还有不同长度核苷酸序列的插入、缺失或不同拷贝数的串联重复。随着逐渐推广的测序技术 ,
25、鱼类系统发育和群体遗传常用的研究手段已经用到了鱼类线粒体 DNA 控制区。近年来 ,关于通过分析控制区序列变异来研究鱼类种、属甚至亚科的系统发育关系 ,以及种群的起源、分布、地理分化等方面的工作越来越多。本论文采用线粒体 DNA 控制区研究石首鱼科 5 种鱼类的控制区序列结构和遗传进化关系。 目前有关我国鱼类控制区序列结构的研究报道较多，但尚未 有关石首鱼类鱼类控制区结构的研究报道。邵爱华等暗纹东方鲀线粒体 DNA 控制区结构和系统发育分析，识别了暗纹东方鲀的终止序列区、中央保守区和保守序列区 ,找到了相关的终止序列 (CSB1 ,CSB2 ,CSB3)。发现 CSB1 、 CSB2 序列相对
26、保守 , TAS 与其回文基序可形成稳定的茎环结构 ,成为 H2 链复制延伸时的终止识别位点。同时运用 DNA 分析软件对暗纹东方鲀与 GenBank 中其他 10 多种鱼类的 mtDNA 控制区序列进行比对 ,并选取东方鲀属的 7 种鱼类 mtDNA 控制区序列构建分子系统树，其结果显示控制区基因 较适合于鲀科鱼类中同属不同种的系统发育分析14。 刘海林 等对黄渤海松江鲈鱼线粒体控制区结构与序列多态性分析，共检出单倍型 30 个，多态位点 35 个，简约信息位点 27 个，绝大多数变异集中在 192-342 bp、 594-783 bp 区段，同时识别出了线粒体控制区 5端终止序列区、中央保
27、守区和 3端保守序列区的关键序列。3 个群体总的单倍型多样性为 0.990，核苷酸多样性为 0.00718，丹东 群体核苷酸多样性最高（ 0.009 59） 15。刘焕章以鳑鲏鱼类为例的鱼类线粒体 DNA 控制区的结构和进化，研究了鱼类线粒体 DNA 控制区的结构和进化规律 ,识别了终止序列区、中央保守区和保守序列区 3个区域 ,指出扩展终止相关序列 （ ETAS） 的主体是 TACAT 和它的反向互补序列形成的发夹结构给出了鱼类中若干重要保守序列的普遍形式 16。 龚金波 等对中国近海黑鲷线粒体 DNA控制区序列多态性进行分析，其 结果表明： 72 条序列 T、 C、 A、 G 4 种核苷酸
28、的平均含量分别为 30.8%、 21.8%、 36.3%、 11.0%。共检测到 55 个变异位点 , 其中转换位点 32 个 , 颠换位点 19 个 , 缺失 /颠换位点 1 个 , 插入 /颠换位点 3 个。 72 个个体具有 51 种单倍型( haplotype) , 单倍型比率为 70.8% , 黑鲷线粒体 D-loop 控制区表现出较为丰富的核苷酸多态性 17。 石首鱼类是我国沿海常见的经济种类，在我国水产业中占有重要的位置，目前尚未见其线粒体控制区结构的研究报道，本文拟通过线粒体 DNA 控制区全序列测定 ，分析研究控制区结构以对石首鱼科鱼类的进化作出研究；通过分析五种鱼类的系统发
29、育来检验控制区结构研究是否适合于做科内的不同种间鱼类的研究。 2. 材料与方法 2.1 材料 采集小黄鱼 2 个个体、大黄鱼 2 个个体、白姑鱼 3 个个体、黄姑鱼 1 个个体、黑鳃梅童鱼 2 个个体，样品用酒精固定后运回实验室进行控制区序列分析，详见表 2-1。 表 2-1 实验材料信息 Tab.2-1 The materials of experiment 编号 种名 采样时间 采样地点 样品数 D 大黄鱼 2009.10 舟山近海 2 X 大黄鱼 2009.10 舟山近海 2 B 白姑鱼 2009.10 舟山近海 3 H 黄姑鱼 2009.10 舟山近海 1 M 黑鰓梅童鱼 2009.1
30、0 舟山近海 2 2.2 方法 2.2.1 实验步骤 （一）基因组 DNA 提取 按传统法（酚 /氯仿抽提法）从肌肉或鳍条组织中提取基因组 DNA的详细方法和步骤如下： （ 1） 将样品放入离心管剪碎。加入 600L STE (10mmol/L TriS-Cl， pH 8.0； 0.1mol/L EDTA， pH 8.0； 1%m/v SDS)，于振荡器上震荡均匀。加入 RNase（ 4g/L） 6ul， 终浓度 0.04g/L， 37 烘箱内孵育 1小时。 （ 2） 加 蛋白酶 K（ 20 g/L） 15L,终浓度 0.5 g/l， 颠倒混匀，于 50 烘箱内孵育过夜（ 8小时）。 （ 3）
31、 烘箱内取出后凉至室温：加 600L（ pH 8.0） 平衡酚，温和颠倒混匀至乳浊 （ 30min） 。离心 （ 8000g， 10min） ，小心吸取上清至另一干净离心管。 （ 4） 加等体积苯酚：氯仿：异戊醇 （ 25： 24： 1） ，颠倒混匀 20min，离心 （ 8000g， 10min），小心吸取上清至另一干净离心管。 （ 5） 加等体积氯仿：异戊醇 （ 24： 1） , 颠倒混匀 20min，离心 （ 8000g, 10min） ，小心吸取上清至另一干净离心管。加入等体积的预冷异丙醇，颠倒混匀， -20存放 2小时以上。 （ 6） 离心 （ 10000g, 10min） 产生白色
