1、 本科毕业论文 （ 20 届） 细点圆趾蟹遗传分化研究 所在学院 专业班级 农业资源与环境 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 摘要 细点圆趾蟹（ Ovalipes punctatus） 为梭子蟹科圆趾蟹属。广泛的 分布于从秘鲁、智利、乌拉圭到日本、澳大利亚、新西兰 及南非及中国大陆的福建至黄海南部等地，为广盐广温性海洋性物种，主要栖息于水深 10-65 米的泥质或沙质海底，目前细点圆趾蟹为我国东黄海重要的经济蟹类。 为阐明细点圆趾蟹不同地理群体的遗传结构和遗传变异，本研究通过 AFLP扩增法对其 5 个地理群体进行了扩展，获得了 196 个位点。其中 117 个为多态（ 59.
2、69%）。 5个地理群体的多态位点的比例以及遗传距离从 23.15% 到 53.49%,0.0029 到 0.0138。 AMOVA分析和遗传距离的分析双双揭示了这 5 个群体之间显著的遗传分化现象。这几个群体的聚类树也显示其 存在显著的地理遗传结构。造成细点圆趾蟹种群遗传分化的主要原因是由地理距离导致的。除了地理差距，生物学特征跟不同的盐度也是造成这一物种遗传分化的重要因素。 关键词 细点圆趾蟹 AFLP 遗传结构 Abstract Ovalipes punctatus belongs to the Portuninae， punctatus。 Worldwide distribution:
3、 From Peru, Chile, Uruguay to Japan, Australia, New Zealand and South Africa and china“s fujian to the south of the yellow sea. For light salt wide temperature sex, Marine species.Main habitat at depth 10-65 meters of shale or sandy submarine .In order to clarify the genetic structure and evolutiona
4、l relationship among different geographic Ovalipes punctatus populations, A total of 196 loci were detected by four primer combinations among 95 individuals collected from five locations, 117 of which were polymorphic (59.69%). The proportion of polymorphic loci and Neis genetic distances for five p
5、opulations ranged from 23.15% to 53.49%, and from 0.0029 to 0.0138. AMOVA analysis and pairwise FST revealed significant genetic differentiation among five samples, supporting separate stocks in this species. The UPGMA tree also revealed the significant geographic structure in this species. Pattern
6、of isolation by distance was observed in this species, indicating that significant genetic differentiation among localities of O.punctatus was mainly due to the geographic distance. Besides geographic distance, biological characteristics coupled with different salinity might be another factor, which
7、 influences the genetic structure of this species. Keywords Ovalipes punctatus AFLP genetic structure 1 1 前言 1.1 细点原趾蟹研究进展 细点圆趾蟹（ Ovalipes punctatus）属梭子蟹科（ Portuninae）圆趾蟹属（ Ovalipes） ，俗称沙蟹、台湾蟹、花蟹，在黄海、东海和南海均有分布，盛产于黄东海，国外还分布于澳大利亚、日本等国沿海，属广温广盐性种类。 细点圆趾蟹 群体是目前东黄海区数量最大，资源密度最高的一种中型蟹类 ，具有较高的经济价值。东海细点圆趾蟹自上世
8、纪八十年代中后期开始被开发利用以来 ,现在其经济价值正在逐渐提高 ,冷藏熟蟹肉已成为一出口创汇产品 ,在东海海洋捕捞渔获物中已占有一定地位 1。 细点圆趾蟹是一种中型蟹类 ,在东海周年渔获群体的平均甲长为 54.2mm ,平均甲宽为 69. 2mm ,平均体重为 79. 2g。雄蟹个体平均大于雌蟹 ,最大雄蟹个体甲长可达 95mm ,甲宽 120mm ,体重 410g ,最大雌蟹个体甲长可达 76mm ,甲宽 94mm ,体重 182. 1g。不同性比细点圆趾蟹在各生活阶段的生长情况差异明显。冬季雌、 雄蟹生长较为迟缓或停止 ,而在春季 ,雌蟹处于性腺发 育成熟期 ,个体生长不显著 , 雄蟹则
9、迅速生长 , 平均增长率达 38.7 %。细点圆趾蟹的产卵盛期为 3 - 5 月 ,怀卵量因个体大小而异 ,约在 6. 9 万 75. 8 万粒之间 2-3。东海北部近海是细点圆趾蟹的主要渔场 , 东海北部近海是细点圆趾蟹的产卵场和幼蟹的肥育场 ,中心位置在大沙渔场西南部和长江 口渔场西北部水深 40m 以浅的海域 4。细点圆趾蟹是东海蟹类中群体数量最大，最具有开发潜力的一种蟹类资源， MSY 约为 10.1104 t，最高资源密度达 3375.0kg.km-2 5。目前有关细点细点圆趾蟹的研究主要集中渔业生物学和资源评估及群落结构特征方面 2-6，过去 ,日本学者曾做过 Sagami 湾细点
10、圆趾蟹生物学的研究 ,日本东北部海滩细点圆趾蟹夜间活动情况的研究 7,温度、 季节和活性对细点圆趾蟹呼吸作用的影响 8-9,国内的学者俞存根等和叶泉土等对东海陆架区细点圆趾蟹的种群数量分布及渔业生物学进行了研究 2-4。目前尚未有关细点圆趾蟹种群遗传学的研究报道，现代遗传学观点认为， 物种的 适应能力、生存能力和进化潜力 被认为是 遗传多样性高低密切相关，有机体适应环境变化的必要条件 就是 遗传变异 10。 所以说 ，揭示其遗传多样性水平 和对 物种的遗传结构和遗传分化 的研究 是生 物资源恢复和持续利用的前提和基础。正确认识群体遗传结构对海洋生物的渔业管理至关重要 11。如果不能有效的识别种
11、群，将会引发区域性的过度捕捞并最终导致种群的严重衰减 12。 我国遗传多样性基础研究长期得不到重视，动植物遗传多样性保护和利用得不到足够的理论指导。我国很重视遗传资源的收集，作物种质库、圃保存了极大量的作物及其野生近缘种的材料，但因为缺少群体遗传结构数据，取样保存和管理的效率就很成问题。对珍稀濒危物种的保护也因不了解群体的遗传结构而不能采取有效的措施，而且不能对已有措施的效率进行监测。 目前 ， 有 关细点圆趾蟹的分析已有相关报道 ， 一般都拘泥于生态学上的研究。而关于生物学特性方面则未见报道。尤其是遗传学方面。 AFLP 技术具有快速、灵敏、多态性高和重复性好等特点，已被广泛应用于遗传多样性
12、检测。本研究可采用 AFLP 分子标记技术，对东、黄海 细点圆趾蟹 5 个群体的遗传多样性进行分析，以及了解其遗传背景，并从基因组 DNA 变异水平上探讨 细点圆趾蟹 的群体划分，以期为 蟹群 的资源保护和管理提供理论依据。 而对于渔业管理来说，这些都是非常重要的。掌握细点圆趾蟹的遗传多样性对于中国在这方面的分类是不2 可缺少的。遗传结构的确定提供了 必要的信息来巩固资源回收并有助于圈定和检测数量来进行渔业管理。检测单位的失误可能会导致过度的捕捞，而导致该物种的数量急剧下降。 图 1.1 细点圆趾蟹 Figure 1.1 Picture of Ovalipes punctatus 1.2 遗传
13、多样性及其研究方法 遗传多样性，英文名 genetic diversity。可以有三个定义： 1，种内不同种群之间或同一种群内不同个体的遗传变异总和。 2，由于选择、遗传漂变、基因流动或非随机交配等生物进化相关因子的作用而导致物种内不同隔离群体，或半隔离群体之间等位基因频率变化的积累所造成的群体间遗传结构多样性的现象。 3，地球上所有生物所携带的遗传信息的总和，狭义指种内不同群体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和 13。 地球上所有生物所携带的遗传信息的总和即为遗传多样性。但是通常所指的遗传多样性是指种内的遗传多样性，换言之就是单个物种个体之间或某一个群体间不同个体的遗传变异的全集。种内的