32、沉淀，轻柔倒去异丙醇，再加入 800L 75%的预冷酒精，缓慢颠倒洗涤 DNA沉淀，再离心 （ 10000g， 10min） ，弃酒精。 （ 7） 重复步骤 6（注：不要将 DNA沉淀倒掉）。 （ 8） 将 DNA 样品置于真空干燥器干燥或烘箱干燥 (视 管中乙醇残留量多少适当调整干燥时间 ) ；加入适量 TE（ 10mM Tris-HCL， 1mM EDTA， pH8.0） 溶解，置 4C 冰箱待用或长期保存于 -20C 待 用 。 （二） PCR 扩增 （ 1）引物 采用引物 CR-s （ 5-CCCACCACTAACTCCCAAAGC-3 ） 和 12S-CR （ 5- GTGCGGAT
33、ACTTGCATGTGT -3） 来 扩增 mtDNA 的控制区全序列 。 (2) PCR 反应体系 每 50uL 反应体系包括 1.25 单位的 Taq DNA 聚合酶；各种反应组分的终浓度为： 200nM的正反向引物； 200M 的每种 dNTP , 10mM Tris pH 8.3, 50mM KCl 和 1.5mM MgCl2。 基因组 DNA 约为 20ng。每组 PCR 均设阴性对照用来检测是否存在污染。 （ 3） PCR 循环参数 PCR 参数包括 95 预变性 5min， 95 变性 1min， 50 退火 1min， 72 度延伸 1min，循环 4 次 ， 然后 72 后延
34、伸 10min。所有 PCR 均在 Eppdorf PCR 仪上完成。 （ 4） PCR 产物的纯化 PCR 产物用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。每个样品取 2L 检测， 对于扩增效果良好的样品进行回收 。回收时用 1.5%的琼脂糖凝胶， 150V 电压电泳分离，用小量胶回收试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）进行回收和纯化 ， 回收操作按华舜试剂盒操作说明进行。 (三 )序列测定 （ 1） 测序反应体系 DNA 模板（纯化后 PCR 产物） 2L（约 20-50ng）；引物 1L ( 3pmol/ ul)； BigDye-DNA sequencing Kit 2L （ PE ABI 公司
35、的 BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer)）。反应总体积 5L。 （ 2） 测序反应程序 96 变性 10 sec， 50 退火 5 sec， 60 度延伸 4min， 循环 25 次 ， 然后 4 保温。所有测序 PCR 均在 PE9700 热循环仪上进行。 (3) 测序反应产物的纯化 a.测序反应结束后，据测序反应体系按照测序反应混合物 ： 75%异丙醇 = 1 的比例加入 75%异丙醇，涡旋混匀，避光静置 20min。 b.2750 g 离心 30min，将 96 孔板倒置于吸水纸上， 50 g 离心 1min。 c
36、.据测序反应体系按照测序反应混合物 ： 75%异丙醇 = 1 ： 8 的比例加入 75%异丙醇，2750 g 离 心 10min。 d.将 96 孔板倒置于吸水纸上， 50 g 离心 1min。 e.加入 25-30L 去离子水溶解，瞬时离心，于 ABI3700 测序仪测序。 2.2.2 数据处理及分析 测序后的序列，与 GenBank 下载的 其他鱼类控制区全 序列一起用 Clustal W 排序， 以tRNAPro 的终点和 tRNAPhe 的起点查找控制区的起点和终点，同时对比已报道的 鲹科 、鳑鮍鱼类、 暗纹东方 鲀 141620的线粒体 DNA 控制区序列，找到 五种 鱼 类 的 C
37、SB-F 和 CSB-1，并以 CSB-F 和 CSB-1 的起点分别作 为终止序列区、中央保守区和保守序列区的分界线。利用 MEGA version 3.0 软件分析序列的碱基组成 和构建系统关系树 。 3.结果与分析 3.1 五种石首鱼科鱼类线粒体 DAN 控制区分析 3.1.1 五种鱼类 mtDNA 控制区全序列特征 控制区经 PCR 扩增、回收、测序， 测得 本实验的 5 种 鱼类个体 mtDNA 控制区全序列 ，5 种鱼类的控制区 序列长度变化 较大，从 780bp 到 837bp 之间。经过 对 五 种鱼类控制区序列比对发现 了 ， 它们之间 存在碱基的插入和缺失。 T、 C、 A 和 G 碱基平均含量分别 30.35%、22.65%、 32.13%、 14.88%， 结果 显示 G 碱基 的含量 相对缺乏， 对于 石首鱼科的五种鱼类，A+T 的 平均 含量（ 62.47%）高于 G+C 的平均 含量 （ 37.53%） （表 3-1），这个现象与其他鱼类的控制区的碱基含量相似。