14、遗传多样性是物种以上各水平多样性的最重要的组成部分。一个物 种对人为干扰进行成功反应一个重要因素就是种内的多样性。再者，种群动态、生活史特性、遗传变异及其种群遗传结构等因素影响着一个物种与其和其它物种相互作用的方式（还有环境之间）。进化的趋势也要依靠在种内的遗传变异程度。遗传多样性可以表现在很多方面上，比如分子、细胞、系统等等。 生物多样性的重要组成部分中就有遗传多样性这一项。一方面，任何一个物种都具有其独特的遗传组织形式 和 基因库，物种的多样性 从侧面也就显示出了遗传上的多样性 。另一方面，构成生物群落进而组成生态系统的基本单元 是物种 。生态系统多样性离不开物种的多样性， 也就离不开不同
15、物种所具有的遗传多样性。所以说生态系统和物种的多样性基础就是遗3 传多样性。我们一般谈到生态系统或物种的多样性的时侯就包含了它们各自的遗传多样性。往大的方面讲遗传多样性就是生物所携带遗传信息的总和，但一般所讲的遗传多样性就是指种内的遗传变异或称遗传多样性。遗传变异是生物遗传给后代的遗传物质在体内发生变化的一种变异从而导致生物在不同水平上体现出的遗传多样性。群体水平、个体水平、组织和细胞水平、以及分子水平。一般最直接表达遗传多样性的形式就是通过研究遗传变异性的高低。但是对某一个单一物种来讲，每一个个 体的生活史是非常短暂的，所以不足以构成进化的基本单位，但是个体构成的群体系统在时间上持续状态就可
16、以。这些群体系统在生物界有特定的分布格局和排列。所以遗传多样性即包括遗传变异高低，也包括遗传变异的分布格局。因为遗传变异分布在无性集群之间，因此群体遗传结构上的差异是遗传多样性的一种重要体现。一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力既取决于种内遗传变异的大小，也基于遗传变异的群体结构 14。 1.3 AFLP 法介绍 AFLP（ amplified fragment length polymorphism）技术是一项 新的分子标记技术，由Vos 等 1995 年提出的，它是基于 PCR 技术扩增基因组 DNA 限制性片段，基因组 DNA 先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到 DNA 片段的
17、末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了 RFLP 和 PCR 技术特点，具有 RFLP 技术的可靠性和 PCR 技术的高效性。由于 AFLP 扩增可使某一品种出现特定的 DNA 谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及 DNA 扩增后得到的 DNA 多态性可做为一种分子标记 。 AFLP 可在一次单个反应中检测到大量的片段。以说 AFLP 技术是一种新的而且有很大功能的 DNA 指纹技术 15。 1.3.1 AFLP 反应流程 AFLP 反应程序主要包括模板 DNA 制备，酶切片段扩
18、增及凝胶电泳分析这 3 个基本步骤。各步骤具体的过程有：首先要制备高分子量 (HMW)基因组 DNA，选择 6 个碱基识别位点的限制性内切酶 (通常是 EcoRI 或 PstI 或 SacI)。酶切后的限制性片段在 T4 连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。 DNA 片段的预扩增。在 Taq 聚合酶的作用下，完成 AFLP 的选择性 扩增。 PCR 产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。 1.3.2 AFLP 技术主要特点 1.3.2.1 分析所需 DNA 量少，仅需 0.5 g。也可以用作于线粒体 DNA。从线粒体中得到 R
19、FLP 研究所需的几十到上百 g 的 DNA 是很困难的。 Roseudahl 和 Taylor(1997) 成功地从一种真菌 Mycorrhizal fungi) 的单个孢子中得到 AFLP 标记，而每个单孢子仅产生约 0.1 0.5 gDNA。另外 ,AFLP 反应对模板浓度的变化不敏 感， DNA 浓度在 1000 倍的范围内变化时对反应的影响都不太大 ,所产生的指纹图谱十分相似。 1.3.2.2 可重复性好。 AFLP 分析基于电泳条带的有或无 ,高质量的 DNA 和过量的酶可以克服因DNA 酶切不完全而产生的失真 ,PCR 中较高的退火温度和较长的引物可将扩增中的错误减少到最低限度
20、,因而 AFLP 分析具有很强的可重复性。 Jones 等（ 1997）在欧洲 8 个实验室使用共同的样本，进行严格的实验，将得到的 DNA 图谱进行比较， 172 条谱带中仅一条出错，误差小于0.6% 。 1.3.2.3 多态性强。 AFLP 分 析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目 ,来调节扩增的条带数 ,具有较强的多态分辨能力。设计不同的人工接头就会相应地产生不同的 4 AFLP 引物，引物 3端的选择性碱基数目可以是 2+2, 2+3 也可以是 3+3，这些碱基的组成也是多种多样的。由于 AFLP 引物设计的巧妙与搭配的灵活，使得 AFLP 能产生的标记数目是无限的。迄今
21、为止，每个 AFLP 反应能检出多态片段之多，信息量之大，效率之高是其它任何一种分子标记所无法比拟的。 1.3.2.4 分辨率高。 AFLP 扩增片段短，适合于变性序列凝胶上电 泳分离，因此片段多态性检出率高，而 RFLP 片段相对较大，内部多态性往往被掩盖。 1.3.2.5 不需要 Southern 杂交，无放射性危害，且不需要预先知道被分析基因组 DNA 的序列信息，是一种半随机的 PCR。 1.3.2.6 样品适用性广。 AFLP 技术适用于任何来源和各种复杂度的 DNA ,如不需要预知这些DNA 的序列特征。用同样一套限制酶、接头和引物 ,可对各种生物的 DNA 进行分子遗传标记研究。
22、 1.3.2.7 稳定的遗传性 AFLP 标记在后代中的遗传和分离中符合 Mendel 式遗传规律， 种群中的 AFLP 标记位点遵循 Hardy Weinberg 平衡总之，在技术特点上， AFLP 实际上是 RAPD 和 RFLP 相结合的一种产物。它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危害和 RAPD 稳定性差，标记呈现隐性遗传的缺点；同时又兼有二者之长。近几年来，人们不断将这一技术完善、发展，使得 AFLP 迅速成为迄今为止最有效的分子标记 16-17。 1.3.3AFLP 技术的应用 1.3.3.1 遗 传 多样性及系统进化学研究 遗传多样性是生物多样性的基础，是评价自然生物资源的
23、重要依据，同时也是合理利 用自然生物资源、种质资源开发和保护、生物遗传育种及改良的基础。研究各种生物的遗传多样性，首先要找到具有数量多、随机分布、稳定遗传、多态性丰富的分子标记。 AFLP 正是符合这一要求而广泛用于水生动物遗传多样性、系统进化学等研究。邱涛等和 Lu 等分别就四种沼虾 (罗氏沼虾、海南沼虾、日本沼虾及粗糙沼虾 )和十足目两个属生物 (包括日本绒鳌蟹、中华绒鳌蟹及上述四种沼虾 )的谱系关系进行了鉴定和分析 26。 1.3.3.2 亲子代遗传关系研究 由于自然生态环境的质量下降及人类对水产品需求的增长，应用各种遗传方法改造生物的遗 传结构、培育优良品种已成为人们研究的热点。人工雌
24、核发育和人工诱导雄核发育可用于性别控制、快速建立家系，从而在多种经济水生动物中的相关工作已广泛展开。利用杂交优势进行育种也是物种遗传改良的一个重要方面。但仅从形态学、细胞学等角度有时很难区分雌核发育、雄核发育及杂交种的亲子代遗传变异等关系，而作为高信息量的 AFLP 分子标记技术在此有广泛的应用空间。 1.3.3.3 遗传图谱构建 AFLP 标记由于具有数量多、随机分布、稳定遗传且遵从孟德尔分离的特点，是一种方便、可靠、高效的多态分子标记，广泛应用于各种经济种类的遗传 图谱构建。 1.3.3.4 功能基因相关分子标记及基因的筛选 斑马鱼、虹鳟等作为模式动物，从中筛选与生长、发育、抗逆等相关的功
25、能基因和分子标记的工作已广泛展开。另一方面，频发的疾病引发的水产养殖经济动物减产而造成的巨大损失，使加快主要经济动物品种遗传改良变得更加紧迫，筛选与抗病及生长相关的分子标记及主效基因已成为当务之急。 Rubinstein 等利用 AFLP 技术通过对斑马鱼突变型 Cyclops 和野生型 Cyclops cDNA 的多态性分析，建立了表达依赖于 cyc 信号基因的差异显示方法，并在斑5 马鱼中发现了两个新 基因 crestin 和 calreticulin，后者是一种钙结合蛋白的同源体 27。 AFLP 技术具有快速、灵敏、多态性高和重复性好等特点，已被广泛应用于遗传多样性检测。本研究可采用
26、AFLP 分子标记技术，对东、黄海细点圆趾蟹 5 个群体的遗传多样性进行分析，以及了解其遗传背景，并从基因组 DNA 变异水平上探讨细点圆趾蟹的群体划分，以期为细点圆趾蟹的资源保护和管理提供理论依据。 1.4 遗传多样性和分化的研究具有重要实际的意义 首先，物种的遗传多样性大小是长期进化 而来的 ，是其发展进化 与 生存适应的 必要条件 。一个种群或 物种遗传多样性越高或遗传变异越 多样 ， 适应 环境变化能力就越强 ，有利于其 开拓新的环境 并 扩展其分布范围 。 理论推导和大量实验证据表明，生物种群中遗传变异的大小与其进化速率成正比。因此对遗传多样性的研究可以揭示物种或居群的进化历史（起源
27、的时间、地点、方式），也能为进一步分析其进化潜力和未来的命运提供重要的资料，尤其有助于物种稀有或濒危原因及过程的探讨。其次，遗传多样性是保护生物学研究的核心之一，不了解种内遗传变异的大小时空分布及其与环境条件的关系，我们就无法采取科学有效的措施来保护人类赖以生存的遗传资源基因，来挽救濒 于绝灭的物种，保护受到威胁的物种。对于我们所不了解的对象，我们是无法保护的。对珍稀濒危物种保护方针和措施的制定，如采样策略迁地或就地保护的选样等等都有赖于我们对物种遗传多样性的认识。古老的分类学或系统学 几个世纪以 来都在 持续 地探索和解释生物界的多样性，并 尝试着 建立个能反映系统发育关系的阶层系统，以及建
28、立一个 实用而便利 的资料（信息）存取或查寻系统。 所做的这些研究无疑有助于人们更清楚地认识生物多样性的起源和进化，尤其能加深人们对微观进化的认识18。就本研究中的细点圆趾蟹来说，研究东海黄海蟹群间遗传多样性及分化， 有利于制定有效的捕捞政策及相应的在资源保护上的措施。使中国东海及黄海的细点圆趾蟹渔业可持续发展。 1.5 细点圆趾蟹遗传分化研究意义 细 点圆趾蟹是东海区重要的经济蟹类，其具有较长的幼体浮游期，以往的研究主要集中在渔业生物学方面。而且没有有关细点圆趾蟹种群遗传学的研究。种群的划分而对于渔业管理来说，这些都是非常重要的。正确认识群体遗传结构对经济海洋生物的渔业管理至关重要。如果不能
29、有效的识别种群 11，将会引发区域性的过度捕捞并最终导致种群的严重衰减 12。 AFLP法兼有 RFLP 的可重复性以及 RAPD 的简便性 。 AFLP 检测法已经被用来检测多种的蟹类种群遗传学研究。 AFLP 法的优势就在于可以产生大量的多态位点，并且重复性好。特别适合不知道遗传背景的种类开展遗传多样性研究。 对任何物种而言，成功的保育计划和有效的政策管理依靠于确定种间和种内的遗传差异的水平和种间 发展策略来保持种群的遗传多样 性。细点圆趾蟹是非常重要的一种渔业蟹种，确定它是否是一个单一种群，还是有其他的重要种群将是对其管理和保护的一个重大贡献。本研究采用 AFLP 标记东黄海区细点圆趾蟹
30、的遗传多样性和遗传结构，探讨其不同地理群体间的遗传分化，阐明现代海洋环 境因子对细点圆趾蟹种群的影响，以期为其资源保护 和跨国管理提供理论依据。 2 材料和方法 2.1样品收集 6 2009 年 1 月到 3 月，在中国的东海和黄海的 5 个地点采集了 95 个细点圆趾蟹。（图 2.1，表 2.1）所有的蟹被冷冻并运回实验室。取肌肉样本于 95%的乙醇中，用于 DNA 的提取。 表 2.1 细点圆趾蟹样本的采集及遗传多样性结果参数 Table 2.1 Sample information and parameters of genetic diversity for populations o
31、f Ovalipes punctatus 群体 个体数 采样时间 经纬度 总扩增位点数 总多态位点数 多态位点比例 Nei s 遗传多样性 A 20 09， 3 124.50oE， 32.50oN 172 92 53.49% 0.0631 B 13 09， 3 121.00oE， 26.00oN 120 35 29.17% 0.0341 C 24 09， 3 122.50oE， 32.00oN 157 75 47.77% 0.0454 D E 14 24 09， 3 09， 1 126.50oE， 32.00oN 126.00oE， 31.50oN 108 144 25 63 23.15% 4
32、3.75% 0.0217 0.0405 图 2.1 细点圆趾蟹样本的采集地点 Figure2.1 Sample sites for Ovalipes punctatus 2.2 基因组 DNA 的提取和 AFLP 图谱的构建 按传统法（酚 /氯仿抽提法）从肌肉中提取基因组 DNA。 参照 Vos等（ 1995）的方法构建 AFLP图谱，具体步骤如下： 取基因组 DNA 样品 100ng， Trul （ 10u/ l） 0.1 L， 10 Y+/Tango buffer（ 反应缓冲液 ） 4.0 L， 再加超纯水至反应总体积 20 L。于 PCR 仪中 65酶切 2h，再加入 EcoR I（ 1
33、0u/ l） 0.1 L 和超纯水 1.9 L， 37酶切 2h。于 75中放置 15min，使酶失活， 4保存备用。 7 连接反应体系包括酶切反应产物 5 L、 10mmol ATP 0.5 L、 EcoR I adapter（ 5umol）0.5 L、 Mse I adapter（ 50umol） 0.5 L、 T4 连接酶 （ 10u/ L） 0.1 L， 加超纯水至反应总体积 20 L； 于 37 下反应 4h。 4下保存备用。 预扩增反应体系包括连接产物 1 L、 10 PCR buffer plus Mg2+ 2 L、 dNTP（ 10mmol）0.4 L、 EcoRI pream
34、p primer（ 10 umol） 0.4 L、 MseI preamp primer（ 10 umol） 0.4l、 Taq DNA 聚合酶（ 5u/ L） 0.1 L。用 Eppendoff 公司生产的 PCR 自动反应循环仪进行扩增。 预扩增 PCR 反应条件：首先 94 2min；接着 94 30s， 56 60s， 72 60s，共 20 个循环； 4下保持。根据 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测预扩增效果。该产物用超纯水稀释 10 倍，置 4下保存备用。 表 2.2 AFLP 分析的接头和引物序列 Table2.2 Adaptor and primer sequences used i
35、n AFLP analysis Primer Sequence Adapters EcoRI-adapter 5 -CTCGTAGACTGCGTACC-3 5 -AATTGGTACGCAGTCTAC-3 MseI-adapter 5 -GACGTGAGTCCTGAG-3 5 -TACTCAGGACTCAT-3 Pre-amplification primer EcoRI 5 -GACTGCGTACCAATTC-3 MseI 5 -GATGAGTCCTGAGTAA-3 Selective amplification primer E-ACA/M-CAC 5 -GACTGCGTACCAATTCAC
36、A-3 5 -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3 E-AAC/M-CAC 5 -GACTGCGTACCAATTCAAC-3 5 -GATGAGTCCTGAGTAACTC-3 E-AAC/M-CAG 5 -GACTGCGTACCAATTCAAC-3 5 -GATGAGTCCTGAGTAACAG-3 E-AGA/M-CAG 5 -GACTGCGTACCAATTCAGA-3 5 -GATGAGTCCTGAGTAACAG-3 选择性扩增反应 ： 取 5 L 预扩增稀释混合液 ， 10 PCR buffer plus Mg2+ 2 L， EcoRI引物 （ 10umol） 0.4 L， MseI
37、 引物 （ 10umol） 0.4 L， Taq DNA 聚合酶 0.2 L， 加超纯水至总体积为 20 L。 PCR 反应条件：先 94 2min，再 94 30s， 65 30s，（每循环退火温度降低 1），72 60s， 10 个循环后变为： 94 30s， 56 30s， 72 60s， 26 个循环。反应结束后用 1.5%琼脂糖电泳检测选择性扩增效果。扩增反应产物 4保存备用。 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染：采用 Bio-rad 公司的 Sequi-Gen GT 垂直电泳系统， 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶、 1 TBE 缓冲液进行电泳。在扩增产物中，加入 5 L 上样缓冲液，在95下变性 3min，取出后立即置于冰上备用。在 70W 恒功率条件下预电泳 40min 后取 2 L 产
